免疫荧光检测

免疫荧光检测 Revised final draft November 26, 2020

或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。

抗核抗体(antinuclearantibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于、关节滑膜液和尿液中。

抗核抗体实验原理

以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。

试剂与器材

1．抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下：

(1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。

(3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。

2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。

3．0.01mol/LpH7.2PBS

4．缓冲甘油取甘油9份加PBS1份。

5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。

6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等

操作方法

1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。

2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。

3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。

4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。

5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

7．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。

8．封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS至盖片：每反应区约10μl。从PBS-Tween缓冲液中取出1张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下1张。

结果判定

荧光显微镜下观察

1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。

2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为：

①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光；

②周边型(核膜型)：细胞核周围呈现荧光；③斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光；

④核仁型：核仁部分呈现荧光。

⑤混合型：两种以上核染色；

⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA)

注意事项

1．PBS-Tween缓冲液在4℃下可存放两周。

2．根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在4℃下可存放1周。

3．血清或FITC标记的抗人Ig应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。

4．载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。

5．冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。

6．封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。

7．封片介质含有荧光稳定剂，应保存在2-8℃。封好的载片可于4℃长期保存。

实验讨论

方法评价间接免疫荧光技术是检测ANA最常用的方法。该方法简便、敏感，且可根据核染色形态确定核抗原的类型。

鼠肝印片细胞分布不均匀，多有重叠，冲洗时易丢失。Hep-2细胞具有核大、有丝分裂旺盛、核内细胞器较明显、具备人源性抗原的特征，对诊断和鉴别不同类型的自身免疫病十分有利。

检测抗核抗体(ANA）的实验方案

ANA简介

抗核抗体（antinuclear?antibodies，ANAs）

经典定义：针对细胞核成分的一大组抗体谱。

抗核抗体新概念（FANA）

传统定义：顾名思义是指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称?狭义定义

现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指抗核酸(nucleicacid)和核蛋白（nucleoprotein)抗体的总称?广义定义

靶抗原分布：细胞核

细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂周期

抗核抗体检测方法

检测细胞内抗原自身抗体“金标准”－IIF

ANA检测方法进展：仅限于IIF改良法（底物选择、制备方法）试图将ELISA发推广为最基本的筛选方法未获成功

复制细胞抗原全部成分极其困难?抗原存在的相对浓度、自然抗原决定簇的二级结构及高级结构

荧光染色模型可初步判断相应抗体性质范围或确定抗体特异性

IIF法：HEp-2细胞底物（90%以上实验室采用）

#完整的ANAs抗原谱（细胞核、浆、骨架、周期）

#可预测分析ANA靶抗原范围

#经验性强

ELISA法：采用高度纯化抗原或全细胞抗原

#抗原谱有限（十余种）

#假阴性结果

#操作简单快速

其他方法：金标法、比浊法?

ANA靶抗原

多核苷酸：双链DNA、单链DNA、RNA

组蛋白：H1，H2A，H2B，H3，H4，H2A-H2B复合物

核浆的核糖核蛋白:U1-nRNP、Sm、SS-A(Ro)、SS-B(La)、Ku、Mi-1、Mi-2、核点、增殖性细胞核抗原…

核仁抗原：Scl-70、U3-nRNP/原纤维蛋白、RNA多聚酶I、PM-Scl(PM-1)、7-2-RNP(To)、4-6-S-RNA、核仁形成中心（NOR）…

核膜抗原：板层素（层粘连蛋白）

着丝点：着丝点蛋白

……

ANA检出率

与年龄和性别有关

与个体的免疫稳定性相关

使用足够敏感的方法，每个人都可检测出一些ANA。

_________天然ANA_________

生理性自身免疫

维持机体内环境的生理稳定。

滴度较低，亲和力弱，大多为IgM型。

ANA检测方法

初筛抗核抗体：IIF

最佳基质：联合生物薄片(HEp-2细胞/猴肝冰冻组织)

区分抗核抗体的靶抗原：ELISA、印迹法和免疫印迹法

ANA初筛

IFT：HEp-2细胞/灵长类肝脏

完整的抗原谱（细胞核及细胞浆）

可预测靶抗原

协助检测其它项目（如ANCA、ENA）

ELISA：采用高度纯化的抗原初筛ANA

抗原谱有限

操作简单快速

采用滴定平板技术进行间接免疫荧光实验

为了使实验操作标准化，欧蒙开发了滴定平板技术:滴加标本或标记抗体至加样板的反应区，然后将生物薄片载片盖在加样板表面的凹槽里，这时，载片上的所有生物

薄片均与液滴接触，反应同时开始。系统的几何结构决定了液滴的位置和高度。因为液体被局限在一封闭的空间里，所以不再需要传统的“湿盒”。并且可在一致的反应条件下同时温育任何数量的标本。

