大肠杆菌苹果酸合酶A的酶学和生理功能研究

收稿日期:2010-04-07;修回日期:2010-05-16

基金项目:国家自然科学基金(30500300;30870062);教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET -06-0558);教育部回国留学人员启动基

金;芜湖市自然科学基金重点项目(2009-4-7);安徽师范大学优秀创新团队建设计划资助

作者简介:王程(1985-),女,硕士研究生,专业方向微生物分子生物学研究,E-m ai:l ellislinn a w@126.co m;通讯作者:朱国萍,教授,博士生导师,主要从事蛋白质功能进化与分子生物学研究,E-m ai:l gpz 1996@yahoo .com 。

do i 10.3969/j issn 2095-1736.2011 02 039

大肠杆菌苹果酸合酶A 的酶学和生理功能研究

王 程1

,王 敖1

,赵旵军2

,朱国萍

1

(1.安徽师范大学生命科学学院,芜湖241000;2.芜湖市第二人民医院检验科,芜湖241000)

摘要:苹果酸合酶是乙醛酸循环的关键酶之一。E.coli 中苹果酸合酶A (m alate syn t hase A,M SA )由ace B 基因编

码。根据E.co li 基因组序列设计引物,利用PCR 技术扩增ace B 基因,并将其克隆入pET -29b (+),构建了重组表达质粒pET -M S A 。经IPTG 诱导,M SA 在E.coli R ose tta (DE3)中获得高效表达。纯化的M SA 蛋白的分子量大小约为60kDa ,最适反应p H 值和最适温度分别是p H 值8 0、30 。纯化的蛋白质在M g 2+存在时才能发挥最大的活性,其对乙酰辅酶A 的K m 和V ma x 分别是8 07 M 和3 6 M /m i n 。此外构建了M S A 和苹果酸合酶G (M S G )基因敲除菌株M G:: ace B 和MG:: ace B glcB 。研究发现缺少M S A 的E.coli 突变菌株在乙酸中的生长速率要比野生型菌株慢很多,表明M S A 对大肠杆菌在乙酸中的生长起着重要作用。M SG 虽然能部分补偿M SA 的作用,但是包含M S A 的乙醛酸旁路是更有效的乙醛酸代谢途径。

关键词:苹果酸合酶A;表达;动力学;生长速率;大肠杆菌中图分类号:Q78文献标识码:A 文章编号:2095-1736(2011)02-0039-04

Characterization and physiological role

ofm alate synt hase A in Escherichi a coli

WANG Cheng 1

,WANG Ao 1

,Z HAO H an -jun 2

,Z HU Guo -p i n g

1

(1 Colle ge of L ife Sciences ,A nhui Nor m al Un i versity ,W uhu 241000;

2 C linical Labor atory ofWuhu Second People s Hospita,l W uhu 241000,Ch i na)

Abstrac t :M alate synthase is one o f the key enzy m es in g l yoxylate cy cle .The aceB gene ,encod i ng m a l a te synthase A (M SA ),w as a mp lified from the genom i c DNA o f Escher ichi a co li MG 1655using PCR w ith pr i m ers desi gned accord i ng to the sequence o f E.coli ge -no m e .T he PCR product w as c l oned i nto pET-29b(+),resu lting t he reco m bi nant plas m i d pET-M SA.T he target pro te i n (M SA )w as overexpressed i n E.coli R ose tta (DE3)under IPTG i nduction ,and then the enzym e w as pur ifi ed to hom ogeneity .The mo lecu l a r w e i ght (MW )o fM SA w as about 60kD a .The opti m a l p H and temperature ofM SA w ere p H 8 0and 30C ,respecti v ely .The m ax i m u m acti v ity of pur ifi ed M SA was observed i n the presence ofM g 2+.T he K m and V m ax va l ues f o r acety -l CoA ofM SA we re 8 07 M and 3 6 M /m i n ,respec tive l y .Furthermo re ,t he m utan t stra i ns ,M G:: ace B w it h M SA de leti on and MG:: ace B glc B w ithM SA and m alate syn t hase G (M SG )deletion ,we re constructed ,respec tive l y .Itw as observed that the gro w t h rate o f the m utan t E.coli stra i n w ithM S A de l etion w as re m arkably l ow er than that o f t he w ild -type stra i n ,i ndica ti ng that M SA w as essenti a l for E.coli grow t h on acetate .A -l t hough M SG w as ab l e to partia ll y recover t he functi on o fM S A,the g l yoxy l a te bypass conta i ni ng M SA w as the muchm ore effec tive m eta -bolic path w ay of g lyoxy late .K eywords :ma late synthase A;expressi on ;k i neti cs ;grow t h ra te ;E scherichia co li

