原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法
1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用；
2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中；
3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）;
4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热
3min，适当振荡；[循环1]
5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2]
6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3]
7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5]
8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]；
9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
原代心肌细胞培养技巧【转】
原代培养心肌细胞作为一种主要的研究模型，被广泛应用于心血管研究之中.我们实验室经过长期尝试，摸索出了一些行之有效的方法，并积累了一些经验，现总结如下： 1新生大鼠鼠龄的选择新 生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力.因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长.大量观测表明，选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳. 2消化酶的选择及使用 新生大鼠心肌细胞的分离可采用组织块法和消化法，前者因不易获得密度均一的细胞且难控制成纤维细胞的生长而较少采用.消化法中常使用的酶有3种：胰蛋白酶、胶原酶I或Ⅱ以及透明质酸酶.透明质酸酶多与胰蛋白酶或胶原酶联合应用.胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏.胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小，且在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主,故我们选用胶原酶I.文献报道胶原酶的工作浓度一般在0.6~1 g?L1,我们使用的为0.8 g?L1.胶原酶最好现用现配. 3消化程度的把握 新生大鼠心肌细胞对酶消化极为敏感.消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化不足，细胞聚集成团，无法分清细胞边界，难以形态学观测.消化过程中使用磁力搅拌器时应注意1)转速一般控制在60~80 r?min1左右.(2)每次消化的时间须结合消化酶浓度确定.(3)将粘附在搅拌子上的心肌组织吹散，使酶液充分接触组织.(4)适宜温度为35~37℃.(5)当组织由红转白呈半透明状态时，应停止消化. 4接种的细胞密度 心肌细胞接种密度不仅影响细胞间的相互接触，进而影响细胞对肥大刺激的反应，而且影响长期培养细胞的成活率.接种细胞的绝对数量应经精确计算.一般而言，应根据实验的观测目的决定单位面积上的细胞数量.例如，如作形态学观测,六孔板中每孔的接种细胞数量应控制在1×105~2×105个；若需收获心肌细胞作mRNA或蛋白表达水平的观测，则每孔的接种密度可增加到5×105~6×105个. 5细胞的分散度与接种的均匀性 分离出的心肌细胞，在溶液中Ca2+作用下较容易出现集聚现象.因此，在进行差速贴壁前后，均应反复多次地轻柔吹打使心肌细胞成单个分散状态.接种后，应小心使心肌细胞均匀地分布于培养板上,避免细胞向培养孔的中央集聚.此外，可将培养板放入孵箱后用滴管轻轻吹打各孔中央部位2~3次，但应格外注意避免污染. 6对成纤维细胞的抑制与血清种类的选择 成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂增殖能力，经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞.溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长.但是，如果使用胎牛血清培养细胞，由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU 很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞. 7换液时间 进行心肌细胞形态学观测时，接种密度较低，贴壁的心肌细胞数量减少，为避免成活心肌细胞随换液而被丢弃，应在接种48 h后换液.这样不仅使贴壁的心肌细胞数量明显增加，而且BrdU作用时间较长，对成纤维细胞的抑制作用更确实.此外，去血清后可用ITS和0.1 g ?L1BSA对心肌细胞进行营养支持，对心肌细胞贴壁率与凋亡率均不产生明显影响. 8抗污染措施
小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型
