大肠杆菌
大肠杆菌
目录
生物学分类
学名
常见种类介绍
大肠杆菌导致的疾病
大肠杆菌的传播途径
大肠杆菌在生物技术中的应用
[编辑本段]生物学分类
细菌域(Bacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichia)、大肠杆菌种(E. coli)
[编辑本段]学名
Escherichia coli (T. Escherich 1885)
[编辑本段]常见种类介绍
大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,是Escherich在1885年发现的,在相当长的一段时间内,一直被当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼畜(禽),常引起严重腹泻和败血症,它是一种普通的原核生物,是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血清型的大肠杆菌可引起不同症状的腹泻,根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5类:致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠黏附
性大肠杆菌(EAEC)。
大肠杆菌0 157:H7血清型属肠出血性大肠杆菌,自1982年在美国首先发现以来,包括我国等许多国家都有报道,且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发,格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中,目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌O 157:H7引起肠出血性腹泻,约2%~7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征,儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行,病情严重者,可危急生命。
大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)革兰氏阴性短杆菌,大小0.5×1~3微米。周身鞭毛,能运动,无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气,是人和动物肠道中的正常栖居菌,婴儿出生后即随哺乳进入肠道,与人终身相伴,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖,几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。因此,大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。大肠杆菌的抗原成分复杂,可分为菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原(K),后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同,可将大肠杆菌分为150多型,其中有16个血清型为致病性大肠杆菌,常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料,如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格(Lederberg)采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验,奠定了研究细菌接合方法学上的基础,以及基因工程的研究。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,主要寄生在大肠内。它侵入人体一些部位时,可引起感染,如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的,尤其是对孩子及老人。
大肠细菌(E. coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病,为人和动物肠道中的常居菌,在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强,引起腹泻,统称致病性大肠杆菌。
该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强,55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月,在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感,但易耐药,是由带有R因子的质粒转移而获得的。
致病物质:
大肠杆菌具有很多毒力因子,包括内毒素,荚膜,〣型分泌系统,黏附素和外毒素等。(〣型分泌系统是指能向真核靶细胞内输送毒性基因产物的细菌效应系统。约由20余种蛋白质组成。)
黏附素能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上,避免因排尿时尿液的冲刷
和肠道的蠕动作用而被排除。大肠杆菌黏附素的特点是具有高特异性。包括:定植因子抗原〡,〢,〣;集聚黏附菌毛〡和〣;束形成菌毛;紧密黏附素;P菌毛;侵袭质粒抗原蛋白和Dr菌毛等。
外毒素大肠杆菌能产多种的外毒素,包括:志贺毒素〡和〢;耐热肠毒素〡和〢;不耐热肠毒素〡和〢。此外,溶血素A在尿路致病性大肠杆菌所致疾病中有重要作用。
大肠杆菌血清学分型基础(即其抗原)大肠埃希菌主要有三种抗原:O抗原,为细胞壁脂多糖最外层的特异性多糖,由重复的多糖单位所组成。该抗原刺激机体主要产生IgM类抗体(出现早,消失快)。K抗原,位于O抗原外层,为多糖,与细菌的侵袭力有关。K抗原分为A,B,L三型。H抗原,位于鞭毛上,加热和用酒精处理,可使H抗原变性或丧失。H抗原主要刺激机体产生IgG类抗体,与其他肠道菌基本无交叉反应。
表示大肠杆菌血清型的方式是按O:K:H排列,例如:O111:K58(B4):H2 [编辑本段]大肠杆菌在生物技术中的应用
大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,
大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表
达体系,常做高效表达的首选体系
真核基因在大肠杆菌中表达,必须有合适的表达载体(Vector),常用载
体:pBV220,pET系统
目的基因在大肠杆菌中表达的情况:
大肠杆菌更适合原核基因的表达,外源基因表达产量与单位体积产量是正相相关的,而单位体积产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量呈正相相关.细胞浓度与生长速率,外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在动态平衡,单个细胞的产量又与外源
基因拷贝数,基因表达效率,表达产物的稳定性和细胞代谢负荷等因素有关。
预防方法:
1.保持地方及厨房器皿清洁,并把垃圾妥为弃置。
2.保持双手清洁,经常修剪指甲。
3.进食或处理食物前,应用肥皂及清水洗净双手,如厕或更换尿片后亦应洗手。
4.食水应采用自来水,并最好煮沸后才饮用。
5.应从可靠的地方购买新鲜食物,不要光顾无牌小贩。
6.避免进食高危食物,例如未经低温消毒法处理的牛奶,以及未熟透的汉堡扒、碎牛肉和其它肉类食品。
7.烹调食物时,应穿清洁、可洗涤的围裙,并戴上帽子。
8.食物应彻底清洗。
9.易腐坏食物应用盖盖好,存放于雪柜中。
10.生的食物及熟食,尤其是牛肉及牛的内脏,应分开处理和存放(雪柜上层存放熟食,下层存放生的食物),避免交叉污染。
11.雪柜应定期清洁和融雪,温度应保持于摄氏4度或以下。
12.若食物的所有部分均加热至摄氏75度,便可消灭大肠杆菌O157 : H7;因此,碎牛肉及汉堡扒应彻底煮至摄氏75度达2至3分钟,直至煮熟的肉完全转为褐色,而肉汁亦变得清澈。
13.不要徒手处理熟食;如有需要,应戴上手套。
14.食物煮熟后应尽快食用。
15.如有需要保留吃剩的熟食,应该加以冷藏,并尽快食用。食用前应彻底翻热。变质的食物应该弃掉。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,周身鞭毛,能运动,无芽孢。主要生活在大肠内。
1、大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
2、大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
3、人体与大肠杆菌的关系:在不致病的情况下(正常状况下),可认为是互利共生(一般高中阶段认为是这种关系);在致病的情况下,可认为是寄生。
4、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌,菌落呈深紫色,并有金属光泽,可鉴别大肠杆菌是否存在。
5、大肠杆菌在生物技术中的应用:大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。
6、大肠杆菌在生态系统中的地位,假如它生活在大肠内,属于消费者,假如生活在体外则属于分解者
大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群检验方法:
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,即:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。
(一)国家标准:国家标准采用三步法,即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。
分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃培养18-24h,观察菌落形态。
证实试验:挑取平板上的可疑菌落,进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h,观察产气情况。
