医学遗传学总结
KEY WORD:分子技术。
1.基因工程
PCR-引物设计;限制性酶切;连接,转化,筛选,质粒提取
2.如何构建报告基因
3.基因的表达如何调控,检测方式?
DNA/RNA manipulate
以Huntington disease举例:
(Huntington disease
Caused by expansion of a triplet encoding Glu in the 5’ end.
Normal allele. 11-34 repeats; Abnormal, triplets expanded.)
【疾病研究如何着手】
查阅文献→选择模式动物
(eg. 选择果蝇。
原因:发育周期短个体小便于饲养成本低,由于研究历史长基因工具系统健全。
研究结果适用于人<13000个基因中有10000个与人同源,人类60%以上的疾病可以在果蝇中找到对应基因>)
→构建报告基因
(eg. 使人的Huntington基因能在模式生物中表现出疾病表型)
①在表达基因的coding region的3’端加上GFP,作为基因表达的预告。尽量包括调控序列。通过数据库(例如BioLabs)鉴定确保序列中有promoter和核糖体结合。
②为PCR设计引物:
大致原则:
5’端:在5’端选择约为20bp的序列,GC个数与AT个数大致相等。在之前加6bp左右的酶切位点,以及在酶切位点之前加上1~2bp的用于提高限制性内切酶效率的碱基。
3’端:大致相同,只是注意DNA序列需要【反向互补】
→连接后转化→克隆筛选→基因提取
【限制性内切酶使用注意】
DNA甲基化、star activity(用量、时间)、enzymes producing compatible ends.
(star activity:指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象,也就是说产生Star 活性后,不但可以切断特异性的识别位点,还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。)
【vector】
用于扩增的cloning vector和用于表达的expression vector
特点见课件。
【Inverse PCR】:用于克隆基因两侧的侧翼序列。
【real-time PCR】
在引物上添加染色剂
【基因表达调控】
1. Gene overexpression (gene knockin)
The difference between knock-in technology and transgenic technology is that a knock-in involves a gene inserted into a specific locus, and is a "targeted" insertion.
2. Gene knockdown
Long dsRNA(人体中不能使用,易出现off-target效应), shRNA,
miRNA(效率比long dsRNA高,在人体中较为常用).
3. Gene knockout
借助内切酶、锌指蛋白、TALEN、Cas9,促进同源臂的同源重组。或者整个将基因切除。【Protein functional assay】
1.overexpress
2.localization
3.RNAi/deletion phenotypes
4.structure
https://www.360docs.net/doc/092928625.html,plex
cDNA文库。
更常用的是single strand cDNA.