分子生物学课件

总论

1.从哪些方面进行疾病相关基因的功能研究？（人卫版分生P286）在确定了相关基因时可以通过以下方法对其功能进行研究：

A转基因技术(转基因动物，稳定转染细胞)

B基因敲除技术

C基因沉默技术（反义技术，RNA干扰）

2举例说明人的基因组成或结构变化引起的相关疾病

(特定某个基因名称、定位、大小及组成等基本特征。因组成或结构变化的过程、结果和表型)。

疾病：严重复合免疫缺陷病（XL-SCID）

名称：受体γ链(γc)基因突变引起。

定位：编码基因位于Xq12～13.1

组成：γc基因8个外显子的135种基因突变，其中5个突变热点;最常见的突变类型是单个碱基置换(错义突变和无义突变)，其次为剪接部位突变、缺失和插入突变

结果：该基因编码的产物为白介素（如IL-4，IL-21）。这些白介素和受体涉及了很多T,B细胞的分化和常熟。当基因突变时，无功能蛋白质产物生成，导致白介素信号的广泛缺失，进而引起免疫系统功能的丧失。

RNAi

1.siRNA:是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC

的主要成员，激发与之互补的目标mRNA的沉默

2.MiRNA:是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等

3.Dicer:RNase III家族成员之一，可特异识别dsRNA，依赖ATP逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的dsRNA(或pri-miRNA),将RNA降解为3’端有2个碱基突出的19-23bp的dsRNAs(siRNAs)

4.RISC:一种RNA-蛋白质复合物，通过与目标mRNA完全或者部分的互补配对来实施切割或者翻译抑制功能。siRNA组装siRISC，miRNA组装miRISC。RISCs包括两种类型：切割型和不切割型, 这由RISC当中的AGO蛋白决定

5.PTGS:Post-transcriptional Gene Silencing: (PTGS, 转录后基因沉默)在基因转录后的水平上通过对靶ＲＮＡ进行特异性降解而使其失活。

6.Guo Su 的实验说明了：她的实验观察到：sense or antisense RNA导入C. Elegant worm都获得了特定基因的沉默。说明起到直接作用的并不是sense or antisense RNA。

7.RNAi的作用机制：病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。The central mechanisms of siRNA interference. The Dicer protein cleaves long dsRNAs and produces siRNAs.

The RISC gets activated by siRNA and cleaves the target mRNA

凋亡

1.定义：细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序死亡。

2.途径：细胞凋亡信号转导的两大途径

A：由死亡受体(Fas、TNFR）介导的外源途径。在这条途径中，启始caspase-8首先被激活

B:线粒体介导的内源途径。在这条途径中，启始caspase-9首先被激活。

3.Bcl-2家族的分类和结构特征

Bcl-2家族成员分为两类

A：抗细胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-xL、Al、Bcl-w、Mcl-1。在这类分子中，都有Bcl-2同源区1-4 (Bcl-2 homology domains，BH1-BH4)的结构

B：促进细胞凋亡。在这类分子中，又分为两个亚族：

①Bax亚族，如Bax、Bak、Bok，有BH1、BH2和BH3的结构；

②BH3-only亚族，如Bik、Bad、Bid、Bim，只有BH3的结构。4：P53基因在细胞DNA损伤中的作用

p53并非为所有细胞的凋亡过程所必需，但对DNA损伤而诱发的细胞凋亡却是必不可少的。

p53的两大功能：

A：使细胞在G1期停滞。当DNA损伤后，p53首先诱导细胞进入G1期，抑制细胞增殖，直至损伤的DNA修复。

B:一旦DNA不能被修复，p53就会活化那些诱导细胞凋亡的基因转录，使细胞发生凋亡。

干细胞

1.干细胞应具备哪些生物学特点？

A：自我更新能力：干细胞可不对称分裂为1个子代干细胞和1个功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。但是干细胞的分裂实际是相对不对称的，干细胞在其发育期间也能够对称性地分裂以扩增它们的数量。

