糖分测定方法

糖分测定

试剂

MeJA购自日本Wako Pure Chemical公司。组织培养过程中采用去离子水。

乙腈为色谱纯，流动相的水为Millipore pure级。葡萄糖、果糖、蔗糖（分析纯100度烘干）购自Sigma公司。

设备

Waters 600E高效液相色谱仪，Alltech 2000 ELSD (Evaporative Light Scattering Detector，蒸发光散射检测器)，Waters μBondapak TM NH2色谱柱(3.9×300 mm)。数据采用Waters公司的Enpower软件进行分析。样品用Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱过滤。

HPLC样品制备

样品提取方法按照Gerrits (2001)[184]和Laurel (2001)[185]的方法进行修改。

培养液样品的处理方法

1) 取-20oC低温保存的培养液，室温下解冻，涡旋；

2) 取培养液0.5 ml，用去离子水稀释5倍；

3) C18柱过滤。

茎尖样品的处理方法

1) 0.5g 左右的样品，液氮研磨后加入3ml 80%乙醇，100oC提取3min；

2) 12,000g，4oC，离心10min；

3) 保留上清，在沉淀中加入1ml 80%乙醇，涡旋，70oC提取5min；

4) 12,000g，4oC，离心5min；

5) 保留上清，在沉淀中加入1ml 80%乙醇，涡旋，70oC提取5min；

6) 12,000g，4oC，离心5min；

7) 保留上清，在沉淀中加入1ml 去离子水，涡旋，70oC提取5min；

8) 12,000g，4oC，离心5min；

9) 保留上清，在沉淀中加入1ml 去离子水，涡旋，70oC提取5min；

10) 12,000g，4oC，离心5min；

11) 合并以上5步离心得到的上清，旋转蒸发后用水定容至25ml；

12) 取10 ml，冻干（找庄天明，再找杜红梅）（短期-20度，长期-80度）；

13) 在冻干后的样品中加入1ml 去离子水，涡旋；

14) C18柱过滤（一个柱3-5次，用甲醇洗一次，再用水洗一次，5ml

枪）。

色谱条件

液动相为乙腈：水(v/v) = 75：25。上样前将C18柱过滤后的样品经0.45 μm 滤膜过滤。上样量为15 μl，每个样品重复上样2次。柱温25oC，流速1 ml/min。

工作曲线的制备

称取100oC烘至恒重的蔗糖、葡萄糖和果糖各5mg，溶解在1ml水中，分别配制成5 mg/ml的糖标准溶液和2.5 mg/ml的蔗糖、葡萄糖和果糖的混合溶液。过滤后每种寡糖溶液和糖混合溶液分别进样5、10、15、20、25μl，记录色谱图，以峰面积的对数和进样量的对数作图得到标准曲线。