最新构建点突变质粒步骤资料

基因定点突变

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

二、定点突变的原理

通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

三、引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则：

（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。

（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。

（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。

（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

（5）最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。

四、引物设计实例

以G CG→A CG为例：

5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’

（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’

（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。

（3）重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCT CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC GG-3’

Primer #2: 5’-CC GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG AGG-3’在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

五、突变所用聚合酶及Buffer

引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTAR TM HS DNA polymerase。

六、如何去掉PCR产物

最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。七、如何拿到质粒

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。

八、图示

九、定点突变操作步骤

[A] 诱导突变基因（PCR反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct?酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。

1. 设计点突变引物。

[注]参考引物设计指导

2. 准备模板质粒DN A

[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

3. [选项]对照反应体系（50μl反应体系）

10×Reaction Buffer 5μl

pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng）2μl

Control primer mix（20pmol/μl）2μl

dNTP mixture（each 2.5mM）2μl

dH2O 38μl

Muta-direct? Enzyme1μl

4. 样品反应体系（50μl反应体系）

5μl

10×Reaction Buffer

2μl

Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng）

Sample primer (F)（10pmol/μl）1μl

Sample primer (R)（10pmol/μl）1μl

dNTP mixture（each 2.5mM）2μl

dH2O 38μl

Muta-direct? Enzyme1μl

5. PCR反应条件

[注]按如下参数设置PCR扩增条件。

6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。

[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。

[B] 突变质粒选择

PCR反应结束后使用Mutazyme?酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。

1. 准备PCR反应产物

2. 加入1μl（10U/μl）Mutazyme?酶37℃温育1小时。

[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme?酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme?酶用量。

[C]转化

反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。

1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。

2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。

序列分析

通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。

为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。

构建点突变质粒步骤

基因定点突变一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变得原理通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来得就就就是我们得ＰCＲ产物,在PＣR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复。突变引物设计得特殊原则： (１）通常引物长度为２5～４5 bｐ,我们建议引物长度为30～35bp。一般都就就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为11-12ｂp。若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要1１-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PＣＲ要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个ｂp,并且合成多一条反向互补得引物。 (2）如果设定得引物长度为30 bp,接下来需要计算引物得Tm值,瞧就就是否达到78℃(GC含量应大于４0%)。 (3)如果Tｍ值低于７8℃,则适当改变引物得长度以使其Ｔm值达到78℃（GC含量应大于4０%）。 (4)设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置。 (5）最好使用经过纯化得引物。Ｔm值计算公式:Tm＝0、4１×(% oｆGC)–675/L+81、5 注:Ｌ：引物碱基数;%oｆGC:引物ＧＣ含量。四、引物设计实例以ＧＣG→ＡＣG为例：５’-CCTCＣTTCAGTATGTAＧGＣGＡCTTACＴTAＴTGＣGＧ－3’ (1）首先设计3０bp长得上下游引物,并将A (T)设计在引物得中央位置。 Primeｒ#1: ５’-CCＴTCAGＴＡTGTAＧA CGACTTAＣTTAＴTGＣ－3’ Prｉｍｅr ＃2:５’－GCAAＴAAＧＴAAGＴCG T CTACATＡＣTGＡAGG-3’

定点突变技术——从单点突变到多点突变

定点突变技术——从单点突变到多点突变体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli 中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过 8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质

定点诱变技术

第三章DNA突变技术

基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变定点突变 2.随机突变表型筛选

随机突变易错PCR法(Error-prone PCR) 降低一种dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shuffling 外显子、单基因和基因家族的重组装随机引物延伸法交错延伸法定点突变点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube Random fragmentation of a pool of related genes; Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); PCR amplification with primers of reassembled products How DNA shuffling works

Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences 一、单基因和基因家族的重组装

基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC 含量应大于40%）。（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

构建点突变质粒步骤

构建点突变质粒步骤．基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个

碱基。二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：

℃，则适当改变引Tm值低于78（3）如果含量应大（GC78物的长度以使其Tm值达到℃）。于40%）设计上下游引物时确保突变点在引物（4 的中央位置。）最好使用经过纯化的引物。（5 (% of 值计算公式：Tm=0.41×TmGC)–675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC 含量。

四、引物设计实例以G CG→A CG为例： 5'-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTT ATTGCGG-3' （1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。 Primer #1: 5'-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTAT 3' TGC- Primer #2: 5'-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAA GG-3'