本方法采用两步法:推测试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管LST 肉汤。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。
证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中,36±1℃培养48±2h,观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表,报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。
具体操作参见SN0169-92 《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》
三、说明:
1.MPN检索表:MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法,对样品进行连续系列进行稀释,加入培养基进行培养,从规定的反应呈阳性管数的出现率,用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
MPN检索表只给了三个稀释度,如改用不同的稀释度,则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的,而且结果报告单位也不相同。
2.初发酵和证实试验:无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法,都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验,培养基的配制略有不同,但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义,即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
初发酵阳性管,不能肯定就是大肠菌群细菌,经过证实试验后,有时可能成为阴性。有数据表明,食品中大肠菌群检验步骤的符合率,初发酵与证实试验相差较大。因此,在实际检测工作中,证实试验是必需的。
3.产气量与倒管:在乳糖发酵试验工作中,经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡(有时比小米粒还小),有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明,大肠菌群的产气量,多者可以使发酵倒管全部充满气体,少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时,可以用手轻轻打动试管,如有气泡沿管壁上浮,即应考虑可能有气体产生,而应作进一步试验。
4.挑选菌落:国家标准中,需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离,对典型和
可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称,在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样,而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基,在该平板上,大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时,检出率最高;红色、粉红色菌落检出率较低。
另外,挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系,只挑取一个菌落,由于机率问题,尤其当菌落不典型时,很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落,如无典型菌落则应多挑几个,以免出现假阴性。
5.抑菌剂:大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌,特别是革兰氏阳性菌的生长。
大肠细菌(E. coli)为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多不致病,为人和动物肠道中的常居菌,在一定条件下可引起肠道外感染。某些血清型菌株的致病性强,引起腹泻,统称病致病大肠杆菌。
一、生物学性状
(一)形态与染色
大小0.4~0.7×1~3um,无芽胞,大多数菌株有动力。有普通菌毛与性菌毛,有些菌株有多糖类包膜,革兰氏阴性杆菌。
(二)培养特性
在血琼脂平板上,有些菌株产生β型溶血。在鉴别性或选择性培养基上形成有颜色、直径2~3mm的光滑型菌落。
生化反应:大部分菌株发酵乳糖产酸产气,并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。
(三)抗原构造
较复杂,有O、K、H、F四种抗原。O抗原为脂多糖,已有171种,其中162种与腹泻有关,是分群的基础。K抗原有103种,为荚脂多糖抗原。从病人新分离的大肠杆菌多有K抗原,有抗吞噬和补体杀菌作用。根据耐热性等不同,K抗原分为L、A、B三种,其中L、B不耐热,有60种。F抗原至少有5种,与大肠杆菌的粘附作用有关、表明大肠杆菌血清型的方式是按O:K:H排列,例如O111:K58(B4):H2。
(四)抵抗力
该菌对热的抵抗力较其他肠道杆菌强,55℃经60分钟或60℃加热15分钟仍有部分细菌存活。在自然界的水中可存活数周至数月,在温度较低的粪便中存活更久。胆盐、煌绿等对大肠杆菌有抑制作用。对磺胺类、链霉素、氯霉素等敏感,但易耐药,是由带有R因子的质粒转移而获得的。
二、致病性
(一)致病物质
1.定居因子(Colonization factor ,CF);也称粘附素(Adhesin),即大肠杆菌的菌毛。致病大肠杆菌须先粘附于宿主肠壁,以免被肠蠕动和肠分泌液清除。使人类致泻的定居因子为CFAⅠ、CTAⅡ(Colonization factor antigen Ⅰ、Ⅱ),定居因子具有较强的免疫原性,能刺激机体产生特异性抗体。
2.肠毒素:是肠产毒性大肠杆菌在生长繁殖过程中释放的外毒素,分为耐热和不耐热两种。
(1)大耐热肠毒素(Heat labile enterotoxin, LT):对热不稳定,65℃经30分钟即失活。为蛋白质,分子量大,有免疫原性。由A、B两个亚单位组成,A又分成A1和A2,其中A1是毒素的活性部分。B亚单位与小肠粘膜上皮细胞膜表面的GM1神经节苷脂受体结合后,A亚单位穿过细胞膜与腺苷酸环化酶作用,使胞内A TP转化cAMP。当cAMP增加后,导致小肠液体过度分泌,超过肠道的吸收能力而出现腹泻。LT的免疫原性与霍乱弧菌肠毒素相似,两者的抗血清交叉中和作用。
(2)耐热肠毒素(Heat stable enterotoxin ,ST):对热稳定,100℃经20分钟仍不被破坏,分子量小,免疫原性弱。ST可激活小肠上皮细胞的鸟苷酸环化酶,使胞内cGMP增加,在空肠部分改变液体的运转,使肠腔积液而引起腹泻。ST与霍乱毒素无共同的抗原关系。
肠产毒性大肠杆菌的有些菌株只产生一种肠毒素,即LT或ST;有些则两种均可可产生。有些致病大肠杆菌还可产生vero毒素。
3.其他:胞壁脂多糖的类脂A具有毒性,O特异多糖有抵抗宿主防御屏障的作用。大肠杆菌的K抗原有吞噬作用。
(二)所致疾病
1.肠道外感染:多为内源性感染,以泌尿系感染为主,如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎、上行性尿道感染多见于已婚妇女。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等。婴儿、年老体弱、慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者,大肠杆菌可侵入血流,引起败血症。早产儿,尤其是生后30天内的新生儿,易患大肠杆菌性脑膜炎。
2.急性腹泻:某些血清型大肠杆菌能引起人类腹泻。根据其致病机理不同,分为四种类型。
(1)肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E. coli,ETEC):引起婴幼儿和旅游者腹泻,出现轻度水泻,也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性,一般2~3天即愈。营养不良者可达数周,也可反复发作。致病因素是LT或ST,或两者同时致病。有些菌株具有定居因子,常见者为O6:K15:H16、O25:K7:H42。鉴定ETEC主要测定大肠杆菌肠毒素,血清型有一定参考意义。
(2)肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC):是婴儿腹泻的主要病原菌,有高度传染性,严重者可致死;成人少见。细菌侵入肠道后,主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。切片标本中可见细菌粘附于绒毛,导致刷状缘破坏、绒毛萎缩、上皮细胞排列紊乱和功
能受损,造成严重腹泻。EPEC不产生LT或ST。有人报道,EPEC可产生一种由噬菌体编码的肠毒素,因对V ero细胞(绿猴肾传代细胞)有毒性,故称VT毒素。VT毒素的结构、作用与志贺氏毒素相似,具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素性。鉴定EPEC可根据临床表现与血清型。
EIEC的多数菌株无动力,生化反应和抗原结构均近似痢疾杆菌,应予注意。EIEC可引起豚鼠角结合膜炎,临床上可藉此协助鉴定EIEC。
(4)肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli,EHEC):引起散发性或暴发性出血性结肠炎,可产生志贺氏毒素样细胞毒素。EHCO的主要菌型是O157:H7,还可有O26、OⅢ等。
表025-1 引起急性腹泻的大肠杆菌
肠产毒性大肠杆菌肠致病性大肠杆菌肠侵袭性大肠杆菌
肠出
血性
大肠
杆菌
感
染
部
位
小肠小肠大肠大肠腹
泻类型水泻水泻痢疾样
血性
腹泻
易
感人群婴儿,成人婴儿成人,儿童
各种
年
龄?
