安吉白茶茶多酚的抗氧化活性研究

收稿日期：2011-05-24；修订日期：2011-11-01基金项目：湖州师范学院2011年校级科研项目作者简介：于淑池（1966-），女（满族），河北平泉人，现任湖州师范学院生命科学学院副教授，硕士学位，主要从事生物活性成分的功效研究工作．

安吉白茶茶多酚的抗氧化活性研究

于淑池，刘畅，王乘慧，马丽娜，朱敏

（湖州师范学院·生命科学学院，浙江湖州313000）

摘要：目的研究安吉白茶茶多酚的总还原力，对超氧阴离子（O 2－·）的抑制作用，对羟基自由基（·OH ）的清除作用，对Fe

2+

的络合能力，对红细胞溶血及H 2O 2所致红细胞溶血的抑制作用。方法采用安吉白茶中提取的茶多酚与Vc ，V E 和没食子酸（GC ）进行比较。结果安吉白茶茶多酚具有一定的还原力，对红细胞氧化溶血和H 2O 2所致的氧化溶血具有显著的抑制作用，

具有一定的抑制O 2－·作用，对Fe 2+络合能力次之，对·OH 的清除作用相对较弱。结论安吉白茶茶多酚可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和医药工业中。

关键词：安吉白茶；茶多酚；维生素C ；维生素E ；没食子酸（GC ）；抗氧化活性DOI 标识：doi ：10．3969/j．issn．1008-0805．2012．05．062

中图分类号：R962文献标识码：B 文章编号：1008-0805（2012）05-1184-04安吉白茶（Anji white Tea ），为山茶科（Theaceae ）茶属（Camellia ）木本植物。在20世纪80年代被发现，为浙江名茶的后起之秀。以叶张玉白，茎脉翠绿，香气清新、馥郁，滋味鲜爽，回味甘甜［1］

独树一

帜。茶多酚（Teaupolyphenol ，TP ）具有高效的抗衰老、抗辐射、消除人

体过剩的自由基、去脂减肥、降低血糖、血脂和胆固醇、预防心血管疾

病及抑制肿瘤细胞、保护脑神经等多种保健和药理功能［2，3］，在食品

工业、医药行业和日用化工业等领域具有广阔的应用前景［4］

。

目前对茶多酚抗氧化活性研究已有一些报道。赵保路［5］

对茶

·

4811·

多酚及其单体和异构体在不同体系清除各种自由基进行了研究，发现没食子酸酯的存在大大加强了茶多酚的抗氧化反应活性，在C环上的双键对增加抗氧化反应活性也起重要作用，茶多酚各成分之间具有抗氧化协同作用；吴佳敏［6］对茶多酚及改性衍生物的抗氧化活性进行了评价，发现茶多酚能够有效抑制脂质过氧化，而且效果优于维生素C（Vc）和维生素E（V E），显示了茶多酚在抗氧化方面的优良性能；谢贞建等［7］从普洱茶中提取茶多酚，研究表明普洱茶多酚具有较强的羟自由基和DPPH·自由基清除能力；姜绍通等［8］从抵挡绿茶中提取茶多酚，证明茶多酚对猪油有较强的抗氧化作用。

目前对安吉白茶茶多酚抗氧化活性的研究还未见报道，本实验主要研究安吉白茶茶多酚的总还原力、对超氧阴离子（O2－·）的抑制作用、对羟基自由基（·OH）的清除作用、对Fe2+的络合能力、对红细胞溶血以及H2O2所致红细胞溶血的抑制作用，为安吉白茶茶多酚在医药、食品等方面生产提供参考。

1材料与仪器

安吉白茶茶多酚，本实验室制备；血液（由湖州师范学院门诊部提供）。三氯乙酸、乙醇、甲醇、Na2HPO4、NaH2PO4、Vc、V E、铁氰化钾、邻二氮菲、FeSO4、3，5－二硝基水杨酸、邻苯三酚、Tris、FeCl3、柠檬酸钠、H2O2等均为分析纯。

