WB实验基本步骤

实验基本步骤

提取细胞蛋白

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BCA定量

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制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

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蛋白样品变性

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电泳

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转膜

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封闭

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一抗

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TBST洗涤

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二抗

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TBST洗涤

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显影

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结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g

磷酸氢二钠 1.44g

氯化钠 8g

氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2

定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g

甘氨酸 7.2g

400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷

1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液

2.加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，8000r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后，于4℃下12000 rpm离心5 min。

7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。

二、蛋白含量的测定（BCA定量）

准备：96孔板，移液枪（1000ul，10ul，200ul），BCA工作液（A+B），50mlEP管，1xPBS，BSA标准液

1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）

2.算好孔数（总的）每孔加200ulBCA工作液（A+B），（A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B液240ul）

3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul

4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液

5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到20ul

6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差

7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟

8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ml）为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存）

9.计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）

蛋白质定量标准曲线加样量

序号 1 2 3 4 5 6 7 8

标准蛋白量/ul

0 1 2 4 8 12 16 20 （0.5mg/ml）

背景液（PBS）/ul 20 19 18 16 12 8 4 0