3M压敏胶作用原理与技术介绍

DNA测序原理和方法.

DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3''''末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA 测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10～40min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】 1．BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP 和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。 2．pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。 3．M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2μmol/L，即3.2pmol/μl，试剂盒配套试剂。 4．DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR 反应时取量1μl为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/μl。 5．引物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2μmol/L，即3.2pmol/μl。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。 6．灭菌去离子水或三蒸水。 7．0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。 8．3mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc·3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。 9．70%乙醇和无水乙醇。 10．NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11．POP 6测序胶ABI产品。

胶粘剂的基础知识

胶粘剂的定义和历史定义：胶粘剂又称粘合剂，简称胶（bonding agent, adhesive），是使物体与另一物体紧密连接为一体的非金属媒介材料。在两个被粘物面之间胶粘剂只占很薄的一层体积，但使用胶粘剂完成胶接施工之后，所得胶接件在机械性能和物理化学性能方面，能满足实际需要的各项要求。能有效的将物料粘结在一起。历史：考古学证据显示粘合剂的应用历史已经超过6000多年，我们可以看到在博物馆里展出的许多物体在经过3000多年后依然由粘合剂固定在一起。进入20世纪，人类发明了应用高分子化学和石油化学制造的“合成粘结剂”，其种类繁多，粘结力强。产量也有了飞跃发展。胶粘剂的应用和分类应用：电子，汽车，工业，化工，建筑业等各个领域都有用到胶粘剂。分类：胶粘剂种类繁多，组分各异，有不同的分类方法。 1 按化学类型分类无机胶粘剂（sauereisen的高温水泥）有机胶粘剂：分为天然胶粘剂和合成胶粘剂合成胶粘剂按化学成分主要分为：Epoxy, PU, Silicone, Acrylic, etc. 2 按物理形态分类水基型：基料分散于水中形成水溶液或乳液，水挥发而固化。溶液型：基料在可挥发溶剂中配成一定黏度的溶液，靠溶剂挥发而固化。膏状和糊状：基料在可挥发溶剂中配成高黏度的胶粘剂，用于密封和嵌缝。固体型：把热塑性合成树脂制成粒状或块状，加热熔融，冷却时固化。膜状：将胶粘剂涂于基材上，呈薄膜状胶带 3 按固化方式分类热固化：通过加热的方式使粘合剂发生聚合反应而固化，温度和时间根据不同的产品有很大区别。湿气固化：与空气中的水汽发生聚合反应达到固化。 UV固化：光引发剂紫外光照射下，形成自由基或阳离子从而引发粘合剂的聚合反应而固化。厌氧固化：在隔绝空气的条件下，发生自由基聚合反应，空气存在会阻碍聚合反应。催化固化：在催化剂作用下使粘合剂发生聚合反应达到固化。 4 按工艺分类粘合剂（Adhesive）：特殊有导电胶，导热胶，芯片的粘结。密封剂（Sealant）灌封胶（Potting & Encapsulation）敷形涂敷（Conformal Coating）底部填充胶（Underfill）顶部包封（Glob Top） 5 按受力情况（1）结构胶（2）非结构胶常见胶粘剂的固化机理 1 环氧树脂（Epoxy）固化机理：固化剂分两类：胺类及其衍生物，和酸酐类。其中胺类固化剂是与高分子链中的环氧基发生开还聚合反应，酸酐类固化剂是与高分子链上的羟基发生酯化反应，最终都是形成三维网状结构。常见的环氧树脂是：双酚A型最典型，线型甲酚型，酚醛环氧树脂等。

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用复习过程

几种常见的基因测序技术的优缺点及应用

随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以 Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到 2005 年，以 Illumina 公司的 Solexa技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年 3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过 NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着 NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用 NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过 NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。本文介绍了几种 DNA 水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。 1、第一代测序 1.1 Sanger 测序采用的是直接测序法。1977年，Frederick Sanger 等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。2001 年，Allan Maxam 和 Walter Gibert 发明了 Sanger 测序法，并在此后的 10 年里成为基因检测的金标准。其基本原理即双脱氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH，因此每当 DNA 链加入分子 ddNTP，延伸便终止。每一次 DNA 测序是由 4个独立的反应组成，将模板、引物和 4 种含有不

