稻瘟病菌转录因子MoMsn2的定位分析及其相关基因的功能研究

植物保护论文：全省稻瘟病菌无毒基因鉴定及分析

全省稻瘟病菌无毒基因鉴定及分析 摘要：为了明确无毒基因在吉林省不同稻区的分布及变异情况，将PCR检测技术与接种鉴定技术相结合，分析2014年吉林、长春、通化、四平、延边、松原、白城、辽源等稻区的24株优势单孢菌株中无毒基因的情况。结果表明，24个优势稻瘟病菌株含无毒基因的比率较高，5个稻区的优势菌株100%含有无毒基因，松原稻区1株优势菌株PCR检测到无毒基因，但对[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]单基因品系IRBL9-W仍有致病性，说明该菌株无毒基因结构发生了变化，其他PCR结果均与接种结果相一致。 关键词：稻瘟病；抗病基因；无毒基因；；接种鉴定；PCR检测 稻瘟病是世界范围内的主要水稻病害之一。在我国各水稻栽培地区均经常发生稻瘟病，吉林省也是稻瘟病经常流行的主要地区，如果不防治可导致稻谷损失30%以上，局部田块甚至出现绝收的情况[1]。稻瘟病的病原为稻巨座壳（Magnaporthe oryzae B.C.Couch），隶属于子囊门巨壳属。其无性阶段为稻梨孢（Pyricularia

oryzae Cavara），属于子囊菌无性型梨孢属。稻瘟病是完全符合基因对基因假说的病害[2-3]，稻瘟病的发生程度取决于田间菌群的无毒基因类型，当种植的水稻所含抗瘟基因与田间菌群所含的无毒基因相对应时，水稻则表现抗病；若水稻的抗病基因与菌群的无毒基因不对应，则表现感病，在适宜的气候条件下极易造成灾变。种植抗瘟品种是防治稻瘟病最经济有效的方法，但一个抗病品种在推广3～5年后就失去对当地稻瘟病菌的抗性[4]，主要是由稻瘟病菌变异及其上升为优势菌群所致。引起稻瘟病菌变异的因素很多[5-10]，但田间稻瘟病致病性的变异实质是田间无毒基因功能的缺失或获得[11]。吉林省是优质粳稻主产区，粳稻种植面积超过70万hm2[12]，稻瘟病的控制对我国优质米的保障尤为重要。 截至2015年3月，已至少报道了69个抗稻瘟病位点共84个主效基因，其中24个基因已被成功克隆[13]，抗瘟基因中[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]抗谱较广，对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出很高的抗性[14]，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi9[WTBZ][STBZ]对应的无毒基因已被克隆[15]，因此明确吉林省稻瘟病菌无毒基因分布情况对吉林省稻区水稻品种布局具有较好的指导意义。

稻瘟病

稻瘟病(Rice blast) 1637 年（明朝末年）我国最早做了记载，“天 工开物”中作了记述，称为稻热病（发 炎火）。全世界85个国家报道发现此 病；我国各稻区均有发生，以南方各省 受害较严重。流行年份一般减产 10-20％。我省闽西北山区发生严重，沿 海地区则轻。我省70年代初期和80 年 代初期都曾遭受稻瘟病造成的毁灭性损 失，1981年我省稻瘟病大流行，绝收面积达114000亩，损失稻谷4000万(1.5亿，二个数据差别大)公斤。从1989年开始我省的稻瘟病又普遍发生，其流行趋势已日益引起普遍关注。1993年安徽发生严重，损失稻谷约2亿公斤。 关键字搜索: 症状病原侵染循环发病条件防治措施 一. 症状(Symptoms) 稻瘟病苗瘟症状水稻苗叶瘟症状