小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型 （2013/6/20 廖翔） 一．材料 1. 所需液体：K-H液（NaCl 118, NaHCO3 24, CaCl2 2.5, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, Glucose 11, EDTA 0.5 （in mM））、低分子肝素溶液（500IU/ml）、戊巴比妥钠液、碳酸氢钠液、盐酸液。 2. 取鼠：标准C57小鼠（20-25g）。 3. 物品： ?手术剪、血管钳 1套，用于开腹、开胸 ?眼科剪、眼科镊 1套，用于开胸后取心、剔除心缘纤维组织 ?小圆培养皿 2个，培养皿内加4°K-H液，先后装取出的心 ?1000ml烧杯 2个 +小转子，一个用于配制H-K液，一个装双蒸水，清洗灌注仪器 ?500ml烧杯 1个，用作废液缸。 ?50ml烧杯 1个（用于少量的药物灌注） ?吸管 2个，分别滴加碳酸氢钠液、盐酸液 ?持针器1把，夹持带针7号线 ?尖镊2把，夹持主动脉 ?大镊子1把，持物 ?1mL注射器 2个，分别用于注射麻药、肝素 ?5mL注射器 1个，用于加CaCl2液 ?50mL注射器1个，用于加K-H液 ?5mL注射器针头自制灌注针 1个（用于挂小鼠心脏，尖端磨平，距针尖2mm出磨出刻痕以便打结固定） ?6号线（用于固定心脏）、带针7号线（用于结扎LCD） ?氧气罐（95% O2 +5% CO2） ?20X20cm泡沫板1个+大头针4枚，用于固定麻醉后的小鼠 ?泡沫盒1个，装冰块 ?橡皮泥，用于固定挂心脏的自制注射器 4. 仪器：手术显微镜、langendorff离体灌注装置（灌注系统、恒温装置、灌注泵） 5. 另外准备手套、口罩、棉签等 注：现在差的物品有：尖镊2把（夹持主动脉） 二．操作方法： 1、打开离体灌注装置，设备自检。注意灌注压调零；配制K-H液，调pH为7.4左右（7.35-7.43），加入灌注装置恒温至37°，运行灌注泵，排空灌注系统的气泡。加适量K-H液于小圆培养皿中放于冰块上（4°），打开显微镜，将需要使用的工具摆放到位。 2、小鼠称重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg)进行麻醉，予以普通肝素(300IU/kg)肝素化，待小鼠麻醉完全后，固定小鼠于泡沫板上。迅速开腹，迅速开胸，切断主动脉和上下腔静脉，取出心脏，立即放入4°K-H液中（此过程<15s），冲洗掉残留在主动脉内的血液，寻找升主动脉，镊子夹住升主动脉血管壁并固定于自制针头，插入灌注针至主动脉瓣上方，6号丝线结扎后，迅速移至灌注装置上，用K-H液灌注，整个灌注期间用医用氧气进行鼓泡式氧合。必要时可切开右心耳，使冠
心肌细胞2
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】 ：目的 乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但 是心肌细胞成活率、 搏动率， 纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。 本文 探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠 心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和
Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。 因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套， 操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段 除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。(2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则既会导致培养液pH改变，又能增加污染机率。 4．心肌细胞纯化 在心肌细胞培养中，成纤维细胞具有分裂增殖能力， 且生长迅速， 比心肌细胞更早贴壁，如不加以控制，常可生长为优势细胞。细胞纯化方法有很多因此，目前，常用化学试剂抑制法和差速贴壁分离法来抑制其生长，而化学试剂势必对培养细胞生长环境有一定影响，因此，依据心肌细胞与成纤维细胞贴壁时间不同的原理做差速分离， 成了广泛采用的纯化方法，其优点是对目的细胞影响小，经比较，结果显示差速贴壁在60min、90min时最为理想 方法简便，纯化率较高，可达到95%以上。经差速贴壁后仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中，若处理不当，很容易生长成优势细胞。因此再加上化学试剂抑制，加入分裂抑制剂(如丝裂霉素c) ，有时在培养早期如入溴脱氧脲苷，或加入不利非心肌细胞生长的成分(如谷氨酰胺)。如溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine， BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法 原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。 乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点： 1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。 