新一代测序技术的发展及应用前景

２０１０年第１０期杨晓玲等：新一代测序技术的发展及应用前景等交叉学科的迅猛发展。１．１第二代测序——高通量低成本齐头并进以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序¨】。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。１．１．１聚合酶合成测序法Ｒｏｃｈｅ公司推出的４５４技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Ｓａｎｇｃｒ测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。４５４采用焦磷酸合成测序法ＨＪ，避免了传统测序进行荧光标记以及跑胶等繁琐步骤，同时利用乳胶系统对ＤＮＡ分子进行扩增，实现了大规模并行测序。截止到２０１０年４月，已有７００多篇文献是采用了４５４测序技术（ｈｔｔｐ：／／４５４．ｃｏｍ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｎｄ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ａｓｐ），对该技术是一个极大的肯定。Ｉｌｌｕｍｉｎａ公司推出的Ｓｏｌｅｘａ遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的ＤＮＡ单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Ｓｏｌｅｘａ公司提出的可逆终止子”１也是该技术获得认可的原因之一。与４５４相比。Ｓｏｌｅｘａ拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Ｓｏｌｅｘａ理所当然成为第二代测序技术的首选。２００８年以来，利用该技术开展的研究大幅度上升，报道文献达４００多篇（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ／ｇｅｎｏｍｅ—ａｎａｌｙｚｅｒ＿ｉｉｘ．ｉｌｍｎ）ｏ１．１．２连接酶合成测序法２００７年ＡＢＩ公司在Ｃｈｕｒｃｈ小组拍１研究成果的基础上推出了ＳＯＬＩＤ测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码…的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分ＳＮＰ和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入４种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。目前ＳＯＬＩＤ３．０测序通量可达２０Ｇ，而测序片段仅有３５—５０ｂｐ，这使得该技术与Ｓｏｌｅｘａ相比，应用范围还不够广泛。ＡＢＩ公司正加快研发进度，争取在片段长度方面做出重大突破。ＤａｎａｈｅｒＭｏｔｉｏｎ公司推出Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ¨１测序仪同样也是基于Ｃｈｕｒｃｈ小组的研究成果，但是该设备的成本要低很多，同时用户在使用时可以根据自己的研究目的设置不同的测序条件。而ＣｏｍｐｌｅｔｅＧｅ—ｎｏｍｉｃｓ公司推出的ＤＮＡ纳米阵列与组合探针锚定连接测序法＂１则具有更高的容错能力，试剂的消耗也进一步减少，目前已顺利完成３个个体基因组的测序工作。１．２第三代测序——单分子长片段有望实现第二代测序技术虽然在各方面都有了较大的突破，但是仍然建立在ＰＣＲ扩增的基础上。为了避免ＰＣＲ扩增带来的偏差，科学家目前正在研制对ＤＮＡ单个分子直接测序的第三代测序仪。最具代表性的包括Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ单分子测序仪，单分子实时合成测序法，纳米孔测序技术等。Ｈｅｌｉｃｏｓ技术仍然是基于合成测序原理¨…，它采用了一种新的荧光类似物和灵敏的监测系统，能够直接记录到单个碱基的荧光，从而克服了其他方法须同时测数千个相同基因片段以增加信号亮度的缺陷。ＰａｃｉｆｉｃＢｉｏｓｃｉｅｎｅｅｓ公司研发的单分子实时合成测序法充分利用了ＤＮＡ聚合酶的特性，可以形象的描述为通过显微镜实时观测ＤＮＡ聚合酶，并记录ＤＮＡ合成的整个过程。纳米孔测序技术［１１’１２１则是利用不同碱基在通过纳米小孔时引起的静电感应稍有不同，或者不同碱基通过小孔的能力各有差异，来加以区分不同的碱基信号。２应用与实践Ｋａｈｖｅｊｉａｎ在２００８年的一篇综述中提到¨“：“如果你可以随心所欲地测序，你会开展哪些研究？”。人类基因组计划的完成和近年来高通量测序的兴起，使越来越多的科研工作者认识到，我们对于生物界的认识才刚刚起步。基因图谱的绘制并不意味着所有遗传密码的破解，癌症基因组的开展也没有解决所有的医学难题。ＤＮＡ变异的模式和进化机制，基因调控网络的结构和相互作用方式，复杂性状及疾病的分子遗传基础等，仍是困扰生物学家和医学家的难题，而高通量测序的广泛应用，也许可以让我们知道的更多。２．１ＤＮＡ水平的应用２．１．１全基因组测序新一代测序技术极大地推