B：高度增殖能力

因干细胞数量不多，所以其高度增殖的生物学特性有其重要意义：

体内：如造血干细胞通过高度扩增，可补充由于细胞正常衰老死亡而丧失的血细胞。

体外：体外扩增干细胞是干细胞研究和应用的前提和关键。

因此，高度扩增的生物学特性不但对干细胞的研究和应用有重要作用，而且对机体正常功能的维持也起着重要作用。

C：多能性或全能性－分化：干细胞具有分化为多种细胞类型的潜能，但不同干细胞的分化潜能有所不同。（胚胎干细胞：全能性

神经干细胞：多能性）

2.干细胞的不对称分裂：一种细胞分裂的方式，就是指分裂的方式是不对称性质的，母细胞产生的两个子细胞的类型各不相同（产生一个子代干细胞和一个功能细胞）。

细胞分化

1.定义：指个体发育过程中，细胞后代之间在形态结构、生化组成和功能上向专一性和特异性方向发展，逐渐产生稳定性差异的过程。

2细胞分化被称为基因选择性表达的原因：细胞分化的实质是基因选择性表达，即奢侈基因的表达使细胞合成特异蛋白质。（持家基因：指导合成细胞维持生存所必须的基础蛋白质的基因。如合成组蛋白、膜蛋白、核糖体蛋白、细胞周期蛋白等的基因。奢侈基因：指导合成细胞分化的各种特异蛋白质的基因。如合成肌动蛋白和肌球蛋白、角

蛋白、血红蛋白等的基因。)基因表达的调节主要表现在转录水平和翻译水平上，其中以转录水平的调节更为重要。

A：转录水平的调节：（1）DNA甲基化：DNA甲基化与基因转录抑制密切相关（2）活化染色质结构的特异调控区：Dnasel 敏感位点常是转录因子的结合部位，与基因转录活性密切相关（3）各种调控元件调节转录调节转录的各种调控原件包括顺式调控原件启动子、增强子、沉默子等和参与启动子、增强子、沉默子等DNA结合的反式调控因子（各种转录因子）。（4）核内RNA（nRNA）及选择加工转录后形成的核转录产物为核RNAnRNA）即不均一RNA(hnRNA)，长度和种类都大于mRNA，仅有10％～20％的nRNA进入细胞质，成为成熟的mRNA。还有5’戴帽和3’加尾的修饰方也是细胞分化的重要机制（5）专一mRNA的降解mRNA的专一性降解也是转录后调节的一条途径。例如哺乳动物成红细胞的分化过程中，早期细胞合成若干种mRNA，但最后几次细胞分裂时，只有珠蛋白mRNA被保留下来。

B：翻译水平的调节与转录水平的调节不同，细胞不具备专门翻译某种mRNA而不翻译其它mRNA的调节机制。翻译调控通常是通过调节细胞的整体翻译水平来实现的。

3.细胞全能性定义：(totipotency)单个细胞在一定条件下可分化发育为完整个体的分化潜能称为全能性。

4.证明分化成熟体细胞的全能性：多利羊的产生，是由分化成熟的乳腺细胞核与去核卵融合发育来的，含有乳腺细胞的遗传物质。

基因工程(上游研究）

1.定义：将不同生物体的核酸分子在体外经过酶切、连接，构建成重组的核酸分子，再把它导入受体细胞内，使外源基因在受体细胞中表达

2.步骤：

1）获取基因：从复杂的生物有机体基因中，经过酶切消化或PCR 扩增等方法，分离出带有目的基因的DNA片段。

2）克隆载体构建：在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制，并带有选择标记的载体分子上，形成重组DNA 分子－－克隆载体。

3）克隆载体转化：将克隆载体转入受体细胞，并与之一起增殖。4）克隆载体筛选：从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了克隆载体的受体细胞克隆。

5）克隆载体鉴定：从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已经得到扩增的目的基因，并做酶切、序列分析等鉴定。

6）表达载体构建和表达：将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。

2.限制性核酸内切酶定义;称为限制性内切酶或限制酶。是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割双链DNA 的酶。(如：Bam H，EcoR I和EcoR II，Hind II和Hind III)

3.质粒

A定义：染色体外，能独立复制，能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子

B理想质粒的条件：

1）.质粒较小（3—5Kb) ：小质粒通常拷贝数较多，外源DNA容量较大, 容易转化，容易分离，不易断裂，容易鉴定

2）带选择标记：对抗菌素的抗性，Amp, Tet, Kana, Neo , 互补

3）有单一限制性酶切位点：(多克隆位点MCS ）单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入。多个不同的单一限制性酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。