乙醛酸循环又称乙醛酸途径,是三羧酸循环的回补途径,两者之间存在着某些相同的酶类和中间产物。乙醛酸循环中有两个关键性酶,即异柠檬酸裂解酶

(isocitrate lyase ,I CL )和苹果酸合酶(m alate synthase ,M S),前者催化异柠檬酸生成乙醛酸和琥珀酸,而后者

催化乙醛酸和乙酰辅酶A 缩合形成苹果酸和辅酶A 。

乙醛酸循环的终产物将参与糖异生途径以及其它的生物合成途径[1]。

乙醛酸循环在古菌、细菌、真菌、原生动物以及萌发的植物种子中均有发现[1-2]。此外,一些研究报道在脊椎动物中也发现了I CL和M S的活性,尽管人们认为这些动物中并不存在乙醛酸循环。在微生物和高等植物幼苗以C2化合物为原料合成碳水化合物的过程中,乙醛酸循环起着十分重要的作用[3]。同时,一些研究也指出在分枝杆菌(M ycobacteria)中,病菌的持续感染能力与乙醛酸循环直接相关[4]。

苹果酸合酶有两种同工酶,即苹果酸合酶A和苹果酸合酶G,分别简称为M SA和M SG。M SG仅存在于细菌中,而M SA在细菌、真菌和植物中都有发现。

E.coli同时含有这两种苹果酸合酶,其中M SA由aceB 基因编码,参与乙醛酸循环,M SG由glcB基因编码,与乙醇酸盐(g lycolate)的利用有关[5]。

本文依据G e nBa nk中已报道的E.coli基因组序列,克隆了aceB基因,实现了高效表达与纯化,并对M SA的酶学性质进行了鉴定。另一方面,利用染色体同源重组技术敲除了E.coli MG1655中的aceB基因和glc B基因,通过测定缺陷型菌株的生长速率,对M SA 的生理功能进行了初步研究。

1材料与方法

1 1材料

1 1 1菌株和质粒

E.coli MG1655和DH5 为本实验室保存,质粒pET-29b(+)及宿主菌E.coli R osetta(DE3)由中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家实验室周丛照教授惠赠。

1 1

2 培养基和试剂

LB、SOB、SOC和MD培养基的配方见文献[6]。生长曲线测量时使用的乙酸-MOPS和葡萄糖-M OPS培养基中分别包含2%的乙酸和2%的葡萄糖,如文献所述[7]。DNA聚合酶、限制性内切酶购于N e w Eng la nd B i o l abs,T4DNA连接酶、质粒提取试剂盒(W izard P lus SVm i n i preps DNA Purif i cat i on Syste m)、胶回收试剂盒(W izard S V G el a nd PCR C lean-U p Syste m)购于P ro-m ega公司,高保真Prm i e STAR HS DNA聚合酶购于T a K a R a公司,标准蛋白分子量购于Fer mentas公司,蛋白质纯化试剂盒购于C lontech公司。

1 2方法

1 2 1aceB基因的克隆

根据E.coli基因组序列,设计了分别带有N co I和Xho I酶切位点的一对引物:上游引物为5 -GACTATC-TACCCATGGCATGACTGAACAGGCAACAACAACCG-3 (下划线标记的是N co I酶切位点);下游引物为5 -CACAGACTGA CTCGAGCATAGTTATGTGGTGGTT-TACGCT-3 (下划线标记的是Xho I酶切位点)。以E.coli M G1655基因组DNA为模板进行ace B基因的扩增。PCR扩增条件为:94 预变性4m in;98 10s, 65 15s,72 2m i n,30个循环;72 延伸10m i n。扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒纯化,再经N co I和N ho I双酶切后克隆于载体pET-29b(+)上,转化感受态细胞DH5 ,筛选阳性克隆,经酶切鉴定后,重组质粒pET-M SA送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1 2 2M S A的诱导表达和纯化

将pET-M SA转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,挑取单菌落,37 培养过夜后,按1%接种于50mL LB液体培养基中,37 振荡培养至OD