分布发展中国家(热
带)
世界各地世界各地
北美、
日本
流行病学散发或暴发婴
儿腹泻及旅游
者腹泻
散发或暴发婴儿腹泻
散发或暴发,常见于
年龄较大儿童
致病机理LT、ST
定居因子
细胞毒?
定居因子
侵袭肠粘膜细胞
细胞
毒?
常
见
O 血清型6、8、15、20、
25、27、78、148、
159
2、26、44、55、86、111、114、
119、125、126、127、128、142、
146、158
28、29、112、124、
136、143、144、152、
164、167
O157:
H7
鉴定测定LT、ST、
检出定居因子
血清型
血清型与临床表现
血清型测定细菌侵袭
力
血清
型
此外,肠粘附性大肠杆菌(Enteroadhesive E.coli,EAEC)也可引起腹泻,但对其发病机理与血清型尚不了解。EAEC不侵入肠上皮细胞,不产生LT或ST,也无VT毒素。唯一特征是具有与Hep-2细胞(人喉上皮细胞癌细胞系)粘附的能力,故也称Hep-2细胞粘附性大肠杆菌。
三、微生物学检查法
(一)细菌的分离鉴定
1.标本:肠道外感染取中段尿、血液、脓液、脑脊液等,腹泻者取粪便。
2.分离培养与鉴定:粪便标本直接接种肠道杆菌选择性培养基。血液需先经肉汤增菌,再转种血琼脂平板。其他标本可同时接种血琼脂平板和肠道杆菌选择性培养基。37℃孵育18~24小时后,观察菌落并涂片染色镜检。采用一系列生化反应进行鉴定。肠致病性大肠杆菌须先作血清学定型试验。必要时检定肠霉毒素。
泌尿系统除确定大肠杆菌外,还应计数,每毫升尿含菌量≥100,000时,才有诊断价值。
(二)卫生细菌学检查
大肠杆菌不断随粪便排出体外,污染周围环境和水源、食品等。取样检查时,样品中大肠杆菌越多,表示样品被粪便污染越严重,也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。
1.细菌总数:检测每毫升或每克样品中所含细菌数,采用倾注培养计算。我国规定的卫生标准是每毫升饮水中细菌总数不得超过100个。
2.大肠菌数指数:指每立升中大肠菌群数,采用乳糖发酵法检测。我国的卫生标准是每1000ml 饮水中不得超过3个大肠菌群;瓶装汽水、果汁等每100ml大肠菌群不得超过5个。
四、防治原则
在肠产毒性大肠杆菌的免疫预防研究中,发现其菌毛抗原在自然感染和人工自动免疫中是一种关键性抗原。
治疗可选用庆大霉素、丁胺卡那霉素等。
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍[1]
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群(总大肠菌群) >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一,目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群
所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念,如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法,故而使用粪大肠菌群概念;而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念,较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为,“粪大肠菌群”的提法不太科学,耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌,耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物,因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染,可能存在大肠杆菌。但是,耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌,耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似,主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物,有健康者,也有肠道病患者或带菌者粪便,所以粪便中既有正常肠道菌,也可能有肠道致病菌(如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等)和食物中毒者。因此,食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。
大肠杆菌高细胞密度发酵
课程设计说明书 课程名称:发酵工程 设计题目:大肠杆菌的高细胞密度发酵 院系:生物与食品工程学院 学生姓名:郑帅超 学号:201106040030 专业班级:11 生物技术 指导教师:李安华 2014年5月26日
课程设计任务书 设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化 学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工 程学院 专业、年级、班11生物技术 设计要求: 1、树立正确的设计指导思想,严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。 2、根据所给资料,按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成,不得延误,不得抄袭他人成果。 3、说明书应字迹清楚文字通顺,并附有各项设计成果表,摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。 4、设计标准要求规范、实用、切合实际。 5、设计应严格按有关设计规范进行。 6、设计结束后,以个人为单位提交设计说明书一份(后附流程图)。 学生应完成的工作: 1、在老师的帮助下完成题目设计。 2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线,并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。 3、学生在实验室完成实验方案。 4、完成课程设计说明书的初稿,由指导老师帮助修改,最后定稿。 参考文献阅读: [1]李寅等著,高细胞密度发酵技术,化学工业出版社,2006-10-01,177~288. [2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452~455. [3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270~275. [4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30~33. [5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275. [6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25~28. [7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20~25. [8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ~31. 工作计划: 2013.5.11分组并确认指导老师,在老师指导下查阅文献,确定题目。 2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段,确定实验路线,然后确定实验方案。 2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。 2013.5.18----2013.5.22 修改说明书,和指导老师沟通。 2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书,并由指导老师填写评语和成绩。 任务下达日期:2014年5月13日 任务完成日期:2014年5月26日 指导教师(签名):学生(签名):