TU－1810紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；HH－60型数显恒温搅拌循环水箱（常州国华电器有限公司）；DGX －9243BC－1型电热鼓风干燥箱（上海福玛实验设备有限公司）；800－B型台式低速离心机（上海安亭科学仪器制造厂）；FA2104N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；固体样品粉碎机（金坛市荣华仪器制造有限公司）；SHS－D（Ⅲ）型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。

2方法

2．1安吉白茶茶多酚总还原力的测定参照曹炜等［9］的方法。在10 ml试管中分别加入0．5mg/ml茶多酚溶液1ml，磷酸盐缓冲溶液（0．2mol/L，pH=6．6）0．5ml和0．3%铁氰化钾1．5ml，置于50?水浴中反应20min，然后加入10%三氯乙酸（TCA）1ml，混匀后3000r/ min离心10min，吸取上清液2ml，加0．5ml0．3%三氯化铁溶液，摇匀后在700nm处测定吸光值，实验重复3次，取平均值。同时用相同浓度的Vc、V E、GC做参照试验。

2．2安吉白茶茶多酚对O

2

－·的清除作用采用邻苯三酚自氧化法［10］，邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，释放出O2－·，生成有色的中间产物，从而阻止中间产物的累积，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度降低。将0．5mg/ml的茶多酚溶液和相同浓度Vc、V E、GC溶液分别取0．3ml加入到8．4ml Tris－HCl体系中，以蒸馏水为空白，在25?水浴恒温20min后，加入预热的邻苯三酚0．3ml，充分混匀，准确反应3min（加入邻苯三酚时开始计时）后，加入5%抗坏血酸（Vc）0．15ml终止反应。10min后，在波长420nm 处测定各吸光度值A。实验重复3次，取平均值。计算清除率E［11］。

E（%）=A

－A

A

?100%

式中E为清除率；A0为对照组OD值；A为样品组的OD值。

2．3安吉白茶茶多酚对·OH的清除作用［12］吸取2．0ml的磷酸缓冲液、1．5ml邻二氮菲（5．0mmol/L）、1．0mlFeSO4（7．5mmol/L）和5．5ml蒸馏水于试管中，混匀，作为未损伤管（A

未损

）；吸取2．0ml的磷酸缓冲液、1．5ml邻二氮菲、1．0ml FeSO4、4．5ml蒸馏水和1．0ml

H

2O

2

（0．1%）于试管中，混匀，作为损伤管（A

损伤

）；吸取2．0ml的磷

酸缓冲液、1．5ml邻二氮菲、1．0ml FeSO4、1．0ml茶多酚样品液、1．0

ml H

2O

2

和3．5ml蒸馏水于试管中，混匀，作为样品管（A样品），在

37?水浴中反应1h，在波长536nm处测定各吸光度值A。同时用相同浓度的Vc、V E、GC溶液做参照实验。实验重复3次，取平均值。计算清除率。羟基自由基茶清除率（E，%）=

A

样品

－A

损伤

A

未损

－A

损伤

?100%

2．4安吉白茶茶多酚对Fe2+的络合能力参照王华等［13］的方法。准确吸取FeSO4（1mmol/l）50μl，加入茶多酚样品溶液400μl，铁试剂（1mmol/l）20μl，用甲醇定容至1ml，反应10min在540nm处测吸光值，以不加样品溶液为空白样。同时用同一浓度的Vc、V E、GC溶液做参考实验。以Na2EDTA为阳性对照，结果表示为每克提取物相当于Na2EDTA的毫克数。

2．5安吉白茶茶多酚对红细胞溶血的抑制作用参照王德洁等［14］的方法。取5ml抗凝健康人血用20ml pH值为7．4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）冲洗、1500r/min离心3次，第1次和第2次离心分别为5 min，第3次离心10min，然后用PBS配成1%的红细胞悬液。取5支试管，分别加入6ml红细胞液，1号试管为空白对照加入PBS3ml，剩下4支分别加入同一浓度的茶多酚溶液、Vc、V E、GC溶液3ml，经37?水浴24h。1500r/min离心10min，在波长540nm处测定各吸光度值A。以对照组为100%溶血，实验重复3次，取平均值为。计算溶血度［15］。

