农杆菌花序侵染的方法

我们一般采用：

花序浸染法转化拟南芥

（1）种植：

选择吸水性好，土质松软的至石配合营养土（1：）作为拟南芥种植土壤。

直径9cm 的花盆，每盆播种20-30颗。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。

（2）去顶：

在拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。

（3）配制浸染液：

在5%的蔗糖溶液中重悬农杆菌使OD=

0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。100-200ml 浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆（9cm）植株。在浸染之前加入表面活性剂至浓度

0.05%（500ul/L），如果产生表面活性剂的毒性现象（浸过部分发黄或死亡），将浓度降至

0.02%。戚老师实验室用十万分之一（50ul/L）

（4）浸染：

将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在农杆菌悬浮液中2-3s,同时轻轻旋

转。

（5）暗培养：

将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。

6）浸染后培养：

隔天浇水，保证水分充足即可。

（7）种子收集：

种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。

（8）转基因种子筛选：

在含有Kan抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含kan 10-50⑷/ml的

0.5 x M培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出 4 片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出 2 片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10 天以后死亡。

（9）转基因植株转土栽培。转基因种子在MS+kan平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。

2.5 转基因拟南芥纯合子筛选

由于农杆菌介导的花序浸染法只能将目标片段整合到一条DNA单链上，为后续生理性状实验需要，将T0代转基因种子培育至T2代，利用抗性筛选得到纯合子。根据杂合子在发生性状分离时会产生野生型后代，而野生型种子不能在

MS+Kanr （50血/ml ）平板上正常生长，进行转基因植株纯合子的筛选。