大肠杆菌高活性氨基酸生物合成途经研究
研究目的: 汽油替代品:高能量密度、低吸湿性、辛烷值 传统生物燃料&高级醇;直链醇&支链醇 研究菌体:大肠杆菌 方法技术: 代谢工程:高活性氨基酸生物合成途经+埃利希途径(Ehrlich pathway) 葡萄糖→2-酮酸中间体→高级醇(异丁醇、1-丁醇、2 -甲基- 1-丁醇、3-甲基-1- 丁醇和2-苯乙醇) 实验部分: 一、异丁醇 前期实验: 1)2-酮酸是氨基酸生物合成途径的中间产物;通过2-酮基酸脱羧酶(KDC)转化为醛;通过醇脱氢酶(ADH)转化为醇类。通过实验,测定Kivd是所有测试酶中活性最高且最具有多样性的KDC,ADH选用乙醇脱氢酶2,二者均来自酵母菌。 2)不同种类的2-酮酸(表2)加入到表达Kivd的大肠杆菌培养菌中会将相应醇类的产量提
高2~23倍。特种2-酮酸的供应也明显地削减了其他醇类的产量。这些结果均表明增加特种2-酮酸的量可以提高醇类的产量和选择性。 大肠杆菌已有的代谢途径被转基因改造,增加特种2-酮酸的产量,可以生产出期望的醇类。 设计菌株: 1)为合成异丁醇,质粒内PLlacO1启动子控制的ilvIHCD基因被过度表达以增大2-酮异戊酸生物合成量。 2)强化ilv合成途径和乙醇合成途径(Kivd 和Adh2)。 菌株可产生出23 mM异丁醇,这约是普通菌株产量的五倍 3)进一步提高异丁醇的产量,需要删除控制合成副产物的基因,包括adhE,ldhA,frdAB,fnr 和pta。这些基因的删除可提高用于ilvIHCD合成途径的丙酮酸的量。 敲出基因后的菌株产生了30 mM异丁醇。 4)选用枯草芽孢杆菌的alsS基因取代大肠杆菌的ilvIH基因。相比于大肠杆菌更偏向酮丁酸的ilvIH基因,alsS基因对丙酮酸盐有更强的亲和力。 采用alsS途径的菌株可产生约50 mM的异丁醇。 5)为进一步增加丙酮酸盐的量,pflB基因被敲出。 在这些操作的综合作用下,可以在微好氧条件下使异丁醇的产量达到约300mM (22 g/l)。 实验结果: 通过此种方法由葡萄糖获得了高产量、高选择性的异丁醇 二、正丁醇 1)1-正丁醇的前提2-酮基戊酸乙酯不是大肠杆菌的代谢物。,作者尝试以与亮氨酸生物合成途径相似的方法,以一种分子比2-ketovalerate少一个甲基的更小的分子——2-酮丁酸为底物,合成2-ketovalerate。2-酮丁酸可以通过由ilvA基因编码的苏氨酸脱水酶作用苏氨酸生成。 2)为进一步提高1-丁醇的产量,编码二羟酸脱水酶的基因ilvD被敲除。二羟酸脱水酶能够同时产生2-酮基异戊酸(亮氨酸和缬氨酸的前体)和2-酮基3-甲基戊酸(异亮氨酸的前体)。此种操作有两个优点:首先,ilvD基因的敲除避免了leuABCD代谢途径的自然底物2-酮基异戊酸的生成,进而抑制了目的产物的竞争底物。其次,ilvD基因的敲除避免了Kivd的竞争底物2-酮酸-3-甲基-戊酸和2-酮酸-4-甲基戊酸的产生。故而ilvD基因的敲除进一步增加了1- 丁醇的产量。 三、提高耐受性 为了探索耐受性的可提高程度,我们对于正丁醇耐受性的菌株进行传代培养。我们发现,原生的大肠杆菌对于正丁醇的耐受性为1.5%。然而,菌株在正丁醇浓度不断增加的环境下进行传代培养五代之后,便会出现对正丁醇的耐受性达到2%的基因突变菌株(补充材料中的图4)。这种菌株的耐受性可达到与1-丁醇的原生生产者相当或甚至优于原生生产者。 证明大肠杆菌可以适应长链醇类的高浓度环境。之后还可以运用诸如全转录工程(gTME)等其他的方法进一步提高耐受性。
浅谈大肠杆菌的致病性与防治3
浅谈大肠杆菌的致病性与防治 解觉五支莫食企09级1班 20095090 摘要:大肠杆菌是人和动物肠道中最主要,数量最多的一种细菌,寄居于人和动物的消化道内,是人和动物消化道内占优势地位的需氧共生菌丛。本文主要综述了大肠杆菌的结构与分类,对人体的作用,致病性及其防治。介绍了大肠杆菌的致病机理,致病性与非致病性的区别,以及对致病性大肠杆菌的预防措施。致病性杆菌引起的病越来越多,严重威胁着人类的健康。 关键字:大肠杆菌致病性防治 大肠杆菌是大肠埃希氏菌的俗称,属肠杆菌科埃希氏菌属,1885年埃舍利希 氏首次发现。在相当长的时间内,人们一直把它当作正常肠道菌群的组成部分,认为是非致病菌。直到20世纪中叶,才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性,尤其对婴儿和幼禽,常引起严重腹泻和败血症[1]。大肠杆菌有致病性和非治病性之分。非致病性大肠杆菌是肠道正常菌丛,致病性大肠杆菌则能引起食物中毒。致病性大肠杆菌分为侵入型和毒素型两类。前者引起的腹泻与痢疾杆菌引起的痢疾相似,一般称为急性痢疾型;后者所引起的腹泻为胃肠炎型,一般称为急性胃肠炎型。毒素型大肠杆菌产生的肠毒素,可分为耐热毒素和不耐热毒素。前者加热至100℃经30分尚不破坏,后者加热60℃仅1分即被破坏【2】。土壤、水源收费便污染后,可带有致病性大肠杆菌,婴儿易被感染。带菌食品由于加热不彻底,或因生熟交叉污染和熟后污染,可引起食物中毒。近年来,由致病性大肠杆菌引起的病更是越来越普遍,对人类的健康产生了严重的威胁。 一、大肠杆菌的结构与分类 大肠杆菌一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌,属于原核微生物。大肠杆菌没有真正完整的细胞核,只有一个拟核而且拟核外没有核膜包围。具有主要由肽聚糖构成的细胞壁,细胞膜,细胞质,核糖体,荚膜,菌毛和鞭毛。
大肠杆菌实验
大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化 一、实验目的 1)掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2)学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。 二、实验原理 本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温实现转化。由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。如果受体细胞没有转入pBS,则在含长那霉素的培养基上不能生长。能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提取出,进行电泳酶切等进一步鉴定。 三、仪器及试剂 仪器:恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。 试剂:LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L,121℃高压灭菌20min) 长那霉素储存液:100mg/mL 含长那霉素的LB固体培养基:(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉,将配好的LB固体培养基高压灭菌后,冷却至60℃左右,加入长那霉素储存液,使其终浓度为50μg/mL。摇匀后铺板,每皿倒15mL,室温放置过夜至冷凝水挥发干净) 1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl 四、实验步骤 1 感受态细胞的制备 1)从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株,接种于3~5mL LB液体培养基中,37℃下震荡过夜培养,12h左右,直至对数生长后期。