溶血度（%）=A/A0?100%

其中：A0－对照组的吸光度；

A－试样组吸光度。

2．6安吉白茶茶多酚对H

2

O

2

所致红细胞溶血的抑制作用参照王德洁等［14］的方法。取6支试管，分别加入6ml红细胞液，1号为空白对照管加入PBS3ml，剩下5支分别加入0．3%的H2O21ml以及同一浓度的茶多酚溶液、Vc、V E、GC溶液3ml，恒定总体积，不足用PBS 补足。经37?水浴1h。1500r/min离心10min，在波长415nm处测定各吸光度值A。以对照组（2号试管）为100%溶血，实验重复3次，取平均值。计算溶血度［15］。

溶血度=（A－A0）/（A1－A0）?100%

其中：A－测试组吸光度；

A

－空白管吸光度；

A

1

－对照组吸光度

2．7数据处理应用SPSS17．0软件对数据进行单因素方差分析，数据用珋x?s表示，P＜0．05为有显著性差异，应用Excel软件作图。多重比较采用邓肯氏新复极差法进行。

3结果与分析

3．1安吉白茶茶多酚总还原力的测定抗氧化剂的还原力与其抗氧化活性之间存在关系，抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基，还原力越强，抗氧化活性越强。因此，可通过测定还原力来说明其抗氧化活性的大小。安吉白茶茶多酚总还原力测定结果见图1。从图1中可以看出在4种抗氧化剂中，没食子酸（GC）的还原能力显著地大于其他3种；Vc、V E其次，茶多酚还原力最低

。

图中a、b、c、d不同字母表示样品间还原能力呈显著性差异（P＜0．05）

图1安吉白茶茶多酚总还原力的测定

3．2安吉白茶茶多酚对O

2

－·的清除作用实验结果见图2。由图2可知，0．5mg/ml的Vc清除率最高，同浓度的安吉白茶茶多酚和

V

E

次之，没食子酸（GC）的清除率最低，其中安吉白茶茶多酚的清除率为（53．937?4．296）%。说明安吉白茶茶多酚具备一定清除超氧自由基的能力，且清除率与V E接近。

·

5811

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图中a 、

b 、

c 、

d 不同字母表示样品间清除能力呈显著性差异（P ＜0．05）图2安吉白茶茶多酚对O 2－·的清除能力

3．3安吉白茶茶多酚对·OH 的清除作用实验结果见图3。由图3

可知，0．5mg/ml 的V E 对·OH 有很强的清除能力，同浓度的安吉白

茶茶多酚具有一定的清除·OH 的能力，但是比V E 、

Vc 和没食子酸（GC ）都小，仅为（13．414?3．396）%

。

图中a 、

b 、

c 、

d 不同字母表示样品间清除能力呈显著性差异（P ＜0．05）图3安吉白茶茶多酚对·OH 的清除作用

3．4安吉白茶茶多酚对Fe 2+的络合能力Fe 2+能够催化Fenton 反

应导致羟基自由基的生成，多酚类物质能与Fe 2+

络合，减少羟基自

由基的生成，间接抑制脱氧核糖降解。安吉白茶茶多酚对Fe 2+

的络

合能力见图4。由图4可知，

4种抗氧化剂中，0．5mg/ml 的没食子酸（GC ）对Fe 2+的络合能力极显著地大于其他三种，VE 和安吉白茶茶

多酚次之，

VC 对Fe 2+的络合能力最弱。这说明安吉白茶茶多酚有一定的络合Fe 2+能力

。

图中a 、b 、c 、d 不同字母表示样品间络合能力呈显著性差异（P ＜0．05）图4安吉白茶茶多酚对Fe 2+的络合能力

3．5安吉白茶茶多酚对红细胞溶血的抑制作用安吉白茶茶多酚对红细胞溶血的抑制作用见图5。实验结果显示，红细胞经温浴24h 后，可出现明显溶血。0．5mg/ml 的安吉白茶茶多酚、

