色谱分析法基本原理

色谱分析法基本原理

色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子

交换色谱与排阻色谱等方法。

吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。

分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。

离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而

使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。

排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小

的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。

色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。

分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸

色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。柱色谱法

所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤

维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。

吸附剂的填装干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，

加入适量的流动相，旋开活使流动相缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，

使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持有

充分的流动相留在吸附层的上面。湿法：将吸附剂与流动相混合，搅拌以除

去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入流动相，将附着于管壁的吸附剂

洗下，使色谱柱表面平整。俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下，液

面将柱表面相平时，即加试样溶液。

试样的加入除另有规定外，将试样溶于层析时使用的流动相中，再沿色

谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。或将试样溶于适当的溶剂中。与少

量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽后使呈松散状；将混有试样的吸附剂加在

已制备好的色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解，可将试样与适量的吸

附剂在乳钵中研磨混匀后加入。

洗脱除另有规定外，通常按流动相洗脱能力大小，递增变换流动相的品

种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有

时，再改变流动相的品种和比例。操作过程中应保持有充分的流动相留在吸

附层的上面。

吸附柱色谱的实验技术

https://www.360docs.net/doc/0d1538219.html, 2005-5-20 16:56:16 来源：赛基论坛

1．吸附剂的选择及处理

吸附剂分为无机吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙，有机吸附剂如纤维素、淀粉、蔗糖、聚酰胺等。一般来说，所选择吸附剂应有较大的比表面积和足够的吸附能力：对欲分离的不同物质应有不同的吸附能力，即有足够的分辨力；与洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学反应；吸附剂颗粒均匀。吸附剂一般先经过筛获得均匀的颗粒（100-200目），对含有杂质的吸附剂可用有机溶剂如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等浸泡处理或提取除去，有些吸附剂可用沸水洗去酸碱使呈中性，有些需经加热处理活化。

2. 溶剂与洗脱剂

两者常为同一组分,但用途不同。习惯上把用于溶解样品的溶液称为溶剂，把用于洗脱洗脱柱的溶液称洗脱剂。原则上所选的溶剂和洗脱剂要求纯度高，与样品和吸附剂不起化学反应，对样品的溶解度大，粘度小，易流动，易与洗脱的组分分开。常用的溶剂和洗脱剂有饱和碳氢化合物、醇、酚、醚、卤化烷、有机酸等。

3．柱的装填和样品的加入

色谱柱一般为玻璃或有机玻璃管制成，柱下端装上一块2-4号烧结玻璃或垫一层玻璃丝以支持吸附剂，管内装吸附剂。有条件可附加压或减压装置，使流速保持恒定，色谱柱外也可配恒温管套。

装柱的方法通常是将一种在适当溶剂中的吸附剂调成糊状，慢慢地倒入关闭了出水口的柱中，

同时不断搅拌上层糊状物，赶去气泡，并使装填物均匀的自然下降，装置所需要的高度后，打开出水口，让溶剂流出。注意柱的任何部分不能流干，即是说、再柱的表面始终保持着一层溶剂。

小心地用移液管把样品液绕柱内壁小心地加入，不要冲击着吸附剂的表面。加样的另一个办法是用一个注射器和蠕动泵把样品直接送到柱表面上。

3. 洗脱

在整个洗脱过程中，要使洗脱液通过柱时保持恒定的流速，可以用调节"操作压"来调控（操作压相当于在柱上面的贮液瓶中溶剂的水平和柱出口位置的水平之差）。另一个方法是时用蠕动泵。

洗脱过程中柱内不断发生溶解（解吸），吸附，在溶解，在吸附。被吸附的物质被溶剂解吸，随着溶剂向下移动，又遇到新的吸附剂又把该物质自溶剂中吸附出来，后来流下的新溶剂又在使该物质溶解而向下移动。如此反复解析，吸附，经过一段时间后，该物质向下移动至一定距离，此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力及溶剂对该物质的溶解能力有关，分子结构不同的物质溶解度和吸附能力不同，移动距离也不同,吸附较弱的就易溶解，移动距离较大。经过适当时间后，各物质就形成了各种区带,，每一区带可能是一种纯物质，如果被分离物质是有色的，就可以清楚地看到色层。随着洗脱剂向下移动，最后各组份按吸附力的不同顺序流出色谱柱，以流出体积对浓度作图，可得由一系列峰组成的曲线，每一峰可能相当于一个组分。

吸附色谱法

https://www.360docs.net/doc/0d1538219.html, 2005-5-20 16:55:23 来源：赛基论坛

吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于该吸附剂对不同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。该法是最早期的一种色谱分离技术，主要应用于某些分子量不大的物质的分离提纯，个别的如羟基磷灰石也适用于生物大分子的分离提纯，应用范围比较广。

吸附是表面的一个重要性质之一。任何两相都可以形成表面，其中某相或溶解在某相中的溶质，在该表面的密集现象称为吸附。在固体与气体之间、固体与液体之间、液体与气体之间都可以发生吸附现象。吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来，然后再吸附、再解吸，形成一个动态平衡。吸附色谱过程就是不断地产生吸附与解吸的矛盾统一的过程。

凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质，都称为吸附剂；聚集于吸附剂表面的物质就成为吸附物。

应用最为广泛的一种极性吸附剂，主要优点是化学惰性，具有较大的吸附量。硅胶的吸附活性取决于含水量，当含水量小于1%时活性最高，大于20%时吸附活性最低，一般采用含水量10-20%的硅胶。

用硅胶进行色谱分离时 崆敖 谢罨 痛炕 ４炕 唇档凸杞夯钚裕 笛楸砻鳎 杞杭尤?-20%水后，表面活性部位被纯化，样品溶质在吸附剂上的吸附和解吸过程加快，同时传质作用得到改善，最终柱效大幅提高。活化是指在150-195℃加热硅胶，活化覆盖有第一层小分子的硅胶，提高硅胶对样品溶质的吸附能力，其缺点是导致硅胶极性上升，产生催化反应或不可逆吸附。

此外常用的还有：1）氧化铝分为碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝，其吸附活性与含水量关系很大，在一定温度下除去水分可使氧化铝活化；2）活性炭分为粉末活性炭、颗粒活性炭和锦纶活性炭，其吸附能力在水溶液中最强，使用前一般在150℃加热4-5小时，将吸附的大部分气体除去，锦纶活性炭则在100℃以下进行。3）聚酰胺国外称尼龙，国内称锦纶，特别适合低分子量化合物的分离，如酚、羧酸、DNP-氨基酸、醌几芳香族化合物等。4）聚苯乙烯吸附剂5）磷酸钙在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一适用于生物活性高分子物质分离的吸附剂，主要用于蛋白质的色谱分离、也适用于较小分子的核酸如转运RNA。