4）具有复制起始点（Ori)：质粒DNA增殖所必不可少的结构。5）作为表达载体，还要有启动子和终止子序列

6）有一定的非必要区：插入外源DNA不影响复制

7）拷贝数高，抗剪切力强

基因的表达及蛋白质纯化

1.试述外源基因在原核体系中的表达需要具备的条件，及影响外源基因表达的因素

A.外源基因应具备的条件：

1）编码区不含插入序列，（mRNA-cDNA）

2）位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；

3）含起始密码子（AUG）、终止密码子（TAA）；

4）转录出的mRNA必须有SD序列，调整SD序列与第一个AUG间的距离（因为会对转译效率有影响）；

5）增强产物的稳定性（如：融合蛋白、信号肽）；

6）选择系统偏好的简并密码。

B.影响因素：

1)启动子的强弱（主要因素）

2)基因的剂量

3)RNA转译效率（SD互补、AUG-SD距离及序列、AUG前后核苷酸序列的适宜性）

4)密码子

5)表达产物的大小

6)产物的稳定性

2.蛋白质的分离纯化技术依据蛋白质的性质分为哪几大类，请列举其中的一类，谈谈它的原理及应用。

A分类：

溶解度差别：硫酸铵沉淀法

分子大小不同：透析；超过滤；离心；凝胶过滤（分子筛层析）

蛋白质分子带电性质不同：电泳；离子交换层析

蛋白质吸附性质不同：吸附柱层析；吸附薄层层析

蛋白质的特异性配体：亲和层析

B举例

离子交换层析

a原理：离子交换以一种不溶的惰性物质为支持物，通过化学反应（酯化、氧化和醚化等）共价引入带电基团。引入正电基团的离子交换剂

为阴离子交换剂；而引入负电基团的离子交换剂为阳离子交换剂。(pHpI -,阴离子交换剂)

b支持物:树脂、纤维素、葡聚糖凝胶

C应用：分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子

组织工程及其在医学中的应用

1.组织工程的三个重要组成部分以及它们的作用是什么？

1)生物材料

性质：良好的生物相容性和生物降解性、三维多孔立体结构、可加工性和一定的机械强度、良好的材料-细胞界面、良好的消毒性能

分类：天然材料（胶原、糖胺聚糖、甲壳素、海藻酸盐、蚕丝等）人工合成材料（聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）等）

作用：形成细胞攀附生长的支架

2）种子细胞

分类：干细胞（胚胎干细胞;成体干细胞）

组织来源的细胞（）

3）构建环境（体内构建，体外构建，体外+体内构建）

2.种子细胞类型及其各自的优点是什么？

胚胎干细胞：优点：全能性缺点：安全性？伦理性？；

成体干细胞：优点：获取相对容易；源于患者自身的成体干细胞避免了移植排斥反应和使用免疫抑制剂；理论上，成体干细胞致瘤风险低，而且所受伦理学争议较少；具有多向分化潜能。缺点：无法迅速大量

增殖，受成体细胞组织制约

组织来源的细胞:优点：构建出的组织在形态、结构和功能上与正常组织比较接近缺点：体外培养易老化、不易扩增，会造成供区部位的组织缺损和功能障碍

3.举例说明组织工程技术可用于那些组织修复（要求简述构建过程）？

用途：烧伤皮肤的修复（Integra、Dermagraft、Apligraf、安体肤等）过程：Dermagraft:

新生儿包皮成纤维细胞+PLA/PGA

↓培养14-17天

成纤维细胞大量增殖并分泌胶原、纤维黏连蛋白、蛋白聚糖、生长因子等

↓

形成由成纤维细胞、ECM和可降解生物材料构成的人工真皮

肿瘤的基因诊断和基因治疗

1试述癌基因与抑癌基因在正常细胞和肿瘤细胞中的不同生物学特性。

癌基因：具有转化潜能，在一定条件下导致其编码区或

调节区域遗传性状发生改变的基因。

在细胞内控制细胞生长和分化。

结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变。

正常细胞中的作用：细胞的必须基因，对维持细胞正常生理功能，

调节细胞生长与增生有重要的作用

癌细胞：突变---时间，空间，质，量的改变---癌症发生

抑癌基因：编码细胞周期调控的抑制蛋白，调控正常细胞生长。

当突变时，细胞表达无活性抑制蛋白，增殖失控而致

肿瘤

数量有限，作用具有普遍性的作用。

正常细胞：抑癌基因的产物起着抑制细胞增殖信号转导，负性调节细胞周期，从而抑制细胞增殖

癌细胞：当突变时，细胞表达无活性抑制蛋白，增殖失控而致

肿瘤

1.什么是主要的原癌基因的激活机制? 并举例说明?

肿瘤的发生是多因素、多阶段、多步骤、累积渐进的过程。细胞癌变是多步骤、多重异常变化的复杂过程，在肿瘤的发生发展的各阶段，至少需要两个或多个不同癌基因的激活和抑癌基因的失活，才能引起细胞癌变。

2.试述基因诊断的分子生物学方法,并简述其原理。

对疾病相关连锁标志的遗传分析

1）RFLP连锁分析：原理：利用某些遗传性疾病中，疾病基因与同一条染色体上的某一RFLP之间的一种特殊关系，即连锁不平衡而进行的一种间接分析

2）基于STR的微卫星分析:原理：不同个体拥有不同重复次数的STR。但拷贝数的变异并不改变STR及两翼的碱基组成，所以只要

核心序列一致，就可以利用相同的限制性内切酶将不同拷贝数的STR 从不同个体的基因组DNA中切割下来，而不同个体将形成不同长度的DNA片段。因此，STR也可用Southern blotting 进行连锁分析3）基于SNP的单倍型分析：原理：SNP的表现形式不是DNA的长度变化，而是序列的变异为检测信息。实质是检测基因序列的点突变对疾病基因结构异常的直接诊断

基因缺失或插入的诊断

1）Southern blotting:原理：一条已知的的核酸探针分子在一定条件下与结合在固定支持物上的具有一定同源性的DNA分子可以完全或部分退火形成双链，通过检测探针信号，就可以对待检测DNA进行定性或半定量分析

2）PCR：以扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5'末端和3'末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板延伸至完成新的DNA合成。

点突变的诊断

1）ASO（等位基因特异性寡核苷酸分子杂交）：根据点突变位点上下游核苷酸探针序列，人工合成大约19个核苷酸长度的片段，突变的碱基位于当中，经放射性核素或地高辛标记后可作为探针，在严格杂交条件下，即使只有一个碱基不配对也不会形成杂交点，只有该点突变的DNA样本才出现杂交点

2）反向点杂交RDB：改良的ASO技术,当遗传病为多种点突变引起，且频率分散时，为可以同时检测多种突变，将针对各种突变和正常序

列的ASO探针固定在杂交膜上，而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交。DNA芯片实质上为一种RDB 3）变性高效相色谱DHPLC：

STR序列的诊断：STR不仅是一种连锁分析的遗传标志，而且其拷贝数的增加也是某些疾病发生的原因，称动态突变。对于这类由STR 扩增导致的遗传疾病，可以采用PCR直接扩增技术来诊断基于STR 的DNA片段的多态性

4.如何看待基因治疗的安全性及社会伦理问题?

1）导入基因的稳定高效表达外源基因转移入病人体内细胞表达，首先与转移方法有关。

2）导入基因的安全性基因治疗的安全性应确保不因导入外源目的基因而产生新的有害遗传变异，这是因为采用反转录病毒载体而引起的问题。

3）基因治疗与社会伦理道德体细胞基因治疗是符合伦理道德的，但试图纠正生殖细胞遗传缺陷或通过遗传工程手段来改变正常人的遗传特征则是引起争议的领域。

4）从历史上看，科学的发明创造对人类生存发展的影响极其深刻，故遗传学发展到今天，可以进行基因治疗，应该说是符合伦理道德的。重要的问题是取得社会的理解配合。首先是病人及其亲属的配合。因此，宣传基因治疗的科学性与安全性以及人类健康的重要性，以提高人们的认识，同时建立并完善医疗法制与措施也是必要的。

5）为安全计，在临床试验之前，必须在动物研究中达到三项基本要

求：①外源的基因能导入靶细胞并维持足够长期有效；②该基因要以足够的水平在细胞中表达；③该基因应对细胞无害。

5.To compare viral oncogene and proto-oncogene.