胶粘剂基本知识

一，胶粘剂的分类二，1、按基体材料分：合成胶粘剂热固性树脂胶粘剂：环氧树脂胶，酚醛树脂胶，聚氨酯胶，氨基树脂胶，不饱和聚酯胶，有机硅树脂胶，杂环聚合物胶三，热塑性树脂胶粘剂：丙烯酸酯胶，聚醋酸乙酯胶，聚乙烯醇胶四，橡胶胶粘剂：氯丁橡胶，丁腈橡胶，聚硫橡胶，硅橡胶，丁苯橡胶五，特种胶粘剂：热熔胶，密封胶，压敏胶，导电胶等六，无机胶粘剂：磷酸盐胶粘剂，硅酸盐胶粘剂七，天然胶粘剂：植物胶：淀粉胶、糊精胶、阿拉伯树胶和松香胶八，动物胶：虫胶和皮骨胶九，矿物胶：沥青胶、地蜡胶和硫磺胶十，2、按应用分：结构胶、非结构胶和特种胶，其中，结构胶要求受力部件的胶接头承受应力和被粘物相当或接近。十一，十二，二，胶粘剂的组成十三， 1 、胶粘剂：又称粘合剂、接着剂，将经过表面处理的两个或两个以上胶粘材料牢固地连接在一起，并且具有一定力学强度的化学性质。例如，环氧树脂、磷酸一氧化铜、白乳胶等。十四，2、固体材料（基料）：决定胶接头的主要物理化学力学性能。例如，环氧树脂和酚醛树脂等。十五，3、固化剂：十六，a) 固化：液体的胶粘剂通过物理化学方法变成固体的过程。物理方法有溶解挥发、乳液凝聚、熔融体冷却；化学方法使胶粘剂聚合成高分子物质。十七，b) 固化剂：固化过程所使用的化学物质。十八，4、固化促进剂：能促进固化反应速度，缩短反应时间的化学物质，又称催化剂。十九，5、增韧剂：能提高胶粘剂固化物的韧性，主要是酯类和弹性化合物。二十，6、填料：能提高接头的力学强度。二十一，7、其它辅助材料：着色剂、溶剂（稀释剂）、防老剂和偶联剂等。二十二，二十三，三，胶粘剂的选择二十四，1、选择胶粘剂的原则二十五，（1）考虑胶接材料的种类性质大小和硬度；二十六，（2）考虑胶接材料的形状结构和工艺条件；二十七，（3）、考虑胶接部位承受的负荷和形式（拉力、剪切力、剥离力等）；二十八，（4）考虑材料的特殊要求如导电导热耐高温和耐低温。二十九，2、胶接材料的性质三十，（1）金属：金属表面的氧化膜经表面处理后，容易胶接；由于胶粘剂

三代测序原理技术比较

导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA 合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为 sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

三代测序原理技术比较

三代测序技术和原理介绍导读从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中

分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。

picbio三代测序原理

三代测序之PacBio SMRT技术全解析 2017-05-11 11:29 来源:基因谷技术气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~ 在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。今天小编要来和你分享： PacBio SMRT测序那些事儿~ 测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢？今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT测序平台。 PacBio SMRT测序原理 Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部 4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行 PacBio SMRT测序原理 PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的？我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。 SMRT Cell含有纳米级的零模波导孔，每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链进行单分子测序，并实时检测插入碱基的荧光信号。ZMW是一个直径只有10~50 nm的孔，当激光打在ZMW底部时，只能照亮很小的区域，

焦磷酸测序技术的原理

Pyrosequencing技术的原理 Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下：第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS和Luciferin）。第2步：向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。第2步图示(图片来自互联网) 第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。第3步图示(图片来自互联网) 第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyrase的作用下发生降解。第4步图示(图片来自互联网) 第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