2)将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中,37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。 3)将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中,冰上放置10min,然后于4℃下,5000rpm离心5min。 4)弃去上清液,用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15~20min后,40℃下5000rpm离心5min。 2 铺平板 将配好灭菌的LB固体培养基加热融化,待冷却至60℃左右后,加入长那霉素储存液,使其终温度为50μg/mL,摇匀后铺板,每皿倒约15mL。室温放置过夜至冷凝水挥发干净。 3 感受态细胞的转化 1)取100μl感受态细胞悬浮液,加入5μLpBS质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30min。 2)42℃水浴热激70s,热激后迅速置于冰上冷却3~5min。 3)向管中加入400μl LB液体培养基(不含抗生素),混匀后37℃震荡培养1h。使细菌恢复到正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 4)将上述菌液摇匀,取200μl涂布于含长那霉素的筛选平板上,正面放置0.5h。待菌液完全被吸收后倒置培养皿,37℃培养16~24h, 5)对照实验: 对照组1:以同体积的无菌二次水代替DNA溶液,其他操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2:以同体积的无菌二次水代替DNA溶液,取5μl菌液,稀释100万倍,涂布于不含抗生素的LB平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。 五、实验数据记录处理 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,各培养皿中的菌落数如下表所示:
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统,尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达:一个是表达量低,还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步,但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体,严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下,重组蛋白由强启动子进行表达,产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是,强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9],但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲,可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达,比如:诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题:蛋白重新折叠[10],构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建
1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白,一般选择胞表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比,胞表达的表达量更高,因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中,已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株(表1[13])。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案,因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比,突变了lon和ompT 两个基因[14],因此具有许多表达优势:产物积累少,缺少蛋白酶,防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲,针对不同的重组蛋白,宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子,就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA,比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL,Rosetta(DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫键,则需要宿主表达环境为氧化条件的。AD494宿主菌是硫氧还蛋白突变型,可以促进二硫键的折叠。Origami菌株为硫氧还蛋白突变和谷胱甘肽还原酶突变,进一步加强了二硫键在细胞的形成[18]。另外一方面,如果表达的重组蛋白对于宿主菌是有毒性的,则需要表达为包涵体的形式。 表1:常用于重组蛋白表达的宿主菌及其特点
大肠杆菌检测
大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱:36±1℃。1.2 冰箱:0~4℃。1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8 试管。1.9 吸管。1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。1.13 酒精灯。1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置 36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养 18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
大肠杆菌生化实验
细菌常用生理生化反应实验结果观察 一结果观察 1葡萄糖发酵实验 直接观察试管, 试管变黄者为葡萄糖发酵阳性菌,不变者为阴性菌. 左边为恶臭假单胞菌,有气泡并变为黄色;右边为大肠杆菌, 2V. P. 反应和甲基红试验: 将培养好的液体培养基分装于两个干净的小试管中,在一管中滴入2-3滴甲基红试剂, 溶液变红的为甲基红阳性菌,不变的为甲基红阴性菌. 在另一管中加入V. P. 试剂,在37℃保温15分钟, 变红者为阳性菌,不变者为阴性菌. VP,图为右边为大肠杆菌,溶液变红,为阳性菌。 3吲哚实验 在培养好的液体培养基中加入1厘米高的乙醚,振荡,静置分层,加入2-4滴吲哚试剂,在掖面交界出现红色者为吲哚反应阳性菌,不变者为阴性菌.
左边为大肠杆菌,出现红色阳性菌;右边为产气杆菌,颜色不变,阴 性菌。 4硝酸盐还原实验 在点滴板上滴入革里斯试剂A液和B液,如过溶液变红说明有亚硝酸盐,为硝酸盐还原阳性菌,如果不变色需要再倒出部分培养基在另外的小孔中再滴如耳苯胺试剂,如果变蓝,说明此菌为阴性菌;如果不变色,说明此菌为硝酸盐还原强阳性菌. 右下方恶臭假单胞菌,加入革里斯试剂A、B后不变色,再加入二苯 胺试剂后变蓝,为阴性菌;左上方大肠杆菌为红色。 5柠檬酸盐实验 直接观察斜面,斜面变兰色者为柠檬酸盐利用阳性菌,不变者为阴性菌.
左边产生蓝色,产气杆菌阳性;右边为大肠杆菌,阴性。 6明胶水解 向培养好的明胶培养基中加入酸性氯化汞或三氯乙酸溶液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为明胶水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌. 左边为大肠杆菌,出现透明圈,阳性;右边为枯草杆菌,阴性菌。 7 淀粉水解实验 向培养好的淀粉培养基平板上加入碘液,并铺满平板,菌落周围出现透明圈的菌为淀粉水解阳性菌,没有透明圈的菌为阴性菌.