准备：检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂或ExtranMA01（默克公司），再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于3％的SekuseptExtra（汉高公司）中浸泡1小时。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。

稀释：按照试剂盒使用说明稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。

加样：在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育（一次最多200份）。使用聚苯乙烯加样板。

加样体积:

10μl/反应区(3x3mm)

25μl/反应区(5x5mm)

70μl/反应区(7x9mm)

温育：将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相接触，而标本之间不相互接触。室温温育30分钟。

清洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween 缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。

冲洗1秒钟

小杯内浸洗5分钟

加样：将荧光标记的抗人免疫球蛋白（酶结合物）加入洁净加样板的每个反应区。完全加完所有的二抗后，方可继续温育（最多可加50个载片）。使用连续加样器。加样前应使用加样器混匀。为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。

加样体积:

10μl/反应区(3x3mm)

20μl/反应区(5x5mm)

60μl/反应区(7x9mm)

温育：从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。从现在开始，注意避免阳光直射载片。室温温育30分钟。

清洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水冲洗载片，然后立即放入装有PBS-Tween 缓冲液的小杯中浸洗至少5分钟。可在每150ml磷酸盐缓冲液中加10滴(150μl)伊文氏蓝进行复染。

冲洗1秒钟

小杯内浸洗5分钟

封片：在盖玻片上滴加甘油/PBS。使用聚苯乙烯封片板。从PBS-Tween清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。然后再进行下一个载片的操作。

封片体积:

10μl/反应区(3x3mm)

10μl/反应区(5x5mm)

20μl/反应区(7x9mm)

结果判断：荧光显微镜下观察荧光。

荧光工作台的布置

清洗

载片的擦拭

封片

ANA的结果

间接免疫荧光法的独特优势?(一种基质–可筛查上百种不同的抗体)

用HEp-2细胞检测自身抗体

ANA荧光模型

核均质型

核仁型?

核颗粒型?

ANA确认实验（1）

IFT:

-HEp-2细胞/灵长类肝脏：特殊的荧光模型

如着丝点、核膜型、核糖体P蛋白、肌动蛋白ELISA:

-ANA分项(含ENA谱):包被高度纯化抗原

斑点法/印迹法

-ENA谱:采用各种高度纯化的抗原

ELISA：抗ENA谱

印迹法：抗ENA谱?

印迹法：抗ENA谱

免疫印迹法

ANA确认实验（2）

Westernblot:HEp-2细胞提取物

-定性

-适宜特别需要（如区分靶抗原Ro52或Ro60）

-检测目前无法纯化的靶抗原的抗体（如PM-Scl、Ku）

初筛实验：

免疫荧光技术(HEp-2细胞/灵长类肝脏）

ELISA（纯化的多种核抗原）

确认实验：

ELISA

印迹法

斑点法

Westernblot

ANA谱与相关疾病

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。紫外光激发荧光物质放射荧光示意图免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好

免疫组化和免疫荧光的区别[参照材料]

请问你曾经被IHC、ICC和IF所困扰过吗？作者：北京义翘神州在实验中，有没有一种感觉，就是对免疫组化(IHC)，免疫细胞(ICC)，以及免疫荧光(IF)傻傻分不清，那么今天我们就来讨论一下这三者的区别，先贴图上来以便有个大致的区分。从图中我们可以看出，免疫检测技术可以根据报告标签的不同，分为免疫化学和免疫荧光两类，而根据样品类型不同，可以分为组织和细胞检测技术。因此，才会延伸出三个相近的概念。为了更好的区分这三个概念，我们还可以根据他们的英文词根来分析一下，他们的英文名分别是免疫组织化学Immunohistochemistry (IHC)，免疫细胞化学Immunocytochemistry (ICC)，免疫荧光Immunofluorescence (IF)。词根分析： Immuno-指的是免疫技术（例如，抗体和抗原的结合） Histo-指的是组织（细胞以及它周围的细胞外基质） Cyto-指的是细胞（不包含细胞外的基质） Chemistry-在这里指的是化学检测方法（例如，颜色的变化）