600

为0 5~0 6时,加入0 5mM的I PTG诱导表达6h。离心收集菌

体,用破碎缓冲液[含有10mM KH

2

PO

4

(p H值7 7)、

500mM N a C l、2mM M gC l

2

和2mM -M ercaptoethanol]超声波破碎4m i n,总蛋白通过蛋白质纯化试剂盒进行纯化,SDS-P AGE电泳检测。

1 2 3酶活测定和动力学参数测定

反应体系包含100mM T ri s-HC l(p H值8 0)、10

mM M gCl

2

、1mM乙醛酸和0 03mM乙酰辅酶A[2]。乙酰辅酶A中的硫脂键(thi oester bond)在232nm处的吸光值最大,随着反应的进行,硫脂键的断裂会导致232n m处的吸光值不断下降。使用可以自动控温的Cary300UV分光光度计(美国VAR I AN公司)检测232n m处的吸光值变化。一个酶活单位(U)定义为每分钟催化乙酰辅酶A产生1 m ol辅酶A所需的酶量。反应中控制乙醛酸和M g2+的浓度不变,改变乙酰辅酶A的浓度,得到若干组数据后利用双倒数方法(L in-

e w eaver-Bur k)求得K

m

。蛋白质浓度的测定使用BI O-RAD公司的试剂盒,以牛血清白蛋白为标准。

1 2 4最适反应p H值和最适反应温度

在不同p H值的T ris-HC l缓冲液(p H值6 0~ 10 0)中,37 测定酶活,以酶活力最高点的相对酶活力为100%,确定最适反应p H值。在20 ~45 之间测定酶活力,规定酶活最高点的相对酶活力为100%,确定酶的最适反应温度。

1 2 5金属离子对酶活的影响

分别将终浓度为10mM的M g C l

2

、CaC l

2

、N aCl和KC l和纯化的M SA混匀后于冰上孵育30m i n,所用缓冲液为终浓度50mmol/L的T ris-HC l(p H值8 0),测定酶活力。处理前的酶活力设为100%。

1 2 6 E.coli基因敲除菌株的构建

根据E.coli基因组序列,设计用于敲除的引物,如表1所示。先使用常规PCR获得ace B基因上游的同

源片段ace B-Fa、ace B基因下游的同源片段ace B-Fb和卡那霉素抗性基因片段kan。利用二步重组PCR获得全长DNA融合产物。首先以ace B-Fa和kan为模板,以aceB-F a-N和kan-C为引物,PCR获得ace B-F a-kan 融合片段,再以aceB-F a-kan和ace B-Fb为模板,以ace B-Fa-N和aceB-Fb-C为引物PCR获得ace B-Fa-kan-ace B-Fb融合片段。第一步PCR反应体系中包含等量的分段DNA模板,但不含任何引物。5个循环后进入第二步PCR反应,即以第一步反应体系的产物为模板,同时加入两端引物,进行二次扩增反应:94 变性1m i n,58 复性1m i n,72 延伸1m in;30个循环后, 72 延伸10m i n。

表1菌株构建所使用的引物

T ab l e1Pri m ers for stra i n cons tructi on

Pri m er O li gonucl eoti de s equ ence(5 t o3 )

ace B-Fa-N TCAGCACCTTACCTCAGGCACCTTCGGG

a ce B-Fa-C CCGGAATTAATTCTCATGTTTGACAGCT-TATCACTATAATCACCAGCTCAGTCAGAAATTCTA

ace B-Fb-N GAAGCAGCTCCAGCCTACACAATCGCT-CAACTAAGAAGTATTCAACGACATTCTCGGCTC

ace B-Fb-C GCGGCATCGTCAAAACGCCCCTGGGA

g lc B-Fa-N GCTGTTGCCGATGACGGCGGTCATCTGCTGG

g lc B-Fa-C CCGGAATTAATTCTCATGTTTGACAGCT-TATCACTATAAGGCTCTGGGTTATGGTTTGACT

g lc B-Fb-N CGAAGCAGCTCCAGCCTACACAATCGCT-CAACTAAGAAGACGCCTTGGATCAAAGCCTACG

g lc B-Fb-C CGCACCACGTACCCCAGAATCCCCTGCACGTTGT

kan-N TTATAGTGATAAGCTGTCAAACA

kan-C TTCTTAGTTGAGCGATTGTGTAG

Fa代表位于目标基因上游的同源序列;Fb代表位于目标基因下游的同源序列

细菌染色体基因敲除采用D atsenko法进行[10]: p KD46是一种可以提高外源片断与细菌染色体同源重组频率的辅助性质粒,将携带pKD46的E.coli接种于含树胶醛醣的SOB培养基,30 培养至对数期后钙镁法制备感受态细胞[9]。将重组的线性PCR产物ace B-Fa-kan-ace B-Fb转化感受态细胞,42 热休克后加入SOC培养基,37 振荡培养1h,将转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上,倒置培养。挑取数个转化子培养,提取基因组DNA,对基因敲除部位进行PCR扩增和测序,以鉴定染色体上ace B基因的缺失及外源基因kan的插入。将aceB基因敲除菌株命名为M G:: aceB。在此基础上同理构建ace B基因和glcB基因双敲除菌株MG:: ace B glc B。