第4步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing技术操作简单，结果准确可靠，可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。 →如果您认为本词条还有待完善，请编辑词条上一篇SNP（单核苷酸多态性）下一篇阅读质粒图谱具体事例【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录标记上特异性标签，PCR后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量PCR法对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP可以同时准确测定同一基因在3个不同来源中的表达量，并实际测定了Egr1基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。【关键词】序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达 1 引言差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用于检测基因表达水平的技术主要有SAGE法[1]、实时荧光定量PCR法[2,3]和基因芯片法[4]等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等缺点。焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析，考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的差异表达。 2 实验部分仪器、试剂与材料

picbio三代测序原理

p i c b i o三代测序原理 Revised by Jack on December 14,2020

三代测序之PacBio SMRT技术全解析 2017-05-11 11:29 来源: 气温回升，天气渐暖，花儿开了一簇又一簇~ 在这美好的季节里，我们准备聊点新话题。今天小编要来和你分享： PacBio SMRT测序那些事儿~ 测序技术在近几年中又有里程碑的发展，Pacific Biosciences公司成功推出商业化的第三代测序仪平台，让三代测序正式走入我们的视线。与前两代相比，第三代测序有什么不同呢今天小编带大家详细了解测序界新宠-PacBio SMRT 测序平台。 PacBio SMRT测序原理 Pacific Biosciences公司研发的单分子实时测序系统（Single Molecule Real Time，SMRT）应用了边合成边测序的原理，并以SMRT芯片为测序载体。基本原理如下：聚合酶捕获文库DNA序列，锚定在零模波导孔底部 4种不同荧光标记的dNTP随机进入零模波导孔底部荧光dNTP被激光照射，发出荧光，检测荧光荧光dNTP与DNA模板的碱基匹配，在酶的作用下合成一个碱基统计荧光信号存在时间长短，区分匹配碱基与游离碱基，获得DNA序列酶反应过程中，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落聚合反应持续进行，测序同时持续进行 PacBio SMRT测序原理 PacBio SMRT的单分子测序和超长读长是如何实现的我们重点看一下该技术的两点关键创新：分别是零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）和荧光标记在核苷酸焦磷酸链上（Phospholinked nucleotides）。

三代测序

第一代测序技术 1977年，Sanger发明的DNA双脱氧核苷酸末端终止测序法（chainter?minatorsequencing）和A.M.Maxam和W.Gilbert 报道的DNA化学降解测序法(chemicaldegradationse?quencing)为代表的第一代测序技术诞生，但由于化学降解法的程序复杂，后来逐渐被Sanger测序法代替。 Sanger测序法原理：双脱氧核苷酸没有3′-OH，且DNA聚合酶对其没有排斥性。当添加放射性同位素标记的引物时，在聚合酶作用下ddNTP被合成到链上，但其后的核苷酸无法连接，合成反应也随之终止，后续再根据各个合成片段的大小不同进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影后，便可根据片段大小排序及相应泳道的末端核苷酸信息读出整个片段的序列信息。通过调节加入的dNTP和ddNTP的相对量即可获得较长或较短的末端终止片段。一代测序的特点：速度快，但是一次只能测一条单一的序列，且最长也就能测1000-1500bp。所以被广泛应用在单序列测序上。在小型的细菌基因组测序、质粒测序、细菌人工染色体末端测序、突变位点验证等研究领域中较为常见。第二代测序技术第二代测序技术也称为新一代测序技术NGS(Next Generation Sequencing)，相比第一代测序技术，总体往高通量、低成本方向发展。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing by Synthesis），即通过捕捉新合成末端的标记来确定DNA的序列。其特点是能一次并行几十万到几百万条DNA分子的序列测定，且一般读长较短。通过物理或是化学的方式将DNA随机打断成无数的小片段（250-300bp），之后通过建库）富集了这些DNA片段。接下来将建完的库放入测序仪中测序，测序仪中有着可以让DNA片段附着的区域，每一个片段都有独立的附着区域，这样测序仪可以一次检测所有附着的DNA序列信息。最后通过生物信息学分析将小片段拼接成长片段。第二代测序技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/HiSeq/MiSeq、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。 1、Illumina原理：桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像主要步骤： ①DNA文库制备——超声打断加接头 ②Flowcell——吸附流动DNA片段 ③桥式PCR扩增与变性——放大信号 ④测序——测序碱基转化为光学信号 2、Roche454 油包水PCR+4种dNTP车轮大战+检测焦磷酸水解发光 ①DNA文库制备——喷雾打断加接头 ②乳液PCR——注水入油独立PCR ③焦磷酸测序——磁珠入孔，焦磷酸信号转化为光学信号 3、IonTorrent原理油包水PCR+4种dNTP车轮大战+微电极PH检测 ①DNA文库制备——喷雾打断加接头 ②乳液PCR——注水入油独立PCR ③微电极pH检测——磁珠入池记录pH