Fluorescence-对被激发的荧光团的检测通过对词根的解释，相信你在心中不再迷茫了吧。这三个应用技术都属于免疫技术，都是将抗原与抗体的结合可视化，即通过一定的方法可以直接看到实验结果。而常用的方法就是化学显色和荧光显色。如果报告标签是酶促的，就是免疫化学，如果是荧光的，就是免疫荧光。其实我们纠结免疫荧光的一个原因还在于免疫荧光的英文名字Immunofluorescence (IF)，但若是写成免疫组织荧光(IHF)或是免疫细胞荧光(ICF)，那我们是不是就豁然开朗了。虽然这两个词汇在英文文献中应用的还不是很广泛，但绝对不是我自己杜撰的哦，已经有些学者在使用了，规范化应该也只是时间的问题。可能文字描述还是有些晦涩难懂，那我们就直接上图吧。先不看下面答案，仅从几张图片，你能明白哪张图代表哪种应用吗？ A免疫组织化学：兔EGFR单克隆抗体（10001-R043-50）—人胎盘

间接免疫荧光法检测抗核抗体的结果分析

间接免疫荧光法检测抗核抗体的结果分析目的探讨间接免疫荧光法（IIFA）检测抗核抗体在自身免疫性疾病（AID）患者中的结果应用分析。方法分别采用IIFA和胶乳法检测50例自身免疫性疾病患者血清样本抗核抗体（ANA）。结果IIFA法检测血清ANA的灵敏度为76%，胶乳法检测血清ANA的灵敏度为58%，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论IIFA 法检测ANA的敏感度明显高于胶乳法，提高了临床的阳性检出率。IIFA法用于ANA的筛查，阳性标本在进行滴度检测，有助于临床诊断。标签：抗核抗体；间接免疫荧光法；胶乳法 [Abstract] Objective To discuss the results of indirect immunofluorescence in detecting the antinuclear antibodies in patients with autoimmune diseases. Methods The antinuclear antibodies of serum samples of 50 cases of patients with autoimmune diseases were detected respectively by the IIFA and emulsion method. Results The difference in the sensitivity degree of ANA detected by IIFA method and emulsion method had statistical significance（76% vs 58%）（P＜0.01）. Conclusion The sensitivity degree of ANA detected by IIFA method is obviously higher than that detected by the emulsion method，which improves the positive detection rate in clinic，the application of IIFA method for ANA screening and the application of positive specimens for titer detection contribute to clinical diagnosis. [Key words] Antinuclear antibodies；Indirect immunofluorescence；Emulsion method 抗核抗体（ANA）包括细胞核的自身抗体和细胞质内的核酸和核蛋白的所有成分的自身抗体，是指哺乳动物的细胞中以细胞核为靶抗原的自身抗体的总称[1]。ANA在系统性红斑狼疮、干燥综合征、硬皮病、慢性活动性肝炎等自身免疫疾病中均呈不同程度的阳性。因此在自身免疫性疾病的临床诊断、鉴别以及评价预后中，ANA检测已成为重要的筛查指标[2]。临床上ANA检测方法较多，现阶段最常用、最有效的检测方法是IIFA法。由于不同检测方法检测灵敏性、准确性不同，往往影响到检测结果，使检测结果存在一定的差异，尤其在ANA 呈弱阳性的标本中，不同检测方法的检测成为争议的焦点。为进一步确认IIFA 法和乳胶法检测ANA的效果，进而客观评价该两种检测方法差异性，该文2015年10—12月间选取该院确诊或疑似为AID的患者50例作为观察对象，同时采用IIFA法和乳胶法检测，报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料所有标本均来自2015年10—12月到该院确诊或疑似AID的门诊和住院患者50例，男性15例，女性35例，年龄15～65岁。

免疫荧光方法

（2）实验方法（1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。（2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。（3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。（4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。（5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。（6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。（7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠

血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治

免疫荧光检测

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材 1．抗原片现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下： (1)肝印片制备：取4-8周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1周。

(2)Hep-2细胞抗原片制备：Hep-2细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。 (3)肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。 2．异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG抗体(FITC-抗人IgG抗体)有商品供应，临用时按效价稀释。 3．L PBS 4．缓冲甘油取甘油9份加PBS 1份。 5.待测血清、阳性和阴性对照血清临床标本筛选获得。 6．器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法 1．准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。 2．稀释：PBS-Tween缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。 3．加样：加样板放于泡沫塑料板上，加25μl稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。 4．温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30分钟。 5．冲洗：用烧杯盛PBS-Tween缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween缓冲液的小杯中至少1分钟。不必混摇。 6．加样：滴加20μl荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween缓冲液稀释。

