western-blot常见问题及解答

常见问题及解答：

1、两快玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平

1) 你的玻璃洗干净没有应该要洗得非常干净！

2) 过硫酸铵和TEMED的加量不合适，加量相对较多，凝胶凝固过快也会胶不平，最多按照分子克隆加倍

3) 加完试剂以后没有很好的摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平；

4) 稍微注意手法，均匀加入

5) 灌胶后应该用水或者正丁醇压胶面或用20%的乙醇封顶(没有毒性可以除气泡，使用效果极好）。战友小新723认为：“第一天灌胶后，用乙醇直接压，待乙醇挥发完毕后，上面加一层水，第二天电泳用，效果很好。不用正丁醇，乙醇比正丁醇效果要好多了”。

6) 边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加无水正丁醇覆盖，浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶，另外还可以在压顶试剂如正丁醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度7) 温度也是影响胶聚合的重要因素，我们有些同学为了让胶更快的凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，造成胶聚合不均匀。

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2、胶为什么总是漏

1）每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75％酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。

2）避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方

3）关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了

4）胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。

5）下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用

6）玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的

7）你可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。

8）因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力，一般不会再漏。9）先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部，或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话，经常会漏胶

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3、条带跑得比正常的窄

1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀

2）是不是有窄有宽可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。

3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不一致

4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致

5）可能是系统的ph出了问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液看看，看是否能成功。

4、为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢

1）"微笑"是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象

2）书上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。

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3）样品中盐浓度过高点样量太多或每孔点样量不均匀电泳电压不稳定或过高

、Western-blot 制胶时好多泡泡怎么办

1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。

2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，迅速插梳子。

3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！

4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快，而且不容易产生气泡，不妨试试

5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！

6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。

7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。

8)pinghw 还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。

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6、atgc 战友的个人经验，一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题：1 ）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水，检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。确认不漏水后，倒出水，然后使其尽量流出，其实残留的一

点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部分加样孔的条带歪曲。

2）制胶时最好最后加入AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入AP，混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。

3 ）进口的AP可以很快使胶凝聚。所以，AP的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝

胶。也不会使操作变得手忙脚乱。

4）有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加样孔的口封住了，如果用20ul的加样器加样的话，这层凝胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。

5）薄膜原因可能是由于梳子和 slide的厚度不是十分一致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳子的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不一致，结果不好。

6）wangjun2002274 主任的：加样的时候也是用专门的微量进样器，是宁波出的，50ul容量，每次都是用20ul的上样量。以前等胶干后拔出梳子，马上用水冲洗进样孔，就是用的那种塑料瓶挤压冲洗，薄膜就没有了，注意不要用力过猛，如果胶还没有完全凝，很可能导致进样孔不整齐，那么跑出来的条带就有窄有宽了

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Bradford法测定蛋白质浓度

1、分别在各个玻璃试管中加入一定浓度的BSA（5，10，15，20，25，30，40，60，80，100μl），以 NaCl溶液补足100μl，同时以100μl的 NaCl作空白对照。

2、每管加入5ml考马氏亮蓝溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。

3、用1cm光径的微量比色检测A595，取A595吸光度值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，用Excel求出标准方程。

4、将在第一部分抽提的蛋白质样品以1:250稀释：即取抽提液，于25ml容量瓶中，以%NaCl 溶液稀释至刻度。

5、取100μl稀释后的样品，加入同样体积的考马氏亮蓝溶液5ml，摇匀，室温静置2分钟，以空白管调零比色，将吸光度值代入标准方程，算出样品的蛋白质浓度。

注：

1、加1ml考马斯亮蓝溶液可制定的标准曲线可定量1-10μg蛋白质。

2、加5ml考马斯亮蓝溶液可制定的标准曲线可定量10-100μg蛋白质。

3、根据所测的样品蛋白质浓度，将蛋白质浓度调整到10μl中含蛋白质的量为25-50μg，以便于SDS-PAGE时上样。