MARSI相关知识

MARSI （医用胶粘剂相关性皮肤损伤ｍｅｄｉｃａｌａｄｈｅｎｓｉｖｅｒｅｌａｔｅｄｓｋｉｎｉｎｊｕｒｙ） 1. 定义：在移除医用胶粘剂后，局部出现的持续30分钟甚至更长时间的红疹和/或其他皮肤异常，包括但不限于水疱、大疱、糜烂或撕脱等（专家共识） 2. 分类：机械型（表皮剥脱、张力性损伤或水疱、皮肤撕脱）、皮炎型（刺激性接触性皮炎、过敏性皮炎）、其他型（浸渍、毛囊炎） 3. 4. 评估 a) 一般评估：使用含胶粘剂的医疗用品期间，应每日对皮肤损伤进行评估或在更换胶粘装置时进行评估，尤其是MARSI 的高风险患者。对于所有与医用胶粘剂相关的皮肤损伤，应进行全面评估，以确定损伤严重程度并指导相关伤口治疗 b) 敏感性评估：详细评估患者既往已知或疑似过敏史，以最大限度地降低出现MARSI 的风险。与胶粘相关的过敏性接触性皮炎的发生率尚不清楚；对于疑似过敏性接触性皮炎，应立即考虑转诊或进行过敏试验（如斑贴试验或过敏性试验） 5. 预防 a) 一般措施：识别MARSI 高风险的患者是预防此类损伤的关键。因此需要进行有效的皮肤保护，预防医用胶黏剂对皮肤的伤害，提供标准化的护理流程。同时提供良好的营养和水分有利于预防与医用胶粘剂相关的皮肤损伤

b)医用粘胶的选择和应用：根据预期用途、解剖位置、胶粘剂的种类以及使用部位的皮肤条件，选择最为适宜的胶粘产品。适用的产品选择必须考虑含胶粘的产品的各种特性，如胶粘温和程度、透气性、拉伸性、舒适度和柔软性。使用有机硅胶粘剂固定某些装置时必须慎重小心，原因是相关操作可能导致粘附不牢或粘附失败。在选择和使用医用胶粘产品时，需要对受伤、手术或其他处理后可能发生的皮肤变化和/或关节移动进行预测，以及对水肿部位的皮肤移动进行预测。 c)医用粘胶产品与兰格氏线（Langer’sLine）：兰格氏线是皮肤下循着真皮纤维方向所形成的天然张力线，是皮下的自然纹路。在使用医用胶粘剂的过程中，需要考虑医用胶粘产品与兰格氏线平行、相对及相跨造成的影响 d)其他：使用胶粘产品之前，如要使用皮肤阻隔剂要慎重考虑。一般限制或避免使用诸如复方安息香酊等提高胶粘剂粘性的物质，同时考虑使用医用胶粘去除剂以最大限度降低不适感和与胶粘产品移除相关的皮肤损伤。为预防胶粘剂电极下发生的电化学灼伤，应对电动设备（电池和线电压）进行维护和监测，以避免发生漏电的危险。胶粘可能促进微生物的过度生长，因此需要对暴露于胶粘剂材料的部位进行感染监测。 6.治疗 MARSI的治疗应采用基于证据的伤口护理原则。如MARSI保守治疗7天无效或伤口恶化，应咨询皮肤或伤口治疗师进行会诊。由于目前针对MARSI的治疗的临床研究较少，尚未形成统一，系统的指南和标准，因此有必要进行深入的研究以指导临床工作。（注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）