常用免疫学检验技术的基本原理

常用免疫学检验技术的基本原理免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T 细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体－抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原－抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原－抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原－抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原－抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。

免疫荧光双标操作方法及注意事项

在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。

5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。免疫组化双重染色方法和步骤在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一

医学检验免疫学检验归纳总结

医学检验免疫学检验归纳总结 -标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

三大免疫结合反应直接凝集反应玻片凝集反应试管凝集反应间接凝集反应间接血凝试验胶乳凝集试验凝集反应 P47 明胶凝集试验自身细胞凝集试验抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原）间接coombs试验（血清中的游离抗原）液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法抗体稀释法方针滴定法免疫浊度测定沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳交叉免疫电泳三大标记技术一、放射免疫：放射免疫：

免疫放射：二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法光免固相抗体竞争法疫分固相抗原竞争法析类型荧光偏振免疫测定测定荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定固相酶免疫测定酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法双位点一步法竞争法 Ag 间接法双抗体夹心法竞争法捕获法其他标记技术化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术固相膜免疫测定试验IFA

免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA 免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱滤过法磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法磁性微球分离法荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：.......... 吞噬细胞...............

免疫荧光技术的实验方法及其分类

免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。

间接免疫荧光

间接免疫荧光法检测Ad-LMP2表达EBV-LMP2蛋白的活性 1 材料和仪器 293细胞大鼠抗LMP2单克隆抗体 FITC标记山羊抗大鼠IgG抗体荧光显微镜 2 检测方法 2.1 293细胞接种到24孔板中, 1.5~2.0×105个细胞/孔，37℃，5% CO2培养箱培养过夜，细胞生长成片。 2.2 每个细胞孔感染2.0×106VP供试品重组腺病毒，同时设置293细胞阴性对照孔。37℃，5% CO2培养箱培养两天，细胞完全病变。 2.3 收集293细胞。用PBS洗涤两次，重悬到100μlPBS缓冲液中，每孔10μl 涂于细胞片上，室温自然晾干。 2.4 将细胞片置于4℃丙酮中固定15分钟，PBS洗两次，室温晾干。 2.5 PBS浸泡10min，用PBS（含0.05%Triton-X100）浸泡通透25min。 2.6 用10%胎牛血清室温封闭40min。 2.6 细胞孔使用1：20 PBS稀释抗体，置于湿盒中，37℃孵育1小时。PBS洗8~9遍，保持湿润。 2.7 覆盖1：40稀释的FITC标记（PBS稀释）的羊抗大鼠IgG，置于湿盒中，37℃孵育30分钟。PBS洗8~9遍，室温晾干。(如用PBS有颗粒沉淀) 2.8 伊文氏蓝负染5分钟。超纯H2O洗3遍，室温晾干。 2.9 50%甘油封片。 2.10 显微镜下观察照相。 3 结果判定显微镜下观察阴性对照孔细胞呈红色，供试品孔细胞可以看到明显的绿色荧光，即判定为阳性。检测结果应为阳性。注：1、每一步均需晾干，细胞浓度可以比较高。 2、水洗效果要好，无盐粒子颗粒。

3、丙酮固定过夜效果较好。 PBS稀释。当然最好用封闭液直接稀释，再加一点TritonX100效果好。培养液成分太多了。而且固定之后细胞都死了，用培养液没什么意义，只要保证其pH等条件适合就好了。抗体说明书上都会有推荐的稀释倍数。上网查一下，有很多protocol。一般一比几百到一万都有，依抗体而定。可以4度过夜，这样染色效果好。二抗一般较便宜，一般1：50到1：200多。 Jdzhangwenjun525@https://www.360docs.net/doc/fa2738444.html, 1. 直接免疫荧光法测抗原（1）基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。（2）试剂与仪器 λ磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 λ荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 λ缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 λ搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） λ有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） λ荧光显微镜

(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法

荧光和化学发光免疫分析方法免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应，应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。一、免疫免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。

半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合体外抗原抗体反应又称血清学反应

免疫学检测原理

第二十一章免疫学检测原理第一部分学习习题一、填空题 1．抗原抗体反应的最大特点是_________。 2．颗粒性抗原与相应抗体结合后，可以发生_________反应；可溶性抗原与相应抗体结合后，在比例合适的情况下，可以发生_________反应。 3．细胞因子的检测可以分为_________、_________、_________三类。二、多选题 [A型题] 1．抗原-抗体反应所不具有的特征是： A．分子表面的可逆结合 B．具有高度特异性 C．出现肉眼可见的反应需要适当的比例 D．二者结合后，立即出现可见反应 E. 二者反应受电解质、酸碱度和浓度的影响 2．检测可溶性抗原不能用： A．ELISA B．单向琼脂扩散 C．直接凝集反应 D．反向间接凝集反应 E．协同凝集试验 3.不属于抗原抗体反应的是： A. 酶联免疫吸附试验（ELISA） B．锡克试验