定点突变protocol

基因定点突变试剂盒产品简介：碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失 (deletion)或插入(insertion)。本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图 1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个 nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。图1. 基因定点突变试剂盒原理图保存条件： -20℃保存，一年有效。注意事项：需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。使用说明： 1. 引物设计：用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计： (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。 (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。例如引物为agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活

蛋白质工程的定点突变

20世纪80年代以来，基因克隆技术与DNA化学合成方法相结合，建立和发展了定点突变技术。可以按照预定设计，在已知的DNA序列中增删或转换核苷酸，精确地是靶基因在特定位点发生碱基序列的变化，进而使基因表达及调控，基因产物发生相应改变。这种快速精确的基因突变已经被广泛地应用与基因工程和蛋白质工程之中。定点突变有多种方法，有的改变特定核苷酸，有的则是对一段最可能影响蛋白质功能的基因序列进行随机突变，产生一系列突变蛋白质。寡核苷酸诱导的定点突变基本上分两类：一类是用单链噬菌体M13作载体的寡核苷酸介导的单链模板定点突变；另一类用双链质粒作载体，双引物法定点突变。为了在体外导入特定的点突变，小的限制性片段可以切除，并被包含所需要突变的合成接头所替代（称为盒式诱变）。如果不行，插入片段可以克隆到产生单链DNA的噬菌粒载体中，由所设计的错配引物知道DNA复制，产生异源双链的复制型，并在下面的复制循环中产生野生型和突变的复制型。 (图）单链噬菌体作载体的定点突变的基本原理是，用已知序列的环状DNA变性后为模板，人工合成一段引物，将所要设计的定点突变寡核苷酸置于引物中，也就是说人工所合成的引

物不是完全和模板互补，而是在某个位点有意识地让碱基突变，和模板上的碱基不能配对，由于其他的碱基是互补的，所以任然可以通过复性，使引物和模板特异性结合。在M13单链环状模板上杂交一段寡核苷酸引物，利用DNA聚合酶和连接酶的作用，从引物延伸合成链，得到一个闭合环状的异源双链分子。由于预先在寡核苷酸引物中人为地引入碱基的错配对，插入或缺失，然后在将杂合双环DNA转化到细菌中，因此异源双链DNA经转化和筛选就可以分离到带有相应突变的DNA克隆。由于复制是半保留复制，经克隆后将有一半的后代环状DNA产生了定点突变，另一半和正常的亲代链一样。环状双链质粒DNA作为载体进行基因的改造有它的优点。待改造基因中如有两个适当的限制性内切酶切点，可以用人工合成双链DNA片段置换两切点之间原有序列，在人工合成的双链DNA片段中包含有突变的序列。但是这种置换方法收到限制酶酶切位点的限制。 1.用M13DNA进行的寡核苷酸引物介导的定点突变：寡核苷酸引物介导的定点突变的步骤是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。主要过程是：（1）将待突变基因克隆到突变载体上； 2.制备含突变基因的M13DNA单链模板； 3.引物与模板与模

质粒构建流程

质粒构建流程一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pcDNA3.1(+)， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取 1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤： 1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。 2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。 3）4℃，12000rpm离心10min。 4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl） 5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀 6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s 7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s 8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s 10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min 11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min 12）4℃，12000rpm离心60s 13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。14）-20℃保存 2.RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤： 1）基因组DNA去除（10μl体系） ② 5×gDNA eraser buffer 2μl ① gDNA eraser 1μl

定点突变

1.1.1 基因定点突变简介（INTRODUCTION ）定点突变（site-directed mutagenesis ）是指通过聚合酶链式反应（PCR ）等方法向目的DNA 片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。定点突变能迅速、高效的提高DNA 所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR ）2. 一步法（全质粒PCR ） ? 搭桥法（重叠PCR ）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR ，其中前两次PCR 可同时完成，原理如图一所示：两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。 PCR1：以primer F 和 primer Rm 为引物对扩增 PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE ） 1. 两对引物的Tm 值都应相当。两端PCR 引物参照普通引物设计并无特殊要求。所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。 2. 对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。但两引物间互补部分的Tm 值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。搭桥法定点突变