V E 、Vc 和没食子酸（GC ）均可抑制红细胞的自氧化溶血作用，

其中安吉白茶茶多酚对红细胞的溶血度为（9．573?1．421）%。安吉白茶茶多酚和Vc 对红细胞溶血具有较强的抑制作用。相同浓度下安吉白茶茶多酚的抗氧化活性比Vc 弱，但比V E 和没食子酸（GC ）强。3．6安吉白茶茶多酚对H 2O 2所致红细胞溶血的抑制作用安吉白茶茶多酚对H 2O 2所致红细胞溶血的抑制作用见图6。H 2O 2为强氧化剂，可以破坏红细胞膜，导致血红蛋白溢出。0．5mg/ml 的安吉白茶茶多酚、V E 、Vc 和没食子酸（GC ）均可抑制H 2O 2的这种作用，其中安吉白茶茶多酚对H 2O 2所致红细胞的溶血度为（26．151?1．922）%。相同浓度下Vc 的抗氧化性最强，安吉白茶茶多酚次之，GC 的抗氧化性最弱。4结论与讨论

大量试验证明，氧自由基的产生与多种疾病有关，如各种炎症、

老年性白内障、动脉粥样硬化、老年性痴呆、衰老等［9］

。在生理情况下，活性氧处于较低的水平，其产生和清除处于动态平衡，但在某些

病理情况下，其产生与清除的平衡被打破，将导致机体损伤［16］

。而安吉白茶茶多酚的体外抗氧化试验表明，安吉白茶茶多酚具有一定

的还原力，具有一定的清除O 2－

·和·OH 的能力，具有一定的络合Fe 2+能力以及对红细胞溶血以及H 2O 2所致红细胞溶血的抑制作用。对于不同的体系清除效果有所不同

。

图中a 、

b 、

c 、

d 不同字母表示样品间抑制能力呈显著性差异（P ＜0．05）图5

安吉白茶茶多酚对红细胞溶血的抑制作用

图中a 、b 、c 、d 不同字母表示样品间抑制能力呈显著性差异（P ＜0．05）图6安吉白茶茶多酚对H 2O 2所致红细胞溶血的抑制作用

抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基，其抗氧化活性与还原力呈正相关，还原能力越大，其抗氧化活性能越强，因此可通过测定物质的还原力来间接表示其抗氧化活性的大小［17］。本试验采用公认的抗氧化剂V E 、

Vc 和没食子酸（GC ）作为参照。研究结果表明：0．5mg/ml 安吉白茶茶多酚的还原力比V E 、

Vc 和没食子酸（GC ）都弱，比李林［18］

用0．2mg/ml 的绿茶多酚测得的还原力稍低一些。

尽管超氧阴离子自由基是大多数有机体内存在的一种相对较弱的氧化剂，但是其能通过歧化作用和其他类型的反应产生过氧化氢和羟自由基，是体内形成自由基的来源，并且超氧阴离子自由基可

以通过破坏DNA 和细胞膜导致机体严重损害［19］

。本实验采用邻苯

三酚自氧化法测定安吉白茶茶多酚对O 2－

·抑制作用。邻苯三酚在

碱性条件下能发生自氧化，释放出O 2－·，生成有色的中间产物，而

产生的O 2－

·又能促进邻苯三酚的自氧化。当加入还原试剂如Vc

时，

抑制了O 2－

·生成速度，从而阻止中间产物的累积，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度下降。试验结果显示，安吉白茶茶多酚对O 2－