C．抗球蛋白试验 D．放射免疫分析法（RIA） E．E花环试验 4．乳胶妊娠诊断试验属于： A．协同凝集反应 B．反向间接凝集反应 C．直接凝集反应 D．间接凝集反应 E．间接凝集抑制反应 5．下列免疫学测定方法敏感性最高的是： A．沉淀反应 B．凝集反应 C．ELISA D．放射免疫测定 E．补体结合试验 6．抗原抗体反应最适宜的PH值为： A. 5—4.5 B．4.5—5 C．5—6 D．6—8 E．8—9 7．用免疫荧光技术间接法检测组织中的抗原，应将荧光素标记： A. 抗原 B相应抗 C．抗免疫球蛋白抗体 D．抗原-抗体复合物 E．抗C3抗体 8．用ELISA双抗体夹心法检测抗原A时，固相载体的包被物是： A. 酶标抗A抗体 B．未标记的抗A抗体 C．酶标抗原A D．未标记的抗球蛋白抗体 E．酶标抗球蛋白抗体 9．用免疫荧光技术直接法检测病原微生物时，荧光素应标记在： A. 微生物上 B．抗人Ig抗体上 C．抗原-抗体复合物上 D.抗微生物抗体上 E．抗C3抗体上 10．诊断DTH的皮肤试验，在前臂内注射少量可溶性抗原后，观察时间为：

免疫荧光检测

免疫荧光技术(检测抗核抗体(ANA)得实验方案)荧光免疫技术就是以荧光物质标记得特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体得分析鉴定与定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术与荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术就是用荧光抗体对细胞、组织切片或其她标本中得抗原或抗体进行鉴定与定位检测,可在荧光显微镜下直接观察结果,称为荧光免疫显微技术,或就是应用流式细胞仪进行自动分析检测,称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定与荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(AＮＡ)为例进行实习、抗核抗体(aｎtinｕclear anｔibodｙ,ANA)又称抗核酸抗原抗体,就是一组将自身真核细胞得各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNＡ、可提取得核抗原(ＥNA)与ＲNＡ等作为靶抗原得自身抗体得总称,能与所有动物得细胞核发生反应,主要存在于血清中,也可存在于胸水、关节滑膜液与尿液中、抗核抗体实验原理以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Heｐ－2)作抗原片,将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA,就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记得抗人ＩgG抗体又可与ANA结合,在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。试剂与器材 1.抗原片现多用商品试剂。如需自行制备,方法如下: (１)肝印片制备:取4-8周龄小鼠,断颈杀死后,剖腹取肝。将肝脏剪成平面块,用生理盐水洗去血细胞,用滤纸吸干渗出得浆液。将切面轻压于载玻片上,使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干,乙醇固定,冰箱可保存1周。

(2)Hｅｐ—2细胞抗原片制备:Hｅp－２细胞就是建株得人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片,用洗涤洗去培养基。干燥后,用无水乙醇固定。 (3)肝切片制备:取小鼠肝组织作冰冻切片,厚４μl。-3０℃保存备用。 2.异硫氰酸荧光素(ＦITC)标记得抗人IgＧ抗体(FITC—抗人IｇＧ抗体)有商品供应,临用时按效价稀释。３、0、０1mｏl/Ｌ pＨ7。2 ＰBS ４。缓冲甘油取甘油9份加PＢＳ 1份、 5。待测血清、阳性与阴性对照血清临床标本筛选获得。 6。器材荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法１.准备:检查加样板,生物载片恢复室温,标记、 2、稀释:PBS－Tweｅn缓冲液稀释血清,设阴阳性对照。 3、加样:加样板放于泡沫塑料板上,加２5μl稀释后血清,至加样板得每一反应区,避免气泡、加完所有标本后开始温育。 4、温育:将生物薄片盖于加样板得凹槽里,反应开始,室温温育30分钟。 5。冲洗:用烧杯盛ＰＢＳ－Tween缓冲液流水冲洗生物薄片,然后立即将其浸入盛有ＰBＳ－Tｗeｅn缓冲液得小杯中至少1分钟、不必混摇、 6。加样:滴加20μｌ荧光素标记得抗人球蛋白(结合物)至一洁净加样板得反应区,完全加完方可继续温育。荧光素标记得抗人球蛋白用前需混匀并以PBS—Twｅen缓冲液稀释。