大肠杆菌
目录 ? 1 概述 ? 2 分类 ? 3 性状及特点 (1) 原核生物 (2) 形态与染色 (3) 培养特性 (4) 生化反应 (5) 抗原构造 (6) 抵抗力 (7) 异养厌氧型 (8) 人体与大肠杆菌的关系 (9) 鉴别 (10) 生态系统中的地位 ? 4 致病性 (1) 致病物质 (2) 病原体 (3) 潜伏期 (4) 所致疾病 ? 5 检查法 (1) 细菌的分离鉴定 (2)卫生细菌学检查 ? 6 治疗方法 ?7传播途径 ?8 预防方法
大肠杆菌简介 大肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌,1885年由Escherich发现,分布在自然界,大多数是不致病的。主要附生在人或动物的肠道里,为正常菌群,少数的大肠杆菌具有毒性,可引起疾病。 婴儿出生后即随哺乳进入肠道,其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长,减少蛋白质分解产物对人体的危害,还能合成维生素B和K,以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖,几占粪便干重的1/3。 在环境卫生不良的情况下,常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌,可认为是被粪便污染的指标,从而可能有肠道病原菌的存在。因此,大肠菌群数(或大肠菌值)常作为饮水和食物(或药物)的卫生学标准。技术上,大肠菌群被定义为所有好氧或兼性好氧。 常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。侵入人体一些部位时,可引起感染,如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的,尤其是对孩子及老人。 1. 大肠杆菌性状及特点 (1)原核生物 大肠杆菌是细菌,属于原核生物;具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。 (2)单个菌体的形态与染色 大小0.4~0.7×1~3um,无芽胞,大多数菌株有动力。有普通菌毛与性菌毛,有些菌株有多糖类包膜,革兰氏阴性杆菌。 (3)代谢类型 大肠杆菌的代谢类型是异养厌氧型。 (4)菌落特性 在血琼脂平板上,有些菌株产生β型溶血。在鉴别性或选择性培养基上形成有颜色、直径2~3mm的光滑型菌落。大部分菌株发酵乳糖产酸产气,并发酵葡萄糖、麦芽胞、甘露醇、木胶糖、阿拉伯胶等产酸产气。IMViC试验为“+、+、-、-”。即为典型大肠杆菌。培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌,菌落呈深紫色,并有金属光泽,可鉴别大肠杆菌是否存在。 (5)抗性 较复杂,有O、K、H、F四种抗原。O抗原为脂多糖,已有171种,其中162种与腹泻有关,是分群的基础。K抗原有103种,为荚脂多糖抗原。从病人新分离的大肠杆菌多有K抗原,有抗吞噬和补体杀菌作用。根据耐热性等不同,K抗原分为L、A、B三种,其中L、B不耐热,有60种。F抗原至少有5种,与大肠杆菌的粘附作用有关、表明大肠杆菌血清型的方式是按O:K:H排列,例如O111:K58(B4):H2。
大肠杆菌
大肠杆菌的培养和分离 ——基础知识和操作过程梳理一、大肠杆菌 细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核,细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同,细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚,无荚膜,多产生外毒素;革兰氏阴性菌细胞壁薄,有荚膜,多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。 大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害,但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统,都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用,它的质粒是最常用的运载体,它也是基因工程中常用的受体细胞。 二、培养基配置 微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物,但不一定需要外界补充,有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌,培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤: 1.称量:准确称取各成分。蛋白胨0.5g,酵母提取物0.25g,氯化钠0.5g,加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 2.溶化:加热熔化,用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂,整个过程不断用玻棒搅拌,目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 3.调pH:用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 4.灭菌:在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基,加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内,1kg压力灭菌15min。
大肠杆菌文献综述
文献综述 禽大肠杆菌病的研究进展 郑琳红 西南大学荣昌校区动物医学系,重庆荣昌402460 摘要:禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起各种禽类的一种急性或慢性传染病,主要侵害鸡、鸭、鹅,以及各类珍、特禽,临床上有多种表现形式,其中以急性败血型、卵黄性腹膜炎和生殖器官损害较常见,危害性也最为严重。本文主要在病原学、流行病学、临床症状、病理变化和诊断与防治等方面对禽大肠杆菌病进行了综述。 关键词:禽大肠杆菌;流行特点;疫病防治;研究进展 禽大肠杆菌病(colibacillosis)是由致病性大肠埃希氏菌( E. coli )引起禽类的一种急性、慢性传染病的总称。其病型和病变复杂多样。本菌抗原结构复杂,血清型多,变异菌株不断出现,分布极广,不同地区有不同血清型,同一地区不同养殖场甚至同一养殖场同一种群也可能有多个血清型。本病的普遍性,给养禽业造成严重威胁和重大经济损失[1,2]。 禽大肠杆菌病常继发于其他致病因子或与其他致病因子一同作用,使其表现得复杂多变,往往使真正的罪魁祸首得以掩盖。禽大肠杆菌病发病频繁,容易反复发作,加上用药较乱,病原菌血清型多、抗原结构复杂,极易产生耐药性,使其防不胜防。1976年Smits等发现新城疫疫苗、传染性支气管炎疫苗免疫,支原体感染与大肠杆菌感染之间的关系,气雾免疫法及支原体感染大幅提高大肠杆菌感染率[3]。 1.病原学 大肠杆菌是人和动物肠道中的常见菌,多为条件性致病菌,当机体健康,抵抗力强时,这些菌株不表现致病性,当机体健康状况下降,特别是在应激情况下,其致病性增强,引起发病。致病性大肠杆菌在自然界中广泛存在,凡有哺乳动物和禽类活动的环境空气、水源和土壤中均有本菌存在。当禽舍通风不良、饲养密度大、卫生条件差、饲料质量不好、禽舍污染严重时,该病传播途径可经过消化道、呼吸道、交配等途径水平传播,还可通过其它多种途径,使种蛋被污染而进行垂直传播[1]。 禽大肠杆菌病病原是革兰氏阴性、非抗酸性、染色均一,不形成芽孢,两端钝圆的短杆菌,需氧或兼性厌氧。有时大小和形态可能是多变的,许多菌株有运动性,有周身
大肠杆菌实验报告