稻瘟病节瘟症状稻瘟病谷粒瘟症状 稻瘟病穗颈瘟穗部症状 根据发生时期和部位的不同，分别称为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等；其中叶瘟发生最普遍、最容易识别，而穗颈瘟造成的损失最大。叶瘟在早稻的分蘖－拔节期为发病高峰期，有４种症状类型： 1. 普通型（慢性型）：病斑梭形，二端有沿叶脉方向延伸的黄褐色坏死线；病斑共有三层，中央是灰白色的崩溃部（区），外缘有明显的褐色坏死部（区）， 最外层是黄色晕圈－中毒部（区），潮湿时在叶背 可见到灰绿色霉层。三部一线是识别稻瘟病的关 键。 2. 急性型：病斑圆形，水渍状，正反两面都密生 灰绿色霉层，这种病斑多发生在病害流行期，往 往是病害大流行的症兆。即表明水稻品种是高度感 病的，病菌生理小种对该品种的致病力很强，气候 条件也有利于发病。病斑可转为慢性型。

水稻稻瘟病菌基因组中疏水蛋白的分布与聚类分析

分子植物育种，2009年，第7卷，第5期，第978－984页 Molecular Plant Breeding,2009,Vol.7,No.5,978－984 研究报告 Research Report 水稻稻瘟病菌基因组中疏水蛋白的分布与聚类分析 吴毅歆1,2范成明3何月秋1* 1云南农业大学农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室,昆明,650201;2云南省农业科学院经济作物研究所,昆明,650205;3中国农业科学院作物科学研究所,北京,100081 *通讯作者,heyueqiu@https://www.360docs.net/doc/024762096.html, 摘要病原菌中的疏水蛋白在病原菌与寄主植物互作的过程中起着重要的作用。本研究利用BLAST工具从NCBI数据库公布的58个疏水蛋白序列中筛选得到18条稻瘟病病原菌基因组中具有潜在疏水蛋白功能的ORF，选取其中的11条ORF设计特异引物，检测其在17个稻瘟病病原菌中的分布状况。同时，利用序列比对工具Clustal X和Mega3.0软件的邻接法，对筛选的58条已知疏水蛋白序列构建疏水蛋白的系统进化树。研究结果表明：经PCR检测，在11对引物中有4对引物高度专一且所得片断与预期大小基本一致，6对引物扩增不特异，1对引物扩增无特异条带。通过系统进化树分析得知，疏水蛋白间的平均分离度为0.62，筛选的58条疏水蛋白可分为两大类：ClusterⅠ和ClusterⅡ，分别与真菌疏水蛋白Ⅰ型和Ⅱ型相对应；所有的担子菌、稻瘟菌和绿僵菌中的疏水蛋白构成ClusterⅠ，其它真菌的疏水蛋白构成ClusterⅡ。本试验的研究将为进一步明确稻瘟病病原菌中的疏水蛋白分布状况，以及相关基因的功能验证奠定基础。 关键词稻瘟病菌,疏水蛋白,系统进化,特异PCR,聚类分析 Distribution and Clustering Analysis of Hydrophobins in the Whole Genome of Rice Blast Fungus Magnaporthe Grisea Wu Yixin1,2Fan Chengming3He Yueqiu1* 1Key Laboratory of Agricultural Biodiversity and Pests Control,Ministry of Education,Yunnan Agricultural University,Kunming,650201;2Cash Crop Research Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kumning,650205;3Institution of Crop science,Chinese academy of Agricultural Science,Beijing,100081 *Corresponding author,heyueqiu@https://www.360docs.net/doc/024762096.html, DOI:10.3969/mpb.007.000978 Abstract Hydrophobins play an important role in the interaction of pathogenic bacteria and its host plants.In this research,We acquired18ORFs with potential hydrophobin function in the whole genome of Magnaporthe grisea which screened from58hydrophobin sequence from NCBI database by using BLAST tool,and11ORFs of which was chosed to design specific primers,then we detected the distribution of these primers in17rice blast fungus.At the same time,we also reconstructed the phylogenic tree of58hydrophobin sequences by using N-J of Clustal X and tested bootstrap of Mega3.0.The results showed that there were11primers were detected by PCR and4of which obtained specific bands which consistent with the anticipation,6of which had no specific band,1primer without any specific band.The results of phyletic evolution analyzed showed that average disparity index(DI)a-mong hydrophobin was0.62,and58hydrophobins were divied into two ClusterS:Ⅰand ClusterⅡ,which accord with classⅠand classⅡof fungal hydrophobins,respectively.All the hydrophobins from the fungi of Basidiomy-cotina,M.grisea and M.anisopliae belongs to ClusterⅠ,the other fungal hydrophobins belongs to ClusterⅡ.At last our research would lay a foundation for further clarifying the distribution of M.grisea and for validating the function of its related genes. Keywords Rice blast fungus(Magnaporthe grisea),Hydrophobin,Phyletic evolution,Special PCR,Cluster analysis https://www.360docs.net/doc/024762096.html,/doi/10.3969/mpb.007.000978 基金项目:本研究由农业部948项目(2006－G61)和国家863计划项目(2002AA245041)共同资助