免疫荧光抗体检测技术

实验七免疫荧光抗体检测技术一、目的要求通过本实验，了解和掌握直接免疫荧光和间接免疫荧光染色的原理和方法，并能应用于疾病的诊断和抗原抗体的分析。二、实验原理用化学或物理的方法将荧光素标记到抗体或抗原上，这种标记荧光素的抗体或抗原仍然能与相应抗原或抗体发生特异性结合。通过已知的荧光抗体或抗原，检测样本中相应的抗原或抗体，从而进行疾病的诊断和对抗原抗体的分析。间接免疫荧光试验三、实验材料感染鸡马立克病病毒（MDV）的细胞培养物，抗MDV特异性单克隆抗体BA4;丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液，盖玻片，FITC标记的抗小鼠IgG荧光抗体，0.01mol/L PBS(pH 7.2)，蒸馏水，载玻片（洁净无油）；1000ml 烧杯，磁棒，磁力搅拌器，200μL移液器，吸水纸，镊子等。四、实验方法 1.细胞片的制备与固定将消毒并处理过的盖玻片放于细胞培养瓶（皿）中，按常规操作，制备鸡胚成纤维细胞，并培养于细胞培养瓶（皿）中，待细胞生长成单层后，接种CVI988/Rispens疫苗株。48—72h后，直接收获盖片，用PBS洗涤1次，再以-20℃预冷的丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液固定5min，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用。如用96孔或24孔细胞培养板培养的细胞，可弃去培养液，用PBS洗涤1次，然后固定，固定方法同上。 2.抗体染色 ⑴将接种并固定的MDV病毒的盖玻片，用PBS洗涤1次，置架上。取未接种MD病毒的盖玻片，同上用PBS洗涤1次，置架上，作为阴性对照。盖玻片上滴加10μL—20μL工作浓度的单克隆抗体，96孔细胞培养板加入50μL/孔工作浓度的单克隆抗体。37℃水浴孵育30—45min。 ⑵盖玻片在PBS（Ph7.4,0.01mol/L）中用磁力搅拌器洗涤5—10min，如用96孔细胞培养板检测，则加入PBS 200μL/孔，洗涤3—4次。 ⑶取出盖片置架上，滴加工作浓度的荧光抗体（FITC标记的抗小鼠IgG的抗体）。37℃孵

医学检验免疫学检验归纳总结

三大免疫结合反应直接凝集反应玻片凝集反应试管凝集反应间接凝集反应间接血凝试验胶乳凝集试验凝集反应 P47 明胶凝集试验自身细胞凝集试验抗球蛋白试验直接coombs试验（RBC膜上的不完全抗原）间接coombs试验（血清中的游离抗原）液体内沉淀试验絮状沉淀试验抗原稀释法抗体稀释法免疫浊度测定沉淀反应凝胶内沉淀试验单向扩散试验双向扩散试验免疫电泳技术对流免疫电泳 CIEP 火箭免疫电泳RIE 免疫电泳IEP 免疫固定电泳交叉免疫电泳三大标记技术一、放射免疫：放射免疫：免疫放射：

二、荧光免疫技术P81 荧时间分辨荧光免疫测定（方法）双抗体夹心法光免固相抗体竞争法疫分固相抗原竞争法析类型荧光偏振免疫测定测定荧光酶免疫测定（方法）双抗体夹心法双抗原夹心法固相抗原竞争法三、酶免疫技术 P95 酶免疫技术分类均相酶免疫测定 EMIT 克隆酶测定分析异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定固相酶免疫测定酶联免疫吸附试验ELISA （方法）Ab 双抗体夹心法双位点一步法 Ag 间接法双抗体夹心法竞争法捕获法其他标记技术化学发光免疫分析技术 CLIA 直接化学发光免疫分析CLIA P109 类型化学发光酶免疫分析CLEIA 电化学发光免疫分析ECLIA 生物素，亲和素放大技术固相膜免疫测定免疫试验IFA 免疫层析试验 ICA 膜免疫测定的种类斑点酶免疫吸附试验 DOT-ELISE 酶联免疫斑点试验 ELISPOT 免疫印迹法 IBT/EITB 放射免疫浊度试验 RIPA

