米氏常数测定方法
酶活米氏常数实验
一、实验前准备
1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。
2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL 或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。
3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200μL和10μL移液枪、50μL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL 左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。
4、记录本上提前写好实验的加样顺序：
催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200μL缓冲液②10μL催化剂③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10μL) ④32μLH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200μL缓冲液②10μL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64μL）④10μL底物TMB（ABTS）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。
Code 1 2 3 4 5 6 7
Time
TMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10
V01
Code 1 2 3 4 5 6 7
Time
H2O2 2 4 6 8 10 16 32 64
V01
二、实验
1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个
0，按Enter键进入系统。电脑开机，密码为mby-nano，双击酶标仪软件图标，出
现登录框，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面
选择“铁动力学”(波长为650nm)
板1
；
打开电脑内置时钟，
若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm）
。
新建一个word文档，以日期命名，打开。
2、加样：96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。以TMB为例，从第1列加样：
①从A1至H1，每孔加200μL NaAc/HAc Buf；
②从A1至H1，每孔加10μL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
③从A1至H1，每孔分别加不同体积（0，0.5，1，2，4，6，8，10μL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；
④用排枪吸取32μL H2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：00：00）
Code 1 2 3 4 5 6 7
Time 00：00 00：30 01：00 01：30 02：00 02：30 03：00 03：30 TMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10
V01
用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。每次读板出来结果后，点击“结果入库”——>“是”——>“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法)
3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。
4、若当天不再继续实验，将24孔板中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。
三、数据处理
1、打开Origin6.1，点击右上角的“Add New Column”（箭头所指）：
，亦可右击——> Add New Column
。
2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。X 列时间从0-180s，0 s对应微孔板编号1的数据，30 s对应code2的数据，以此类推，将所
读数据输入。
点击“file”—>“Save Project As”，
保存文件名为“第一组”。
3、数据输入完成后，选择X和Y列，点击左下角的“点图”标志（箭头所指）
作出点图，点击Analysis—>Fit Linear作线性拟合
，
在结果对话框里，拟合的方程为Y=A+B*X，B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V
，同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V，记录数据：
Code 1 2 3 4 5 6 7
Time 00：00 00：30 01：00 01：30 02：00 02：30 03：00 03：30 TMB 0 0.5 1 2 4 6 8 10
V01 0 0.00714 0.00902 0.01162 0.01425 0.01597 0.01547 0.017 同样方法得出第二、三、四组的反应初速度V，记录数据。
4、新建New Project，数据表1中命名X列为底物（TMB）浓度，列中数据为A-H对应的孔中TMB的物质的量浓度（一般用μmoL/L）；挑选三组比较好的初速度V，输入Y列
。
选中初速度V的三列，右击—>Statistics on Rows
，
得出数据表2，选定Mean和sd列中的值，右击复制，粘贴至数据表1中
，
选定sd列，右击—>Set As—>Y Error，将标准方差设为误差棒
。
选定X列、Mean列和sd列，画点图
，
点击Analysis—>Non-linear Curve Fit，作非线性拟合
拟合的方程为米氏方程y=P1*x/(P2+x)，y为反应初速度，x为底物浓度，P1为Vmax值，P2为米氏常数Km值（若软件中没有此方程，可点击New新建方程，之后也可点击Edit
编辑方程）；点击Start Fiting，得出对话框
，点击Active Dataset，，设定P1、P2初
始值为1，，点击10lter进行非线性拟合，得出
，记录Vmax和Km值。
可双击X 或Y 轴修改坐标轴名称
，
点击图上方的“T ”标志
可在图上插入文本框，将Km 和Vmax 值写入
。
5、保存结果。
6、计算Kcat 值
Kcat 表示每个酶分子在单位时间内催化底物的分子数，反应了酶催化能力的大小。根据下面的公式计算：
（1） （2） （3）
v 的单位为Ms -1；v max 为非线性拟合得出的值，单位为s -1；ε=39000M -1·cm -1；l 为反应体系的高度，96孔板每个孔的高度为1cm ，每个孔的容积为300μL ，可根据反应体系的平均体积占300μL 的比例来计算反应体系的高度；[E]为催化剂的浓度，单位为M ；m 为催化剂的质量，可根据加入催化剂的体积和催化剂溶液的浓度计算得出；r 为催化剂粒子的半
3
[]43A m E
r N V
πρ=???max v
v l
ε=
?[]v Kcat E =
径，以透射电镜测出的粒径计；ρ为催化剂的密度，单位为g/cm-3；N A为阿伏伽德罗常数，值为6.02×1023；V为反应体系的平均体积；Kcat单位为s-1。
附：
直接拷数据方法：
1.每次读板后，数据结果入库，待全面测完，按照当天的日期在桌面的DATA文件夹中查找自己的数据，格式为记事本，如20100825.txt，该文件拷入自带u盘。
2.选中该记事本文件，右击打开方式，选择用写字板打开，如图
打开后如下：
3.按ctrl+A，将写字板文件中全面数据选中，复制，新建一个word文档，粘贴。
4.选中某一列数据：先将鼠标指针放在该列数据的第一个数据前面，然后按住alt键，
向右下方拖动，直到黑色黑色区域将该列数据全面覆盖，注意不要覆盖其他数据，如图：
5.选中之后先松开鼠标，再松开alt键，选中后不要点击鼠标（左右键都不要点），按ctrl+c 复制该列数据。
6.打开origin软件，选中某列，按ctrl+v 即可将该列数据拷入选中列，如图：
7.友情提示：在直接拷取数据时，如遇到不能直接拷入origin中时，可在word中插入表格，选中表格中一行或一列，将从txt中复制的数据粘贴进去，再在表格中重新选中数据，复制，即可一一对应的拷入origin中的表格中。
8.后续步骤按以上操作指示进行（按ctrl键点击该处）