新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。 2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。 常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。 3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。 新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。 4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。 分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。 5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。 操作过程： 手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中； 将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状； 加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min； 重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5） 放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。 48h换液后可得心肌细胞。观察心肌细胞形态及搏动状况。
原代心肌细胞培养方法探讨
原代心肌细胞培养方法探讨1 邵伟（山东省千佛山医院山东济南250014） 周苏宁邵建华（山东大学医学院山东省立医院山东济南250021） 摘要探讨培养Wister新生大鼠心肌细胞的可靠方法。采用心肌组织块差别消化结合化学纯化的培养方法，通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜、台盼篮、免疫细胞化学，鉴定心肌细胞生长情况及纯度。结果细胞生长迅速、自行搏动，细胞形态完整，细胞内肌丝、线粒体清晰；细胞成活率达94.6％；肌动蛋白（HHF35）经S-P法胞浆呈现棕褐色阳性表达，纯度达96.4％。表明该方法培养的心肌细胞生长迅速、活性好、纯度高。 关键词心肌细胞；细胞培养；大鼠 Explore a method of neonatal rat myocardial cells in culture ZHOU Suning, SHAO Jianhua. Medical college of Shandong university, the people’s hospital of Shandong province, Jinan 250021, China Abstract To explore a reliable method of neonatal rat myocardial cells in culture. The plots of myocardial tissue from neonatal Wister rat were cultured and purified with the method of differential enzyme and 5-Bromodeoxyuridine-treatment. Microscope, transmission electron microscope, HE stains, Trypan blue stains, immunohistochemical test were determined to identification the cell. The results of myocardial cells grow rapidity, automaticity, shape intact, the cell of filament and mitochondria clearly. The cell viability was up to 94.6% by Trypan blue stains. The cell purity was up to 96.4% by Actin （HHF35）of Streptavidin peroxidase conjunction method. This method of myocardial cells in culture was grown up rapidity, lively well, high purity. Key words Myocardial Cells; Culture; Rat 随着心脏病发病率逐年升高，有关心肌疾病的研究越来越受到重视，快速、理想的心肌细胞培养是深入研究的前提，为此我们进行了原代心肌细胞培养方法的探讨，并对其进行了一系列实验研究，现报道如下。 1材料与方法 1.1 心肌细胞的培养取24h内Wister大鼠，在其心脏跳动时将心脏取下，小心剪取心室组织，用冰PBS液清洗干净后，将组织反复剪成0.5～1mm3的小块，加2～3滴细胞培养液，用吸管轻轻吹打后分次吸取组织块悬液，将其均匀排在75ml培养瓶底壁上，轻轻翻转培养瓶，加入含150ml/L胎牛血清、0.1mmol/L 5-溴脱氧核苷(5-Bromodeoxyuridine；Brdu)的高糖DMEM 3ml培养液，做好标记置于37℃恒温培养箱中30～40min后，待组织块略干能贴于瓶壁上，再缓慢、轻轻地将培养瓶翻转，使培养液浸泡组织块，继续静止培养。每天小心取出培养瓶置于相差显微镜下进行观察，2h后就可见组织块周边有细胞伸出，1天后周围爬满细胞，3～4天后多数连接成片，可进行传代，用吸管轻吹组织块使其脱落移出，加入0.1％胰蛋白酶1ml，放置倒置显微镜下观察，约3～5min后部分细胞呈圆形，在瓶上做好标记，弃去胰 1山东省自然科学基金资助项目（No.Q99C03）