SOE―PCR在稻瘟病菌基因敲除中的应用

SOE―PCR在稻瘟病菌基因敲除中的应用 摘要：稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起大幅度减产。稻瘟病菌具有许多植物病原真菌侵染循环的重要特点，其侵染过程、致病机理和其中伴随的基因行为在致病真菌中具有典型性。本文综述了SOE-PCR技术的原理及其在稻瘟病菌基因敲除方面的应用情况，并指出此技术中要注意的问题，展望了其在稻瘟病研究中的应用前景。 关键词：重叠延伸PCR，稻瘟病菌，基因敲除技术 1.SOE-PCR技术的原理 重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR）[1，2]，是一种采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在接下来的反应中通过重叠链的延伸，将来源不同的扩增片段重叠连接起来且不需要内切酶消化和连接酶处理的技术，该技术在敲除基因片段上具有很大的优势。 2.SOE-PCR技术在稻瘟病菌研究中的应用 从稻瘟病菌数据库中选取想要敲除掉的致病基因，并获得该基因的上、下游基因序列。以一段带有潮霉素标记的基因序列来代替欲敲除基因。SOE-PCR 是将不同来源的两个基因或DNA 片段拼接起来构成融合基因的方法。两段基因的

引物其中有两条是常规的引物，两外两条引物是特殊设计的，其序列上一端与自身的目的片段互补，另外一端却是另外一段目的基因的序列。这样经过各自的PCR克隆后，在各自的产物其中的一端加上特别的接头。然后把PCR 产物处理后，利用接头的特异互补进行PCR 扩增，从而将两段PCR 产物 连接到了一起，形成了不靠限制性内切酶连接的杂交基因片段。在重叠延伸PCR中，两个重叠的DNA片段是分别从两个独立的PCR扩增反应得到的，预设突变构建在重叠区域中。整个过程需要4对引物，用引物AF和AR，通过PCR的方法从稻瘟病菌基因组DNA扩增待敲除基因的上游A片段，接着用引物BF和BR再从稻瘟病菌基因组DNA中扩增待敲除基因的下游B片段，再用引物HYG/F和HY/R扩增出潮霉素磷酸 转移酶序列内部的正向引物HPH1，用引物YG/F和HYG/R扩增出潮霉素磷酸转移酶序列内部的反向引物Hph2。再通过SOE-PCR的方法搭桥连接待敲除基因的上游A片段和Hph1、待敲除基因的下游B片段和Hph2，获得该基因的AH和HB 片段。取上述PCR产物AH、HB片段各5μg，利用PEG介导的方法导入稻瘟菌的原生质体中。原生质体复苏后，在含有300 μgmL-1潮霉素的选择培养基上进行生长。5～7天后，在平板上挑取具有潮霉素抗性的转化子。将所挑取的转化子在固体酵母培养基中培养含3～5 天，收集菌丝，提取基因 组DNA，进行PCR验证是否为敲除突变体。