病毒癌基因细胞癌基因

结构无内含子有内含子

功能表达产物有较强的细

胞转化活性可正向调节细胞增殖（如分泌GF）

细胞信号转导

1.什么是信号转导？其基本途径如何？

信号转导定义：细胞特异识别外来信号分子，并转化为细胞可识别的信号，经系列级联反应，最终引起特异生物学效应的过程，称为信号转导(signal transduction)。基本途径：膜受体介导的信号转导&胞介导的信号转导

2.肝细胞对胰高血糖素或肾上腺素的反应

CAMP反应元件结合

蛋白

CAMP反应元

件

基因打靶

1.转基因动物的制备应包括那些环节？

A.胚胎干细胞的获得和培养

B.构建打靶载体

C.将载体导入ES细胞

D重组ES细胞的筛选

E嵌合体小鼠的制备

F基因敲除小鼠的建立

2.制备转基因动物可能会遇到哪些问题？可用的解决方法？

问题:生产效率低

基因整合效率不高

生产周期长，成本高

转基因动物死亡率高

常出现不育导致转基因难以传代

无法大规模生产

解决方法：转基因克隆动物

转基因克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合。它以转基因细胞为核供体，采用体细胞核移植技术产生转基因克隆动物，实现种质创新。

优势：生产效率高；周期短，成本低；可以决定后代性别

表观遗传学

1.什么是表观遗传学？它主要研究什么内容？

定义：基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。不依赖于DNA序列的遗传现象研究内容：DNA甲基化修饰：基因选择性转录表达的调控

非编码RNA的调控作用：基因转录后的调控

组蛋白修饰：蛋白质的翻译后修饰

2.什么是甲基化，在调控基因表达过程中起什么作用？

定义：在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基基团的化学修饰现象。通常发生在5′胞嘧啶位置上作用：具有调节基因表达和保护DNA该位点不受特定限制酶降解的作用。

3.什么是基因印记？它的主要特征是什么？

定义：由于源自某一亲本的等位基因或它所在染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。在基因组中的这类现象就是基因组印记。

特征：1）每一个印记基因簇由一个印记控制元件(imprint control element, ICE) 所调控

2.）也称为印记控制区域(imprint control region, ICR)或者印记中心(imprinting centre, IC)

3）绝大多数都有CpGislands，能够发生DNA甲基化

4）在CpGislands内或附近通常有成簇的、有向的重复片段

基因表达调控

1.什么是基因表达?试述基因表达变化的特点及其调控对生物体的重要性。

基因表达的定义：基因转录及翻译的过程

特点：组织特异性（tissue specificity）&阶段特异性（stage specificity）

意义：适应环境、维持生长和增殖& 维持个体发育与分化

2.真核生物中，基因的表达受不同水平的调控，请列举其中三种。

A.转录前调控：基因丢失（原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物）

基因扩增（gene amplification）

基因重排（gene rearrangement）

DNA的甲基化（DNA methylation）

组蛋白修饰（Histone modification）

B转录水平的调控：转录调控是通过各种调控元件相互作用来实现的，调控元件主要包括顺式作用元件和反式作用因子。

C转录后调控：hnRNA的选择性加工运输

mRNA前体的选择性剪接

RNA编辑

RNAi

D.翻译调控：翻译因子的磷酸化调控&mRNA稳定性调控

E.翻译后调控－蛋白质修饰

3.为什么说转录起始的调控是基因表达调控的中心环节?

基因调控主要发生在转录阶段，尤其是转录起始阶段。因为这是表达的初始阶段，可以避免那些不需要的转录所造成的资源浪费。4.举例说明DNA甲基化与肿瘤的关系

肿瘤的甲基化状态改变包括基因组整体甲基化水平降低、正常非甲基化CpG岛的高甲基化和维持甲基化模式酶的调节失控。DNA的甲基化修饰通过改变基因的表达，参与了细胞的生长、发育过程及X 染色体失活等的调控。在细胞正常发育基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用。