1 2 7生长曲线的测定

从M D平板上分别挑取菌株MG1655、MG:: aceB 和MG:: ace B glcB单菌落至葡萄糖-MOPS液体培养基中,37 培养,每隔1h取样一次,测量OD

600

。从葡萄糖-MOPS液体培养基中吸取500 L菌液至琥珀酸-M OPS液体培养基中,37 培养24h,再从琥珀酸-M OPS液体培养基吸取500 L菌液至乙酸-MOPS液体培养基中,确保三种菌的菌液起始浓度相同,置于37 培养,每隔2h取菌液测量OD

600

。

2实验结果

2 1M SA的诱导表达和SDS-P AGE鉴定

将重组表达质粒pET-M SA转化感受态 E.coli R osetta(DE3),37 进行I PTG诱导表达。12%的SD S-P AGE结果显示,在45kDa和66 2kD a之间有明显的表达产物,分子量约60kD a,与M SA的理论计算值(60 3kD a)相近(图1)

。

2 2p H值和温度对酶活的影响

在标准条件下测定酶活力,测得M SA的最适反应p H值是8 0。在p H值8 0之前,随着缓冲液p H值的增加,酶的活力逐渐上升(图2)。超过p H值8 0之后,随着缓冲液p H值的增加,酶的活力逐渐降低。这表明大肠杆菌M SA是偏碱性的酶。在p H值8 0条件下,在不同温度测定酶活力,结果表明M SA具有较宽的酶反应温度,其最适反应温度为30 ,在25 到35 之间可维持80%以上的活性(图3)。

2 3金属离子对M SA活力的影响

金属离子的影响如表2所示。由表中的数据可以看出,M SA是一个金属离子依赖型的酶。没有金属离子存在时,M SA没有催化活性。M g2+是M SA的最强激活剂。与M g2+相比,Ca2+、K+和N a+只能部分地代替M g2+。同样,在M g2+存在的条件下,加入Ca2+和N a+会抑制酶的活性,而加入K+则有增强酶活性的效果。

表2金属离子对酶活力的影响

Table2E ffects ofm etal i on s on purifi ed M SA

M etal i ons(at10mM)Relati ve acti vity(%)

Non e0

M g2+100 00 6 17

Ca2+83 96 4 23

K+58 49 6 59

N a+55 91 5 56

M g2++Ca2+86 45 1 88

M g2++Na+93 18 5 69

M g2++K+111 91 2 08

2 4酶动力学研究

动力学研究表明来自E.coli的M SA对乙酰辅酶A具有很高的亲和力。当底物乙醛酸和金属离子M g2+的浓度保持不变时,随着乙酰辅酶A浓度的增加,反应速率符合典型的M icaelis-M enten模型。根据

双倒数作图法,得出M SA对乙酰辅酶A的K

m 和V

m ax

值

分别是8 07 M和3 59 M/m i n。

表3M SA的动力学参数

Tab le3K i neti c para m eters of pu ri fi ed M SA

Enz ym e K m( M)k c at/s V m ax( M/m i n)k c at/K m/s M

E.coli M SA8 076 5383 5958 1 105

2 5基因敲除菌株的生长速率

菌株MG1655、MG:: ace B和MG:: ace B g lc B在葡萄糖和乙酸上的生长速率如表4所列。在葡萄糖培养基上生长时,三种菌株的生长速率没有明显差异,比较接近。在乙酸培养基上生长时,三种菌株的生长速率明显不同。M G:: ace B和MG:: ace B glc B的生长速率明显比野生型低,分别下降了67%和84%。另外,M G:: ace B的生长速率是MG:: aceB glc B菌株的两倍。

表4不同菌株在不同碳源中的生长速率

T ab l e4Grow t h rates of strai ns i n vari ous carbon sou rces

S trai n

G ro w th rates/h

G l u cos e Acetate

M G1655(W ild type)0 637 0 0230 239 0 012 M G:: ace B0 623 0 0150 081 0 005 MG:: a c e B g lc B0 618 0 0190 038 0 002