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法 1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用； 2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中； 3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）; 4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热 3min，适当振荡；[循环1] 5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2] 6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3] 7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5] 8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]； 9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养
原代新生大鼠心肌细胞的分离与培养 1.动物与仪器 1.1实验动物：选择出生第2 d的SD乳鼠,雌雄不拘。 1.2主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，Olympus倒置显微镜，超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器；DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、D-Hank′s 液、溴脱氧尿核苷、小鼠抗大鼠Sarcomerie actin 单抗；山羊抗小鼠IgG。 2.方法 2.1心肌细胞的分离：取第2 d的SD乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的D-Hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。 2.2心肌细胞的培养:细胞悬液放CO2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞/mL，将单细胞悬液接种于培养板中，前3 d滴入Brdu使其终浓度为0.1mmol/L，并继续培养；24h后换液,以后隔日换液。 2.3心肌细胞搏动率的观察:在倒置显微镜下观察第1 d至第7 d心肌细胞的生长状态、形态变化，并摄像记录自发搏动频率。随机计数培养至第4 d的心肌细胞的搏动率。细胞搏动率(％)=搏动细胞数／细胞总数×100％。 2.4心肌细胞存活率的测定:取相同量的0.4％台盼蓝液与细胞悬液混匀后再取适量混合液滴于细胞计数板上，随机取10个高倍（20×）视野计数4个大格中的细胞总数及未染成蓝色的活细胞数，计数10次，取平均值。细胞存活率(％)=活细胞数／细胞总数×100％. 2.5心肌细胞纯度的鉴定:取培养72 h后心肌细胞进行纯度鉴定，用横纹肌肌动蛋白(a actin)单克隆抗体作为一抗，用SABC法进行免疫细胞化学染色，用磷酸盐缓冲液（PBS）作为一抗的阴性对照。随机取10个高倍（20×）视野计数阳性细胞及细胞总数。阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数×100％。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养 ㈠、概述 整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。 ㈡、[试剂] 1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。 2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。 3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L ㈢、[实验步骤] 1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心
脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中 （37℃5%CO2）培养。
成年大鼠心肌细胞分离方法