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构,使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性,原因是其基因发生了改变,产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下,细菌的基因突变率很低,而且突变是不定向的,因此在自然条件下,想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时,其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时,能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线(UV)有强烈的吸收作用,尤其是碱基中的嘧啶,它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此,紫外线通常作为诱变剂,用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛,诱变剂量越大,突变率高,诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键,过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下,菌株发生不定向的突变,想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株,因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变,则该菌株不能在抗性培养基上正常生长,只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外,对菌株还有较强的致死作用,因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此,通过本实验的操作,在合适的照射剂量的设置下,比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率,并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上,能了解诱变育种的机理和方法,为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种:大肠杆菌 仪器:超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂:牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml)、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基(400ml): 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min,倒平板,4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml):含抗生素50mg/L。(卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA,阻断细菌蛋白质的合成。) 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液(50mg/ml),按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌,取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中,充分震荡混匀,倒平板,2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液(106 ~ 108个/mL) ①固体培养:大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基,37℃培养24-48h。 ②菌悬液:用适量生理盐水刮洗菌落,倒入一个无菌小三角瓶(或试管)中,充分振荡使菌
大肠杆菌病的常用药物
- - . 禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌的某些致病性菌株引起的多种疾病总称,包括大肠杆菌性败血症、肠炎、脐带炎、肝周炎、心包炎、腹膜炎、全眼球炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、关节炎、肉芽肿等,并能导致胚胎和幼雏死亡。由于大肠杆菌血清型复杂,给免疫防治带来一定的困难,药物防治仍是控制禽大肠杆菌病的主要手段。yz.ag365yz.ag365 本文就防治禽大肠杆菌病的常用药物作一简述。- - 考试资料
- - . yz.ag365yz.ag365 一、β-内酰胺类抗生素yz.ag365yz.ag365 β-内酰胺类抗生素为化学结构中含有β-内酰胺环一类抗生素,主要包括青霉素类、头孢菌素类、β-内酰胺酶抑制剂。抗病作用机理均为抑制细胞壁的合成。yz.ag365yz.ag365 1、青霉素类。防治禽大肠杆菌病的青霉素类抗生素主- - 考试资料
- - . 要为半合成广谱抗生素氨苄西林、阿莫西林。氨苄西林、阿莫西林均耐酸、不耐酶,内服或肌注易吸收。阿莫西林耐酸较氨苄西林强,该药抗菌谱广,杀菌力强,作用迅速,阿莫西林的血清浓度比氨苄西林高1.5-3倍。阿莫西林对大肠杆菌有较强的抗菌作用,其体外抗菌谱等同于氨苄西林,但体内效果则增强2-3倍。yz.ag365yz.ag365 用法与用量:⑴氨苄西林:内服一次量为每千克体重10毫升或肌注为一次量每千克体重10毫升,1日2-3次。- - 考试资 料
- - . ⑵阿莫西林:内服一次量为每千克体重10-15毫升,1日2次。yz.ag365yz.ag365 2、头孢菌素类。为广谱半合成抗生素,具杀菌力强、抗菌谱广、毒性小、对酸和β-内酰胺酶比青霉素类稳定等优点,第三、四代头孢菌素对大肠杆菌具有较强的抗菌作用,因较贵而多用于宠物、种畜禽及贵重动物。临床上应用的有头孢噻呋、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟。yz.ag365yz.ag365 - - 考试资料
大肠杆菌
用大肠杆菌快速检测植物功能基因的研究 北京五中分校李思佳 指导教师韩竹戴毅新 【摘要】大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。大肠杆菌表达体系与植物表达体系相比具有培养条件简单,生长周期短,操作简便等优点。将植物基因分别转化大肠杆菌表达体系和植物表达体系,并在胁迫培养基中进行功能验证,分析结果表明大肠杆菌表达体系具有与植物表达体系相似的作用。 【关键词】大肠杆菌、基因分离鉴定、基因表达、功能验证、胁迫 【前言】 一、问题的提出 生物课上老师讲到细菌的用途和危害时,同学们自己归纳出了很多细菌的危害,如可以引发人和动物的肺炎、腹泻、败血症、霍乱和肺结核等疾病;植物的叶斑病和萎蔫等。细菌的益处是可以制酒、酱油、醋,还可以利用细菌发电。老师引导我们说:细菌(如大肠杆菌)还有很多用途,同学们课下可以查找一些资料,做一些实验探究。于是,我就查找了相关资料,了解到大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。国内有研究人员利用这个原核表达体系筛选出了植物的抗旱基因。那么这个体系除此之外还有哪些作用呢?这个体系与植物表达体系相比较具有哪些特点?带着这些疑问,在老师和家长的帮助鼓励下,我翻阅了相关书籍,从大肠杆菌的胁迫培养条件及体系开始进行了研究。 二、研究背景及目前国内外研究和应用现状 大肠杆菌属原核生物。细胞呈杆状,直径约1微米,长约2微米,两端钝圆,周身具鞭毛,可运动。革兰氏染色为阴性,不形成芽孢。在固体培养基生长的菌落为圆形,白色或黄白色,光滑而具闪光,低平或微凸起,边缘整齐。最适条件下培养20分钟可繁殖1代。大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌,是粪便中的主要菌种。一般生活在人的大肠中并不致病,但偶尔侵入到阑尾、胆囊、腹腔或泌尿系统时,可发生炎症。在工业生产中,大肠杆菌可用以制备L-门冬酰胺酶,此酶是治疗白血病效果较好的一种药物。在水质监测方面,根据其有无及其数量多少,可作为检测水质状况和污染程度的重要指标。大肠杆菌是现代生物学中研究最多的一种细菌,作为一种模式生物,其基因组序列已全部测出。大肠杆菌是微生物遗传学研究的材料和基因工程中最常用的宿
大肠杆菌培养实验报告