一对中间位置的点突变引物设计 3. PCR ：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。两次PCR 的产物回收，作为模板加上两端引物primer F 和primer R 进行PCR3。（注意前两次不能使用taq 聚合酶，因为taq 在产物3’ 端多加一个A ，导致后续的PCR3出现移码突变） 4. 克隆：回收PCR3产物，酶切，连接，转化。 ? 一步法定点突变一步法是以质粒为模板，考虑扩增效率需将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。原理如图实验步骤（PROCEDURE ） 5. 引物设计：设计一对含有目标突变的引物，除所需要引入的突变位点外，其余序列与质粒模 5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’ 完全互补 5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’ 部分互补 5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ 3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’ 部分互补

构建点突变质粒步骤

构建点突变质粒步骤基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物

长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。

(2)如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78C(GC 含量应大于40% )。 (3)如果Tm值低于78C，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78C (GC含量应大于40% )。 (4)设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 (5)最好使用经过纯化的引物。 Tm值计算公式：Tm=0.41 X(% of GC) -675/L+81.5 注：L :引物碱基数；% of GC :引物GC含量。四、引物设计实例以GCG T ACG为例： 5 '-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTAC TTATTGCGG- 3' (1)首先设计30 bp长的上下游引物，并将 A (T) 设计在引物的中央位置。 Primer #1: 5 '-CCTTCAGTATGTAG ACGACTTACTTAT TGC-3' Primer #2: 5 '-GCAATAAGTAAGTCG TCTACATACTGA AGG-3' (2)引物GC含量为40% , L为30,将这两个数

突变体构建

突变体构建 1.定点突变：快速，高效，简便设计原理：引物与模板链退火，pfu DNA聚合酶合成突变链。DpnⅠ酶体外降解非突变型质粒模板（甲基化质粒模板）设计引物：引物包含5’端重叠区和3’端延伸区。引物长度：除突变点之外，两条引物的长度大约为30个核苷酸，5’端重叠区包含15-20个碱基，3’端延伸区包含至少10个碱基。突变引物：突变点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5’端。退火温度的计算不包括突变碱基。如图： 5’’3’-TACTGGTACTAATGCGGTTCGCGC G 延伸区重叠区 2.嵌合型突变体的构建：将一个基因与另一个基因，互换构建嵌合型突变变体，可以通过overlapping PCR的方法获得。 ●原理：比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。 A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3， B的序列为5-atgctagtagctagcccccc cc aggggataattttttaaaacg-3。 ●首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-atgcatgctagctagaacgct-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 （设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。） ●步骤：（1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因（2）回收A，B基因（3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。

基因定点突变技术描述

基因定点突变step by step" 本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术，其它较长片段的突变，删除，插入技术以后会慢慢奉上：在做实验之前，我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。大家马上就会想到几个问题了：第一：引物怎么设计呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到质粒呢？

20170814 质粒构建流程

20170814 质粒构建流程武汉大学Angelo 一、引物设计 1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI 2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。 3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pMSCV， 4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。 5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。 6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。 7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取方法一： 1. RNA提取 2. RNA反转录获得目的片段方法二：从韩家淮实验室索取（通常采用）具体流程： 1、PCR扩增PCR程序：95℃5min 95℃30s 58℃30s 72℃延伸（根据基因片段大小设定时间）35cycle 72℃5min 22℃保存注：可根据不同基因调节退火温度，延伸时间，循环数。 2、PCR产物纯化 1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min 2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）① 将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。② 加等体积（1g=1ml）GC buffer ,65℃水浴10min 左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③ 溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④ 弃废液，加500μl washing buffer，离心12000rpm，1min ⑤ 弃废液，加500μl PW washing buffer，离心12000rpm，1min ⑥空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5ml EP 管⑦加入30-50μl elution buffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min 标上基因名称，日期⑧电泳检测

基因定点突变技术简介-sill

基因定点突变技术简介：一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。基因定点突变主要有以下三种方法： 1.寡核苷酸介导的定点突变该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。 Stratagene公司研制了QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit即是在此种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为模板，在要突变处设计一对反向互补的引物，用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆菌就可以。 2．盒式定点突变该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。但这种方法需要在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该方法的使用。

3.PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA 片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。