成年大鼠心肌细胞分离方法 【摘要】目的: 探讨三种分离成年大鼠心肌细胞的方法。方法: 分别应用酶消化法（0. 1 %的胰蛋白酶和0.1%胶原酶依次消化）、程序冷冻后机械分离法（4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，-196℃冻存）、酒精和多聚甲醛固定后机械分离法分离心肌组织获取单个心肌细胞悬液。光镜观察, 结合形态学和台盼蓝染色评价心肌细胞。结果: 用三种方法新分离的活性心肌细胞比率约70 %～80 % 、杆状、横纹清晰。结论: 三种方法均可以对成年大鼠心肌细胞进行良好的分离。 【关键词】大鼠; 心肌细胞; 细胞分离 【ABSTRACT】 Objective: To study the methods of isolating adult rat ventricular cardiomyocytes. Methods: The method of enzyme digestion(0.1% trypsin and 0.1% collagenase by turns) or mechanical method: mechanical isolation after procedure cryoapplication(4℃30min，-20℃30min，-80℃30min，freeze and keep under-196℃) or mechanical isolation after alcohol and paraform fixation was used to isolate cardiac muscular tissues and obtain single cardiomyocyte suspension. The cardiomyocytes were morphologically observed with optical microscope and evaluated through trypan blue dying. Results: Viability of freshly isolated adult rat ventricular cardiomyocytes, which were rod shaped with clear cross striations,was 70%～80%. Conclusion: Adult rat ventricular cardiomyocytes can be
乳鼠心肌细胞原代培养综述
乳鼠心肌细胞原代培养综述 【摘要】：目的乳鼠原代心肌细胞培养在心血管病防治研究领域应用广泛，但是心肌细胞成活率、搏动率，纯化率过低仍是本技术有待解决的关键之处。本文探讨原代心肌细胞培养的条件和方法以及一些注意事项做一下总结。 【关键词】乳鼠心肌细胞原代培养 1．新生大鼠鼠龄的选择 乳鼠心肌细胞随年龄的增长，其增殖分化能力亦有变化，如在新生3d内，具有部分增殖能力，而成年大鼠心肌细胞为终末分化细胞，不具备增殖能力，因此，我们在选择鼠龄时，尽量选择出生时间短的乳鼠，这样的心肌细胞成活率及贴壁率较高，所以选择新生1~3d均可，最好为半日龄的大鼠更为理想。 2．消化酶的选择使用 分离组织常用的消化液有胰蛋白、胶原酶和透明质酸，如依地酸二钠(EDTA)，其作用是利于组织块分散为单个细胞，利于细胞的贴壁生长。消化液的浓度、消化能力、消化的时间、温度对组织离散效果影响较大，甚至会损伤细胞，导致培养细胞状态不佳，失去贴壁生长能力，增加心肌细胞死亡率。其中胰蛋白酶的消化力较强，常用浓度为0·05~0·50%，在37℃、PH8·0条件下作用最强，易造成心肌细胞损坏，因此，有学者认为“单纯应用胰蛋白酶消化对细胞的存活率有极大的负面影响”[1]，而TDTA作为一种化学螯合剂，价格低、毒性小，对细胞有一定的离散作用。所以，选用胰蛋白酶与EDTA联合应用，可降低细胞损害，具有更好的消化分离效果。另外，胶原酶作用较温和，通过水解细胞间胶原蛋白来实现离散组织的目的，对细胞的损伤较小，也是理想的细胞分离液，针对心肌细胞间含有不同胶原酶类型，可联合使用Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型胶原酶。且要知道的是在新生大鼠心肌组织，以胶原I为主，故我们选用胶原酶I，文献报道胶原酶的工作浓度一般在0。61 g·L-1，我们使用的为0。8 g·L-1。胶原酶最好现用现配。 3．污染防治 虽然污染本身是不可能完全避免的，但可以降低其发生率、减轻其产生的严重后果。因此，我们在细胞培养过程中，要坚持无菌操作的原则，如做好实验室、超净台、实验器械及实验用液的消毒灭菌工作，个人要身着消毒衣帽，佩戴口罩及无菌手套，操作时，酒精灯火焰烧灼消毒器械，避免培养用液长时间暴露在空气环境，禁止吸管接触培养液瓶口等。防止微生物污染常用的方法是在培养液中加入抗生素，由于抗生素的种类不同，其抗生范围也不尽相同，但多数针对细菌感染为主，常用青霉素和链霉素联合应用。需要指出的是，抗生素的抗生范围有限，且污染发生具有隐匿性，出现后往往后果严重，所以抗生素仍不能替代无菌操作，而且过度的强调抗生素的作用，会使实验者淡化甚至忽视无菌操作，滥用也会导致产生耐药菌，因此，只有无菌操作才是防止细胞污染的最好手段。除了以上说的无菌操作还应特别注意以下几点：(1)获取心脏时避免剪破消化道，比较稳妥的办法是在剑突上一肋处入剪，这样做不涉及腹腔，也就减少了污染机会。 (2)如条件允许，应避免乳鼠心肌细胞与其他细胞在同一孵箱内共同培养，以防止发生交叉污染。(3)对于培养心肌细胞的观察、照相每次时间不可过长，否则
大鼠心肌细胞原代培养