3讨论

动力学研究表明E.coli苹果酸合酶A对乙酰辅酶

A具有较高的亲和力,K

m

值为8 07 M,这与一种嗜热杆菌对乙酰辅酶A的亲和力(8 M)很接近,比乙酸钙不动杆菌(A cinetobacter calcoaceticus)(15 M)则要低近1倍[10]。E.coli苹果酸合酶A的最适p H值在8 0左右,说明它是一个偏碱性的酶,这与其它的研究报道一致。如来自乙酸钙不动杆菌和好冷菌(Col w elli a maris)的苹果酸合酶都是在pH值8 0时表现出最大的活性[10-11];来自真菌癞拟层孔(Fo m ito p sis palustris)和谷氨酸棒杆菌(Cor ynebacteri um gluta m icum)的苹果酸合酶的最适p H值分别是8 5和7 6[2,12]。E.coli苹果酸合酶A的最适反应温度为30 ,明显低于其它来源的苹果酸合酶。如来源于极端嗜盐古菌(H alo f erax volcanii)、好冷菌和谷氨酸棒杆菌的苹果酸合酶最适温度分别是55 、45 和43 [11-12]。

金属离子依赖性研究表明E.coli苹果酸合酶A是金属离子依赖性酶。对M g2+的强烈依赖性与其它报道结果一致。例如,对真菌癞拟层孔苹果酸合酶的研究显示[2]:M g2+是最强激活剂,Ca2+、M n2+、N a+和K+都无法与M g2+相比,替换之后活性分别下降至原来的19%、16%、10%和5%;同样在M g2+存在的条件下,加入Ca2+、M n2+、N a+和K+都会抑制酶的活性,活性分别下降至原来的38%、34%、92%和93%。

生长曲线的实验表明,当碳源丰富时(葡萄糖),菌株MG:: ace B和M G:: ace B glc B的生长速率与野生型菌株相近,说明,M S A和M SG的缺失对E.coli 的生长影响不大,大量用于生物合成和能量产生的NADP H和NAD H来源于戊糖磷酸途径和三羧酸循环,此时乙醛酸循环处于关闭状态。当碳源贫瘠时(乙酸)时,菌株MG:: ace B和M G:: aceB glc B的生长速率明显降低,分别比野生型下降了67%和84%,说明M SA对 E.coli在乙酸中的生长十分重要。另外M G:: ace B的生长速率明显高于M G:: ace B glcB,是它的两倍,说明当M SA缺失时,虽然M SG可以部分补偿M SA的作用,但是包含M S A的乙醛酸旁路是更有效的乙醛酸代谢途径。当M SA和M SG同时缺失时,乙醛酸循环被中断,因而E.coli在乙酸上的生长速率极慢。有文献报道,缺失了异柠檬酸裂(下转46页)

核生物分子遗传操作简便、培养成本低、产量高、产物便于分离纯化等优点,又具有大多数真核生物共有的翻译后修饰机制,自身分泌蛋白很少,蛋白易纯化等诸多优点,因此该表达系统从一被开发就逐渐显示出其在表达外源蛋白方面的独特优势[8]。

本研究选取了分泌型表达载体pP I C9k作为表达载体,因为其自身具有信号肽基因 -factor和甲醇诱导型强启动子AOX1,前者可以帮助外源蛋白顺利的分泌到细胞外,方便了产物的检测和纯化,但是,其表达量相对低于原核表达,分泌表达的上清液中蛋白的含量一般较低,只有通过浓缩后才能用蛋白电泳检测到清晰的条带,因此,本试验中采用冷冻干燥法对表达上清液进行浓缩,这种方法最大的优点是保证蛋白的活性不被破坏,但是,试验中表达上清对各种测试菌的抑菌活性偏低或者没有活性,这很有可能是因为蛋白表达量低且浓缩量不够等原因导致的,需要经过进一步的诱导表达条件的优化和蛋白纯化的研究;后者甲醇氧化酶启动子是强诱导型启动子,通过甲醇的诱导可以强化表达外源基因。由于在甲基营养型酵母中质粒不能生存,载体必须和酵母基因组中的同源区发生重组,才能实现外源蛋白的稳定表达[9]。实验中选用Bg l 切割表达载体,使其产生游离的AOX5 和AOX3 ,从而以双交换方式替换醇氧化酶基因,转化子的醇氧化酶基因就被破坏,这种整合方式的转化子表型为M ut s[10]。本试验成功的构建了分泌型表达载体pPI C9k-G a-l2,并获得了含有Ga-l2防御素蛋白的上清液,为下一步功能评价等研究奠定了一定的基础。

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(上接42页)解酶的 E.coli菌株无法在乙酸上生长[4,13]。因此推测在MG:: ace B glc B中,大量乙醛酸不能被转化为苹果酸,但可能通过甘油酸酯途径(glyc-erate pat hw ay)的转化和分解再进入中心代谢[14],相关验证工作正在进行中。

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