免疫细胞 1、分离方法外周血单个核细胞分离 PBMC P161 淋巴细胞分离贴壁粘附法吸附柱滤过法磁铁吸引法 Percoll分离液法 T细胞和B 细胞的分离 E花环沉降法尼龙毛柱分离法 T细胞亚群分离亲和板结合分离法磁性微球分离法荧光激法细胞分离仪分离法 2、免疫细胞表面标志的检测方法抗体致敏细胞花环法 P174 免疫细胞化学法免疫荧光法 FCM 3、功能检测 T 细胞增殖试验方法形态学 P178 3H-TdR掺入法淋巴细胞 T细胞 MTT比色法 CFSE（活细胞染料） T细胞分泌功能检测 T细胞介导的细胞毒性试验体内试验 B细胞：B细胞增殖试验、溶血空斑实验、ELISPOT、体内试验 NK细胞：.......... 吞噬细胞...............

临床免疫实验间接免疫荧光法测抗核抗体实验报告

实验三、间接免疫荧光法检测血清中抗核抗体一、实验目的： 1、掌握免疫荧光法的原理。 2、掌握免疫荧光法检测过程中避免非特异荧光干扰的方法。二、实验原理：间接免疫荧光技术是利用荧光抗体标记第二抗体检测未知抗原或未知抗体（第一抗体）的方法。以检测人血清抗核抗体（ANA）为例。病人血清中ANA（Ab）能与各种系细胞核成分（Ag）特异性结合，此种结合的Ab（IgG型）能与荧光标记的羊抗人IgG（二抗）结合，在荧光显微镜下，细胞核显示荧光，提示血清中ANA的存在。三、试验材料： 0.1M，pH6.8PBS；小白鼠，待测血清，对照血清（阴性血清），羊抗人IgG荧光抗体、滴管、试管、孵箱、荧光显微镜等。四、实验步骤： 1、小鼠断颈处死取肝，NS漂洗，剪取肝横断面印片于玻片上，左右各一处，自然干燥；滴加无水乙醇固定，室温凉干； 2、左右印片处分别盖上一片小纸片，分别滴加阳性血清和阴性血清各1滴，37℃30′； 3、去除纸片，PBS冲洗1min×3次，吸干水分； 4、左右印片处分别盖上一片小纸片，并滴加荧光标记羊抗人IgG（二抗）各1滴，37℃30 5、去除纸片，PBS漂洗1min×3次，吸干水分； 6、荧光显微镜镜检。五、实验结果：荧光显微镜下观察：细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性；抗原片中出现阳性染色细胞为ANA 阳性，否则为阴性；阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。（均质型）细胞核呈均匀一致的荧光(斑点型)细胞核内呈现斑点状荧光六、实验讨论：

1、注意事项： 1）制作核抗原片（印片）不宜太厚； 2）滴加的血清或荧光抗体要充分盖满抗原片； 3）荧光抗体孵育时要注意避光; 4）染色后的片子应及时镜检，不宜放置过久。 5）注意各步骤的漂洗要充分。 2、临床意义： 1）总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的筛选试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。 2）未经治疗的、活动性SLE的阳性率为80%－100%。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。 3）干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎等。 3、间接免疫荧光法的优缺点：优点： 1)制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测 2)特异性、灵敏度高 3）快速、可定位。缺点： 1）需要荧光显微镜 2）存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题） 3）定性测定、判断结果不客观 4）制备片子难保存（荧光猝灭）

免疫荧光方法[1]

免疫荧光方法免疫荧光(Iｍｍｕnofｌｕorｅscｅｎce, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术（比如流式细胞仪)测定含量。免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等.细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步,细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Ｓｌides or Cｏverｓｌips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门,非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法,合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的.免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Wｅstern Bloｔ）中的相同步骤是类似的,最重要的区别在于免疫

荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是,标记好荧光的细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在4℃或—20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果....感谢聆听... 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像ＷB 那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨的实验对照。总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照,每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量,才能最终达到你的实验目的。...感谢聆听... 基本实验步骤：（1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中, 待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）２次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。...感谢聆听...