胶粘剂基础知识简介

胶粘剂基础知识简介来源：中国玻璃钢综合信息网本文主要介绍复合树脂胶粘剂的组成、性能和特点，研究胶粘剂在光学加工研磨抛光材料中的应用。 1、前言光学加工高效生产用研磨抛光材料的超精磨片、抛光片，是用于光学零件研磨及抛光的工艺性材料。其基本组分分别以金刚石微粉或氮化硼、碳化硼微粉及氧化铈或氧化铁抛光粉为磨料，加入无机填料及其他助剂，借助胶粘剂将其粘接起来，并经冷压成型后固化处理，使其成为具有一定形状的研磨抛光材料。胶粘剂在研磨抛光过程中起粘接支撑磨料的作用。稳定、持续的研磨抛光能力，除与光学加工铣磨以及超精磨工艺、抛光工艺的成熟和所达到的精度相关外，粘接研磨抛光材料使用的胶粘剂及用量最为重要。其用量又与胶粘剂的形态有关。借助溶剂配制成胶粘剂溶液，才有可能在研磨抛光材料中用较少量的胶粘剂，并做到使胶液均匀地分散、制作出表观质量和使用性能都好的超精磨片和抛光片。 2、胶粘剂及其形态的选择胶粘剂的选择与用量的确定，主要依据以满足成型的加工工艺要求，并赋予研磨材料一定的强度、耐磨性、自锐性和硬度等性能进行选择。胶粘剂用量与胶粘剂的形态有关，如用固体粉末或黏稠态的胶粘剂，必须加入较多的胶才能满足成型料的配制及成型加工工艺，以制得质量较好的超精磨片和抛光片。通过多年的经验总结，研磨材料使用的胶粘剂，用单组分环氧树脂胶或热塑性酚醛树脂较好;抛光材料使用的胶粘剂以热塑性酚醛树脂或天然的紫胶树脂，并借助适当的溶剂配制成胶粘剂溶液使用比较合适。 2.1环氧树脂胶粘剂作为研磨抛光材料胶粘剂的环氧树脂，主要是双酚A缩水甘油醚型。为了提高磨料和填料在超精磨片及抛光片中的填充量和分散性，一般是用黏度低、流动性好的液体环氧树脂，并使用反应热小、适用周期长、毒性低的固化剂。在环氧树脂胶料中添加钛偶联剂后，能显著降低磨料和填料造成的高黏度，并进一步提高成型料中磨料和填料的填充量和分散性。但上述环氧体系仅能采用浇铸成型工艺。从研磨抛光材料的工艺性能来看，其树脂含量仍偏高，温度特性变化大、弹性高、自锐性能差，加工的抛光材料不能做到清水抛光，仅可用作高速抛光的抛光膜层材料。为改善制品的成型性能，改用了潜性固化环氧树脂。即由液体环氧树脂、潜性固化剂、促进剂等配制而成的单组分胶粘剂。使用前用丙酮稀释至一定浓度再配制研磨抛光材料，用较少的胶就可以达到较好的粘接效果。另外，采用冷压成型工艺加工的超精磨片或抛光片较浇铸成型的制品受温度的影响小、尺寸稳定性好、自锐性能好，加工的抛光片可以做到清水抛光。潜性固化剂在常温下短时间不溶于环氧树脂及常用有机溶剂中，提高温度才能使其逐渐溶解于环氧树脂中，并随之开始交联固化。

新一代高通量测序技术SOLiD简介

新一代高通量测序技术SOLiD简介目前市场上有四种高通量测序仪，分别是Solexa，454 (GS-FLX)，SOLiD和Polonator。根据测序原理，它们可以被分为两大类：使用合成法测序(Sequencing by Synthesis)的Solexa和454，及使用连接法测序(Sequencing by Ligation)的Polonator和SOLiD。这些高通量测序仪的共同点是不需要大肠杆菌系统进行DNA模板扩增，且测序所得序列较短：其中的454序列最长，为200～300个碱基，其余三种序列都只有几十个碱基。测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用领域。这就要求我们在熟悉各种高通量测序仪内在技术特点的基础上进行选择。基因组所引进的SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)是ABI（Applied Biosystems）公司生产的高通量测序仪。目前这台SOLiD运行稳定，SOLiD实验及数据分析小组也可以为大家提供专业的技术服务。所以接下来的关键是如何把SOLiD测序仪应用到符合其技术特点的科研项目中。本短文将简单介绍SOLiD测序流程，双碱基编码原理及数据分析原理，以帮助大家了解SOLiD测序仪的技术特点和应用范围。 1.SOLiD关键技术及其原理 SOLiD使用连接法测序获得基于“双碱基编码原理”的SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。 1.1. SOLiD文库构建使用SOLiD测序时，可根据实际需要，制备片段文库(fragment library)或末端配对文库(mate-paired library)。简单地说，制备片段文库就是在短DNA片段（60～110 bp）两端加上SOLiD 接头（P1、P2 adapter）。而制备末端配对文库，先通过DNA环化、Ecop15I酶切等步骤截取长DNA片段（600bp到10kb）两末端各25 bp进行连接，然后在该连接产物两端加上SOLiD接头。两种文库的最终产物都是两端分别带有P1、P2 adapter的DNA双链，插入片段及测序接头总长为120～180 bp。 1.2:油包水PCR 我们知道，文库制备得到大量末端带P1、P2 adapter但内部插入序列不同的DNA双链模板。和普通PCR一样，油包水PCR也是在水溶液进行反应，该水相含PCR所需试剂，DNA模板及可分别与P1、P2 adapter结合的P1、P2 PCR引物。但与普通PCR不同的是，P1引物固定在P1磁珠球形表面(SOLiD将这种表面固定着大量P1引物的磁珠称为P1磁珠)。PCR反应过程中磁珠表面的P1引物可以和变性模板的P1 adapter负链结合，引导模板合成，这样一来，P1引物引导合成的DNA链也就被固定到P1磁珠表面了。油包水PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。其关键技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR 反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反应，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反应结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。A BI公司提供的SOLiD 实验手册已经把小水滴体积及水相中DNA模板和磁珠的个数比等重要参数进行了技术优化和流程固定，尽可能提高“优质小水滴”(水滴中只含一个DNA模板一个P1磁珠)的数量，为后续SOLiD 测序提供只含有一种DNA模板扩增产物的高质量P1磁珠。