大肠杆菌培养实验报告 篇一:大肠杆菌检测实验报告 国标法测定大肠杆菌样本的细菌总数 实验目的 实验原理:国标法操作的原理 实验器材: 培养箱,10只移液管,1只250ml锥形瓶,5只大试管,试管架,4个平皿,500ml大烧杯1个,电子天平,纱布,脱脂棉,灭菌锅,PH计或PH试纸,100ml量筒,橡皮手套,超净台 实验药品: 磷酸盐缓冲液,蒸馏水,LB培养基,琼脂,5%NaOH,5%HCl 实验步骤: 一: 10只移液管,1只250ml锥形瓶,5只大试管,4个平皿,500ml大烧杯1个,100ml量筒进行洗涤,然后一起放入高压蒸汽灭菌锅中在121摄氏度条件下灭菌20min。灭完菌后烘干,完成后放入超净台中。 用酒精擦拭超净台,紫外消毒30min 二: 1:用电子天平称取成品LB 3.1241g和琼脂1.8756g放入250ml的洁净锥形瓶中。 2:用量筒量取125ml的蒸馏水
加入该锥形瓶中,制成培养基。 3:用棉花堵住该锥形瓶的瓶口,用牛皮纸包住瓶口,用橡皮筋扎牢,再将培养基放入灭菌锅中在121摄氏度之下灭菌20min。 4:灭完菌后放入超净台中备用。 三: 1:取1只无菌250ml锥形瓶,用量筒向其中加入49ml PBS 2:将1ml样品加入到该锥形瓶中,摇匀制成1:50的细菌溶液。 3:取4只试管,编号1—4 4:用无菌移液管分别向4只试管中加入9ml的PBS 5:用1ml无菌移液管从样品中移取1ml菌液加入到1中.震荡试管使菌液均匀。 6:用1ml无菌移液管从1号试管中移取1ml的细菌溶液加入2号试管中,摇匀 7:用另一只1ml无菌移液管从2号试管中移取1ml细菌溶液,加入3中,摇匀......以此类推直至4只试管中均加入了细菌溶液。 9:取4只平皿,编号1—4 10:分别用4只无菌移液管从这4只试管中移取1ml的菌液置于4只平皿中,加入45—50摄氏度温度下的培养基,约15mm厚度。缓慢旋转平皿使菌液与培养基混合均匀;待培养基冷凝后倒置。
大肠杆菌常见的类型你知道多少
大肠杆菌常见的类型你知道多少? 1.大肠杆菌败血症6-10周龄的肉鸡多发,尤其在冬季发病率高,死淘率通常在5%-20%,严重的可达50%。雏鸡在夏季也较多发,病鸡精神不振,采食减少,衰弱和死亡。病鸡腹部膨满,排出黄绿色的稀便。特征性的病变是纤维素性心包炎,气囊混浊肥厚,有干酪样渗出物。肝包膜呈白色混浊,有纤维素性附着物,有时可见白色坏死斑。脾充血肿胀。 2.死胚、初生雏卵黄囊感染和脐带炎种蛋内的大肠杆菌来自种鸡卵巢和输卵管及蛋壳被粪便的污染。侵入种蛋内的大肠杆菌在孵化过程中进行增殖,致使孵化率降低,胚胎在孵化后期死亡,死胚增多。孵出的雏鸡体弱,卵黄吸收不良,脐带炎,排出白色、黄绿色或泥土样的稀便。腹部膨满,出生后2-3天死亡,一般6日龄过后死亡率降低下来。即使不死的鸡,也是发育迟滞。死胚和死亡雏鸡的卵黄膜变薄,呈黄泥水样或混有干酪样颗粒状物、脐部肿胀发炎。4日龄以后感染常见心包炎,其中急性死亡的病雏几乎见不到病变。 3.卵黄性腹膜炎及输卵管炎腹膜炎可由气囊炎发展而来,也可由慢性输卵管炎引起。发生输卵管炎时,输卵管变薄,管内充满恶臭干酪样物,阻塞输卵管使排出的卵落到腹腔而引起腹膜炎。 4.出血性肠炎埃希氏大肠杆菌正常只寄生在鸡的下部肠道中,但当发生饲养和管理失调,卫生条件不良,各种应激因素存在,使鸡的抵抗力降低,大肠杆菌就会在上部肠道寄生,从而引起肠炎。病鸡羽毛粗乱,翅膀下垂,
精神委顿,腹泻。雏鸡由于腹泻糊肛,容易与鸡白痢混淆。剖检病变,主要表现在肠道的上1/3至1/2肠粘膜充血、增厚、严重者血管破裂出血,形成出血性肠炎。 5.其它器官受侵害的病变大肠杆菌引起滑膜炎和关节炎,病鸡跛行或呈伏卧姿势,一个或多个腱鞘、关节发生肿大。发生大肠杆菌肉芽肿时,沿肠道和肝脏发生结节性肉芽肿,病变似结核。此外,大肠杆菌还可引起全眼球炎、脑炎等。 6.慢性呼吸道综合症鸡先感染支原体,造成呼吸道粘膜被损害,后继发大肠杆菌的感染。病的早期,上呼吸道炎症,鼻、气管粘膜有湿性分泌物,发生罗音、咳音,发展严重时,发生气囊炎、心包炎,有纤维素渗出,肝脏也被纤维素物质包围,肺部有肺炎,呈深黑色,硬化。 7.皮下感染头部肿胀由于表皮损伤侵入,感染扩散到关节和骨部,引起这些部位的炎症。有一些病毒感染后,继发大肠杆菌急性感染,造成头部肿胀,即肿头综合症,双眼和整个头部肿胀,皮下有黄色液体及纤维素渗出,可从局部分离出大肠杆菌。
大肠杆菌的管理与防治
大肠杆菌的管理与防治 本病属于条件致病性病原,因此非常容易在防疫密集时刻或强应激时发生,因此在一些时间点上进行控制。 1、两周龄以内 两周内特别在7日龄和14日龄左右极易发生,应严格控制温度,注意通风换气,添加敏感药物。2日龄前温度维持在35℃以上,以鸡背温度为标准,临床以10%出现张口呼吸为标准,特别在冬天非常关键,适当高温育雏可明显降低一些疾病发生率,3日龄开始递减温度,通风,换气。温度每天递减0.5~1℃,到24℃时,不再递减。通风换气应使用排风扇,以免造成舍内温差过大。适时通风可保证适宜的湿度,可避免因湿度大、空气污浊诱发大肠杆菌病。控制温度同时添加药物预防,可用头孢类药物,如头孢曲松每克加水10~20kg,连用3d。或者和氧氟加替联合应用。 2、21~35日龄 这一阶段是鸡大肠杆菌病的高发阶段。饲养管理上要求温度控制在24℃左右,进一步加强通风,添加药物预防大肠杆菌病,还应注意添加抗球虫病药物预防球虫。预防大肠杆菌病可采用氨基糖苷和林克霉素类联合应用。如阿米卡星饮水,1g阿米卡星加水20kg,连用3d。加上林可霉素1g兑水10kg。抗球虫药可用地克珠利饮水或用三字球虫粉全天量1次饮水,既可防大肠杆菌病又可防球虫病,此阶段成果亦可维持半个月左右。 3、35~55日龄 此阶段易发生大肠杆菌性关节炎及大肠杆菌性肠炎,采用左旋氧氟沙星全群饮水,15g5左旋氧氟沙星加水200kg,并配合林克霉素连用3~5d。即可控制大肠杆菌病,也可控制慢性呼吸道病。 此外,大杆感染部分来源于不洁的饮水,因此定期对饮水系统进行消毒,带鸡消毒非常关键。国内部分专家不提倡对鸡群进行带鸡消毒,认为可能会导致肠道菌群失调,或者会对肠粘膜造成损伤,个人认为这个担心并不存在。做为人用饮用自来水都含一定浓度的漂白粉,何况鸡呢?只要浓度控制好即可。 常见大杆药物 一、β-内酰胺类抗生素 1、青霉素类。 用法与用量:
大肠杆菌实验总结
分离
划线分离:方法简单,但单菌落较难分开。 涂布分离:单菌落更易分开,但操作复杂。 (一)制备LB培养基(通用的细菌培养基) 1、配方:蛋白胨10.0克,牛肉膏5.0g,氯化钠10.0克,水1000ml (配固体培养基再加琼脂20克) 2、流程 计算称量溶解调pH分装加塞,包扎灭菌倒平板
培养基配制(特) 培养基应现配现用,每次配置350ml,一次性使用完毕。 1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中: 2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口,摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、 溶解。待灭菌。 ①分装:注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用___三角漏斗 _。 ②加塞:试管用塑料盖或__棉花塞___;三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。 ③包扎:用_牛皮纸__或报纸 ④灭菌:高压蒸气灭菌法 1)加水:向外层锅内加入适量的水,加水的要求是不触及内胆 _. 2)装锅:物品放置的要求__整齐、稳定、留出空隙:加盖:将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺 栓松紧一致,勿使漏气。3)加热排气:打开排气阀,使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后,关上排气阀。4)保温保压:当锅内压力升到1_kg/cm2时,控制热源,维持压力至15 _min。5)出锅:切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力降至_0_时,打开_排气阀__,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品。否则会因锅内压力较高,打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染,甚至使容器爆炸。