荧光免疫

荧光免疫分析(FIA) 荧光纳米粒子是指可以发荧光的半导体纳米微晶体（量子点）或将荧光团(Fluorophore)通过包埋、共价键连接以及超分子组装等方式引入有机或无机纳米粒子中，并让纳米粒子承担有机小分子荧光染料的检测、标记等功能。与传统的荧光染料相比，荧光纳米粒子具有更高的亮度和光稳定性，也能更加容易地实现水分散性和生物相容性。另外，随着纳米制备技术的进一步提高，对纳米粒子的尺度的精确控制及对粒子功能化手段的日臻完善，这在很大程度上使荧光纳米粒子满足了化学传感器、生物探针等领域的要求。目前荧光纳米粒子主要有无机发光量子点、荧光高分子纳米微球、复合荧光二氧化硅纳米粒子三大类。 1、量子点量子点(quantum dot, QD)又可称为半导体纳米微晶体，是由数百到数千个原子组成的无机纳米粒子，是一种由II-VI 族或者III-V 族元素组成的纳米颗粒。目前研究较多的主要是CdX(X = S、Se、Te)。量子点粒径很小，它们的电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，因此光学行为与一些大分子很相似，可以发射荧光。量子点的体积大小严格控制着它的光谱特征。量子点的晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，而表面的光激发的正电子或负电子受钝化表面的束缚作用就越大，其表面束缚能就越高，吸收的光能也越高，即存在量子尺寸效应，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰也相应蓝移。可见，相对于其他传统的荧光染料而言，量子点由于其量子尺寸效应，粒径不同或组成材料不同即可发射不同颜色的荧光。优点激发光谱宽，发射波长窄，不同粒径和组成的量子点其发射的波长不同，荧光效率高，生物兼容性好。缺点：功能化的量子点的核心成分及其表面包覆的材料存在不同程度的生物毒性，在一定程度上限制了其应用。 2、高分子荧光纳米微球高分子荧光纳米微球开始是以聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯类、聚丙烯酰胺类为微粒主体，表面键合或吸附荧光素（Fluorescein，如FITC等）、罗丹明（Rhodamine，如Rhodamine 6G）、菁色素（Cy染料）等荧光物质的荧光纳米微球。因为单个纳米粒子可以键合多个荧光分子，所以荧光强度有所增强。但由于荧光分子没有被保护在高分子材料中，仍然受外界氧化或光漂白的影响，荧光的稳定性并没有提高。 3、复合荧光二氧化硅纳米粒子复合荧光二氧化硅纳米粒子是由功能性的内核、可生物修饰的硅壳以及修饰在硅壳表面的生物分子构成，具有明显核壳结构的一类新型的纳米颗粒，其内核材料可以是有机荧光染料、稀土发光材料、量子点等。由于该类型的纳米颗粒采用油包水(W/O)反相微乳液方法成核，通过硅烷化试剂在微乳液中水解形成三维网状结构的硅壳进行包壳，所以采用不同的硅烷化试剂可以制备出表面带有不同官能团的核壳型生物纳米颗粒。通过对纳米颗粒的表面进行各种生物大分子的修饰，如：肽片断、抗体、生长因子等，可以实现对特异性细胞的识别、分离和检测。于是，复合荧光二氧化硅纳米粒子由于其具有良好的分散性、温和的合成条件、可重复合成及细胞毒性小等优点已在生物学领域得到了广泛的应用。其中稀土离子荧光纳米颗粒在生物样品体外免疫分析检测方面很有前途。在细胞成上,与目前较常用的半导体量子点相比,稀土离子荧光纳米颗粒的荧光发射波长很窄,而发光成像的空间分辨率主要受到光波衍射的限制,一般为激发或发射波长的一半,所以采用稀土离子荧光纳米颗粒有望得到更高的空间分辨率。不同的稀土离子采用相同的配体,可以具有同样的激发波长和截然不同的发射波长,这样就使得多分析物同时检测也成为可能。结合稀土离子荧光寿命长的特点,采用时间分辨检测系统还可以大大减少生物本底荧光的干扰。荧光免疫分析方法灵敏、便捷,因此得到了广泛的研究应用。以下是常用的荧光免疫物质以及其在生命科学中的应用。

免疫荧光检测

免疫荧光操作步骤及注意事项

免疫组化和免疫荧光的区别[参照材料]

间接免疫荧光法检测抗核抗体的结果分析

免疫荧光方法

免疫荧光检测

常用免疫学检验技术的基本原理

免疫荧光双标操作方法及注意事项

医学检验免疫学检验归纳总结

免疫荧光技术的实验方法及其分类

间接免疫荧光

(完整版)荧光和化学发光免疫分析方法

免疫学检测原理

免疫荧光检测

免疫荧光抗体检测技术

医学检验免疫学检验归纳总结

临床免疫实验 间接免疫荧光法测抗核抗体实验报告

免疫荧光方法[1]

荧光免疫

临床免疫实验间接免疫荧光法测抗核抗体实验报告