三代基因组测序技术原理(简介)

三代基因组测序技术原理简介【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

一代至四代测序技术详细讲解

一、我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时，却成为限制其广泛应用的一个障碍。 1980年，英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖，至今已有近三十年了。在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。在过去几年，应用极为广泛的毛细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式，它运用尖端的荧光成像技术进行碱基识别。上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角，也使实验研究达到一个新的水平。学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨，与此同时，人们却发现这些技术存在一定的不足——大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应用，并降低了其市场价值。过去，研究人员使用Applied Biosystems（ABI）公司的3730XL毛细管电泳测序仪进行基因分析，每年至多能完成六千万碱基的测序量。随着测序技术日新月异的发展，这种情况已经成为历史。在2005年刚刚开始进行新一代测序技术开发时，Roche公司和454公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上述提及的ABI仪器速度的50倍之上。也就是从那时起，因基因数据过多而产生的问题凸显了出来，而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈加严重。举个例子，ABI的新一代测序平台SOLiD（supported oligonucleotide ligation and detection）单次运行，便可以分析6Gb的碱基序列；而Roche/454测序仪单次运行可以将上述结果转换成12-15个千兆字节（gigabytes）的数据信息；Illumina Genome Analyzer（GAII）测序系统仅在两个小时的运行时间里，就得到10兆兆字节（terabytes）的信息。尽管对于像Applied Biosystems这样的制造商而言，可以为用户提供高达11.25TB的存储量，但对于多数实验室所具有的信息管理系统来说，规模如此庞大的数据信息，就好像是迎面而来的洪水，让人感到难以控制。过量信息所带来的一个副作用在于，用户无法将初始图像数据进行分类存档，而必须交给相关公司，利用软件对数据进行读取，然后才能对数据进行保存。对于大多数研究人员来说，像这样在每次实验后对原始数据进行处理的方式既繁琐又不经济。与花费上万美元对每一段序列进行备份分析相比，对每一次测序结果进行重新测定显然是一个更简单、更便宜的选择。测序仪制造商称，对原始数据再次进行分析并不能得到更多新的信息。但是，对于454测序仪而言，用户至少可以通过更新的软件从原始数据得到质量更高的序列，从而提高碱基识别分辨率，减少误差。除数据处理问题之外，研究人员还需要拥有一个足够强大的计算机平台，以便将来自多个测序技术的短小基因片段进行组合，形成基因组外显子。目前问题在于，测序仪生产商仅仅提供用于某些特定基因信息分析的软件，如靶标重测序、基因表达分析、染色质免疫沉淀反应或基因组从头测序等，而并未提供任何其它类型的下游生物学信息分析软件。研究界越来越熟悉这些测序平台对循证生物学的巨大潜力，这也就产生了新的研究问题以及全新类型的试验方法，而这单凭依赖目前的生物学信息是无法满足的。从这个角度看，SOLiD软件研发公司（https://www.360docs.net/doc/fc17274625.html,/gf/）于今年七月刚刚兼并了两个新的软件公司，这一举动无疑朝正确的方向迈进了一步。该公司在开放源码许可证下开发软件分析工具，目的就是为了给生物信息学领域提供支持，并为其开发新的算法。对用户而言，如果能够将数据格式与不同测序平台获得的结果进行比较所得的统计数字进行标准化，无疑具有重大的意义。特别是由于目前以测序平台为核心的市场竞争激烈，因此每个生产商都努力提供最好的数据结果。