·的清除率达到了（53．937?4．296）%，仅次于Vc ，显示出对O 2－·具有较强的清除作用。李林［18］

测得绿茶多酚清除O 2－·的活性IC 50为0．54mg/ml ，而且茶多酚清除O 2－

·的活性随着

浓度的增加而增加，与本实验测得的结果相近；全吉淑等［20］

从绿茶中提取的茶多酚当浓度为1mg/ml 时，其清除率为59．9%，与本实验

相比抑制率较差；马森［21］

从武夷岩茶中提取茶多酚，测得茶多酚对邻苯三酚自氧化的抑制率随剂量增加，抑制作用也显著增加，但比本

实验抑制率低很多。综上可知，安吉白茶茶多酚对O 2－

·的抑制率

与其他绿茶多酚相差不大，但比武夷岩茶多酚高，显示出安吉白茶茶

多酚具有较强的清除O 2－

·的能力。·OH 氧化活性很强，是仅次于氟的一种非选择性氧化剂，对细胞的危害最大，可直接损伤各种生物膜，导致多种疾病的发生。羟自

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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012VOL．23NO．5

由基清除率是反映药物抗氧化作用的重要指标［22］。本试验采用磷二氮菲－Fe氧化法检测H2O2/Fe2+体系产生·OH。FeSO4与H2O2反应产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光度表示·OH的多少，吸光度越大，·OH越多。安吉白茶茶多酚在0．5mg/ml时对·OH清除率为（13．414?3．396）%。而李林［18］用0．1mg/ml的绿茶多酚清除·OH的活性随着加入量的增加而增加，加入量为0．1ml时其清除率已达到40%；全吉淑等［19］从绿茶中提取并配置成1mg/ml 的茶多酚，其清除率为61．8%；以及侯冬岩等［23］从普洱茶中提取多酚，当清除率为50%时溶液浓度为0．16mg/ml。相对于以上结果，本实验安吉白茶茶多酚清除·OH能力相对较弱。

茶多酚分子内有多个邻位酚羟基。可作为多基配体与一个中心离子如铅，锡，铁，钙等络合，形成环状的螯和物而产生沉淀。4种抗氧化剂中，0．5mg/ml的没食子酸（GC）对Fe2+的络合能力极显著地大于其他3种，V E和安吉白茶茶多酚次之，Vc对Fe2+的络合能力最弱，安吉白茶茶多酚在0．5mg/ml时络合力为（37．457?1．264）mg/g。周才琼等［24］研究发现金属离子的存在会影响TP的溶解性，影响其抗氧化活性。Khokhar等［25］研究发现儿茶素（黄烷醇类）的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表儿茶素（EC）都能与Fe2+形成络合物，B 环的邻苯二酚基团是茶多酚与Fe2+的结合所必需的，当B环上的3，4邻二羟基转变成3，4，5三羟基没食子酰基团时，其与Fe2+的结合效率降低。

在机体内红细胞是一种具有运输O2及CO2作用的细胞，其膜内的血红蛋白使其功能的发挥成为可能，一旦细胞膜发生破坏，其内部的血红蛋白外溢，红细胞被破坏其运输能力便丧失。红细胞膜易受到氧自由基的攻击发生脂质过氧化而使红细胞膜的完整性破坏，导致溶血［14］，安吉白茶茶多酚对于红细胞膜自氧化和H2O2所致的红细胞氧化溶血具有显著的抑制作用，抗氧化剂的抗氧化性可能与抑制脂膜过氧化有关。安吉白茶茶多酚的抗氧化性仅次于Vc，而明显高于另外两种。显示出对红细胞膜具有保护作用。马兰萍等［26］采用水溶性偶氮引发剂引发红细胞的溶血并以从绿茶中提取的茶多酚抑制其溶血，研究发现绿茶多酚的加入能有效地抑制溶血；王贞丽等［27］将茶多酚灌入小鼠胃内，测得茶多酚能增强机体抗氧化能力，减少自由基对生物膜的损伤，维持细胞膜的稳定性，具有抗衰老作用。总之，通过本研究为安吉白茶茶多酚的进一步应用提供了重要的参考价值。

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