实验二大鼠CM的体外分离、培养及鉴定 1、材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验动物新生3天清洁级Wistar大鼠乳鼠（中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001）。 1.1.2主要仪器与试剂 5％CO 2恒温培养箱（model TC2323 CO 2 incubator）；倒 置相差显微镜（XD-101 98010）；PH计（mettler toledo320-s）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI），上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；微量移液枪（法国Gilson）；血球记数板（上海市沪江医疗器材经营部）；HH-6数显恒温水浴锅；离心机（LDZ5-2）；75cm2培养瓶、50ml离心管（美国corning公司）；无菌手术器械；磁力搅拌器；电子天平板（BS1101S 德国）；一次性滤器（22μm, GILSON）；DMEM/F12培养基 (美国GIBCO)；特级胎牛血清（FBS， Hyclone）；青、链霉素（Hyclone）；D-Hank’s液（NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaOH、NaHCO3，苯酚红,南京化学试剂厂）；心肌肌钙蛋白T(Santa cruz) ;FITC连接的兔抗山羊IgG(Santa cruz);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶(Sigma)；Triton-X-100(AMRESCO);BrdU(solarbio)。 1.2方法 于无菌操作下开胸取出心脏，仔细去除心脏相连大血管和心房组织（留心尖部），于4℃的D-Hank’S液中漂洗3～4次，以去除残存血液，眼科剪将心尖部组织剪成1 mm3碎块后，加入4 ml的0.0625%胰蛋白酶液，于37℃恒温水浴箱中消化3 min，然后弃上清。于剩余沉淀中加入混合消化液5 ml（0.0625％胰蛋白酶+0.1％Ⅱ型胶原酶），置37℃水浴消化8～10 min，其间振荡2～3次，静置后将上清液移入离心管中，加含10％胎牛血清预冷的DMEM/F12培养液终止消化。 随后用上述方法反复消化7～8次至组织块基本消化完毕。收集各次上清液并终止消化后，200目的尼龙网筛过滤去除残留组织块，以1000 r/min速度离心8 min，将所得的细胞与培养液混悬后，采用差速贴壁分离法去除心肌成纤维细胞每次2 h，将未贴壁的心肌细胞悬液吸出，调整细胞密度接种于培养板中。培养前3 d加入0.1 mmol/LBrdU抑制成纤维细胞生长。48 h首次换液，以后根据情况2～3 d换液。
实验动物(大鼠、小鼠、兔)原代心肌细胞
实验动物（大鼠、小鼠、兔）原代心肌细胞 产品编号：RAT/MIC/RAB-iCell-c001 产品规格：>5×105细胞数 产品价格：3930/3910/4350 包装规格：1ml冻存细胞悬液或T-25培养瓶 细胞详述： 心肌的工作细胞包括心房肌和心室肌。心肌细胞为短柱状，一般只有一个细胞核，心肌细胞之间有闰盘结构。该处细胞膜凹凸相嵌，并特殊分化形成桥粒，彼此紧密连接，但心肌细胞之间并无原生质的连续。心肌细胞的细胞核多位于细胞中部，形状似椭圆或似长方形，其长轴与肌原纤维的方向一致。肌原纤维绕核而行，核的两端富有肌浆，其中含有丰富的糖原颗粒和线粒体，以适应心肌持续性节律收缩活动的需要。 细胞特性: 1)组织来源于实验动物的正常心脏组织。 2)细胞鉴定：肌球蛋白重链(MHC)免疫荧光染色为阳性。 3)经鉴定细胞纯度高于90%。 4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。 5)细胞生长方式：长柱状细胞，不规则细胞，贴壁培养。 产品的运输和保存： 视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。 1)1mL冻存细胞悬液装于1.8ml的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进 行运输；收到细胞后请尽快解冻复苏细胞进行培养，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃的条件下保存1个月。 2)T-25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输；收到细胞后请镜下观察细胞生 长状态，如铺瓶率超过85%请立即进行传代操作，如悬浮的细胞较多，请将培养瓶至于培养箱中静置过夜以帮助未死亡的悬浮细胞能够再次贴壁。 推荐培养基： 我们推荐使用iCell原代心肌细胞培养体系（产品编号：PriMed-iCELL-022）作为体外培养原代心肌细胞的培养基。 产品使用： 1)本产品仅能用于科研 2)本产品未通过直接用于活体动物和人的审核 3)本产品未通过用于活体诊断的审核
新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离_施雨露