质粒构建实验步骤1

质粒构建实验步骤实验一 1．将合成的引物溶解（10uM），分别扩增P1P2，P3P4， 2．PCR扩增条件如下： 95 ℃ 10 min 95 ℃ 30 s 50℃ 30 s 10cycle 72℃ 30 s 72℃ 5min 3.反应体系为：20 ul （p1p2和p3p4各两管） dNTP 2 ul 10xBuffer 2ul Taq 0.4 ul Primer P1 （P3） 1.0 ul Primer P2 （P4） 1.0 ul H2O 13.6 ul 4．将产物电泳，检测是否为目标片断（分别为A1B、A2B）,证实为目的片断以后，进行后续扩增 5．将扩增出的AB和CD片断等摩尔加入作为模板进行第二次PCR，并且在第二次PCR 时加入引物扩增25个循环，PCR扩增条件如下： 95 ℃ 15 min 95 ℃ 30 s 60 ℃ 30 s 25cycle 72℃ 40 s 72℃ 5min 6．反应体系为：100ul dNTP 10 ul 10xBuffer 10 ul Taq 1ul Product P1P2 2 ul Product P3P4 2 ul Primer F 1 ul Primer R 1 ul H2O 73ul

实验二连接载体DNA 外源DNA片段10×T4 DNA ligase buffer T4 DNA ligase 0.5μl 16℃保温8-24小时。做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。实验三 10．转化 ①取100ul感受态细胞置于冰上融化，将50ul感受态细胞加入至10ul连接产物中，冰上30min。 ②42℃放置45~60s，冰上放置2~3min。 ③加入37℃预温好的200ul LB液体培养基（不含Amp） ④37℃振荡培养1h（160~220 rpm） 11．铺板铺板之前要先将AMP抗性的LB固体培养基先预温到常温，然后取100 ul菌液涂板，37℃培养过夜（16~24h） 12．不带有质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性,不能在含有Amp的筛选培养基上成活。挑选菌落接种于5 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。 13. 取1 ul菌液进行菌落PCR。（回收产物和水做对照） PCR扩增条件如下： 95 ℃ 15 min 95 ℃ 30 s （60）℃ 30 s 30cycle 72℃ 40 s 72℃ 5min 反应体系为：20ul dNTP 2 ul 10xBuffer 2 ul Taq 0.2 ul 菌液 1 ul Primer F 0.4 ul Primer R 0.4 ul H2O 14 ul

质粒构建的经验

一、质粒的构建：启动子的选择启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。启动子可分为2大类：诱导型启动子是比较精明的，平时歇着，一旦接到诱导信号指示就马上开工干活儿。而组成型启动子比较老实的，就是从头到尾不停干活从不闲着的那种——比如我们很熟悉的CMV启动子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK启动子啊等等。获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。在BHK-21中，CMV 启动子活性比其他启动子如SV40和RSV都要高。但这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。

一个强悍的高表达组成型启动子是我们做表达所求之不得的，但是对于转染本身来说却不一定好——因为任何持续过高表达外源基因都可能带来某种程度的细胞毒性，影响细胞生长——如果外源基因本身对细胞生长有毒，那更完蛋了，你很可能筛不到转染成功的细胞株，更别提稳定转染了——因为过量表达本身可能已经害死了那个转染了的细胞，没转染的细胞又死于筛选压力。这种时候一个不那么“能干”的启动子可能更适合一些。如果你曾经遇到原因不明的转染失败案例，会不会是这个原因呢？过犹不及就是这个道理咯。诱导型启动子对于转染来说，特别是稳定转染，可能是更好的选择。它使得目的基因的表达可以受到我们的调控——转染的时候不表达，筛选稳定表达株后再诱导表达，使得表达有毒性的基因或者精确分析表达产物的生物学效应成为可能。多数诱导型启动子在接受某种信号后“打开开关”开始工作，也有的相反，在缺失某种信号后打开开关。Clontech还有个诱导系统是“剂量依赖的”，就是说不单表达开关可控，表达量多少也可以通过诱导剂的量来调控。还有一种特殊的启动子很好玩——具有时序性或者组织特异性（空间特异性），会受到

定点突变PCR

人血管生长因子基因（hVEGF）的PCR定点突变实验原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。目的学会引物的设计、PCR扩增及巩固琼脂糖凝胶电泳分析。主要内容 1、PCR引物设计的最基本注意事项； 2、PCR扩增中的注意事项； 3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。 VEGF成熟基因序列： GgatccGCACCCA TGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA TCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTA T CAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGA GTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGG AGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCA GCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCA AGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCA TTTGTTTGTACAAGATCCGCAGA CGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACG TACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA 突变酶切位点 Ggatcc（BamH1）GAATTC（EcoR1）