中国组织工程研究 第17卷 第24期 2013–06–11出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research June 11, 2013 Vol.17, No.24 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.24.007 [https://www.360docs.net/doc/0c14261112.html,] 施雨露，李晓辕，曹美娜，于姝媛，王苹. 新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离[J].中国组织工程研究，2013，17(24): 4414-4420. P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.360docs.net/doc/0c14261112.html, 4414 www.CRTER .org 施雨露，1963年生，江苏省启东市人，汉族，1990年白求恩医科大学大学毕业，主管技师，主要从事免疫和遗传学方面的研究。 shiyl@https://www.360docs.net/doc/0c14261112.html, 通讯作者：王苹，博士，副教授，吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林省长春市 130021 wang_ping@https://www.360docs.net/doc/0c14261112.html, 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2013)24-04414-07 收稿日期：2012-10-21 修回日期：2012-12-01 (20120821002/D ·Y) 新生大鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的同时分离 施雨露1，李晓辕2，曹美娜3，于姝媛3，王 苹3 1吉林大学白求恩医学院病原免疫细胞遗传实验中心，吉林省长春市 130021 2吉林大学第一医院呼吸科，吉林省长春市 130021 3吉林大学第一医院耳鼻咽喉-头颈外科，吉林省长春市 130021 文章亮点： 心肌细胞原代培养普遍存在心肌细胞纯度不够、细胞生长状态不稳定和细胞老化等问题。实验采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶消化，提高了心肌细胞从组织中的释放度和细胞活性，2次差速贴壁，尽可能分离心肌成纤维细胞和心肌细胞；最后采用马血清替代牛血清的培养基培养心肌细胞，结果获得的心肌细胞量大，活性好且纯度高。其中胰蛋白酶低浓度冷消化和马血清替代培养基中的牛血清为本文首创。 关键词： 组织构建；心脏组织构建；心肌细胞；心肌成纤维细胞；胰蛋白酶；胶原酶；复合消化；细胞培养；马血清；牛血清；增殖；分化 摘要 背景：利用心肌组织中不同细胞的黏附特性差异，通过优化心肌细胞的培养条件，一次分离同时获得心肌和心肌成纤维细胞。 目的：探讨新生大鼠心肌和心肌成纤维细胞同时分离的有效方法。 方法：采用低浓度胰蛋白酶冷消化结合胶原酶复合消化，差速分离心肌和心肌成纤维细胞。通过使用不同种类的血清改良心肌细胞培养条件，免疫荧光鉴定心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度。 结果与结论：心肌培养48 h 时Troponin T 阳性细胞率为89.3%。第2代的心肌成纤维细胞培养波形蛋白阳性细胞率为93.6%。含马血清的培养基组心肌细胞阳性率明显高于牛血清培养组(P < 0.05)。实验应用的新生大鼠心肌细胞分离培养方法，心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度高、活性好，且能同时获得心肌细胞和心肌成纤维细胞。 Simultaneous isolation of myocardial cells and cardiac fibroblasts from neonatal rats Shi Yu-lu 1, Li Xiao-yuan 2, Cao Mei-na 3, Yu Shu-yuan 3, Wang Ping 3 1 Experimental Center of Pathogenobiology-Immunology-Cell Biology and Genetics, Bethune Medical College, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China 2 Department of Respiratory Medicine, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China 3 Department of Otolaryngology and Head & Neck Surgery, First Hospital, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China Abstract BACKGROUND: Myocardial cells and cardiac fibroblasts are simultaneously isolated through optimizing the culture conditions of myocardial cells, by use of the variations of adhesion properties of myocardial cells. OBJECTIVE: To explore the co-separation method for myocardial cells and cardiac fibroblasts in newborn rats.
成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察
成年大鼠心肌细胞培养方法 的建立和形态学观察 北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室 许秀芳 李温斌3 陈宝田3 吕燕宁 赵莉敏 陈 燕 提要:为探索稳定的成年大鼠心肌细胞的分离和培养方法,应用生物酶(5g/L胰蛋白酶及1g/L胶原酶)灌注法分离成年大鼠心肌细胞,用形态学及台盼蓝染色法鉴定分离的心肌细胞,并在光镜和电镜下观察和摄像记录。结果:心肌细胞的存活率为91.7%;存活的心肌细胞静止地贴在培养板底上,细胞完整,呈杆状,长宽比约为4～6∶1。结果提示:该方法是比较理想的心肌细胞培养法。 关键词:成年大鼠心肌细胞;胰蛋白酶;胶原酶;分离技术 中图分类号:Q253;R322.1+1 自从1953年Durrows和Moscona首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,逐渐发展为3种分离方法:离体心脏灌注法、心肌细胞浸泡法和贴块培养法。对动物而言,离体心脏生物酶灌注法分离心肌细胞的质量及数量最佳。成年心肌细胞的分离较幼年及新生动物心肌细胞的分离更为困难,但成年心肌细胞做为一种生物学实验工具是其他心肌细胞不可替代的。国内仅有少数单位分离培养成功成年动物心肌细胞。1992年1月至1998年12月,我们建立了成年大鼠心肌细胞分离培养方法并进行了形态学观察。 1 材料和方法 1.1 材料 实验动物为成年Wistar大鼠,体质量150～200g,由本研究所实验动物室提供。 DM EM培养液、胰蛋白酶均购自美国GIBC公司;胶原酶购自美国Sigma公司;牛血清白蛋白购自美国BM公司;胎牛血清由金华生物制品公司提供;淋巴细胞分离液由中科院血液学研究所出品;安贞Ⅱ号心脏停跳液由本院体外循环组提供。 实验药物及试剂的配制:2%胎牛血清20 mL加DM EM培养液100mL,青霉素100mg/ L,链霉素100万U/L,p H7.2～7.4,过滤除菌。酶消化液:胶原酶0.1g加胰蛋白酶0.5 g、牛血清白蛋白1g,加入DM EM培养液100 mL,于使用前配制。 1.2 方法 采用离体心脏灌注法分离心肌细胞[2,3]。 Wistar大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(含1∶200肝素45mg/kg),麻醉满意后胸腹部用75%乙醇消毒,“U”字形切开腹壁,快速剪断左右前腔静脉及后腔静脉,经升主动脉根部灌注4℃高钾安贞Ⅱ号心脏停跳液30mL,待心脏停跳呈灰白色后取下心脏,接在Langendorff 灌注架上,按下列步骤进行实验: 1)清洗心脏:用无Ca2+、Mg2+的D2Hank 液灌洗心脏5min即可;目的是解离桥粒和细胞间连结。由于Ca2+在心肌细胞连结上起重要作用,用无Ca2+的液体灌洗心脏能带走大量的Ca2+,心肌细胞间糖蛋白被破坏,桥粒和连结随之解离。 2)溶解细胞外基质:应用酶消化液37℃灌注,保持灌注压在4.90～7.84kPa(50～80 cmH2O)。 3)心肌细胞的释放:经一定时间(30～90 min)酶消化后,心肌细胞外基质大部分被消化,但细胞间连结如缝隙连结并没有完全断开,心脏仍保持大体形态,松弛状,机械作用才能将细胞分开。见心脏变软、呈暗红色,取下心脏,轻揉搅拌几分钟后剪下心室肌,剪成1mm3大 2000年 6月第21卷 第2期 首都医科大学学报 Journal of Capital University of Medical Sciences J un.2000 Vol.21 No.2 收稿日期:1999203209 3首都医科大学附属北京安贞医院心外科
石蜡切片-小鼠心脏组织-心衰模型-实验步骤
石蜡切片 操作流程及步骤： 1、样品4℃过夜[1,2]。 2、清洗水槽及过滤网[3]。 3、打开机器开关，调节水池温度21℃、展片水池温度45℃、烘片温度55℃[4]。 4、固定包埋组织块[5]。 5、调节出水水流大小[6]。 6、调节切片厚度5um、10 um[7]。 7、将包埋组织块下调至与刀片位置同一平面，前后距离使其与刀片距离恰好接 触[8]。 8、开始切片带出现完整的组织切横切面将其随水流传送至水池中[9-13]。 9、选择较好的切片，用载玻片将其从21℃水池中捞出。每个石蜡取5-6张片子 [14-15]。 10、放到展片水池中展开、载玻片编号[16]。 11、55℃烘干，无水滴后可收片。 心得体会及注意事项： 1、包埋组织块冻存温度过低会冻坏，不冻存石蜡粘性大不容易切片。 2、操作期间应放入冰中储存，自备冰块。 3、水槽中石蜡会堵塞上水滤网影响出水速度。 4、展片水池水要在展片前达到预设温度。 5、要固定牢固，固定不牢切片时容易破坏样品。 6、以中间水柱恰好达到刀片位置最佳，水流过小切片不易冲下，水流过大会导致切片破坏。 7、5 um染色效果更佳，根据不同组织染色要求调节切片厚度。 8、若前后位置调节不精确可使距离稍大，随后手动摇轮慢慢靠近，每次前进距离为提前设定距离5um或10 um。
9、切片期间不出现严重的黏附，粘连，裂片，不要轻易停止，切片要匀速. 10、切片过薄会迅速升温从0℃升至21℃或更高，若随意停止，石蜡黏附性增加会导致粘刀片等问题影响继续操作。 11、若一个样本操作时间过长应取下放入冰块一段时间再继续操作。 12、原则没有大问题匀速不要随意停。 13、换新刀片（刀片上有黏附石蜡会导致切片裂开，最好换至新刀片）。 14、尽量清理水池多余无用切片及碎石蜡，但是要小心不要碰坏样品切片。 15、每个载玻片取2-3个组织最佳。 16、展片不足会有褶皱影响染色结果，展片时间过长会导致组织裂开。