抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析

发布日

20070423

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栏目

化药药物评价>>化药质量控制

标题

抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析

作者

审评三部

部门

正文容

审评三部审评五室英

摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液

浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。

关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证

抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性；

②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组

成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。

一、方法的建立

1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方

法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。

2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择

可参照中国药典建立，在此不再赘述。

3、检定方法的确定

可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。

4、抗生素溶液的稳定性

选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条

件。

二、方法的验证

验证的目的是证明采用的方法适合于检测的要求。

验证容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、专属性、适用性和线性。

在申报资料中常见的错误有：线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理；精密度的测定方法不正确；无专属性试验。下面就方法验证的容与常见的错误加以简述。

1、专属性考察杂质、辅料等对测定结果准确性的影响，可通过以下试验验证：

(1) 用辅料等替代抗生素进行试验，应不产生抑菌作用。

(2) 采用回收率试验进行验证，至少有9对以上数据，并进行显著性检验。

2、线性

线性系指在设计的围，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。做抗生素微生物检定法试验时，被测物浓度应转换为对数浓度。

管碟法中抗生素溶液浓度的对数值与抑菌圈直径或面积之间的关系在一定的浓度围，应呈线性关系。用一剂量法测定。

Ⅰ、测定方法

(1)确定直线中心点的抗生素浓度。中心点浓度C 0应使所致抑菌圈的直径在16～18mm。

(2) 线性测定的剂距一般用等比级数，可选用1:0.80、1:0.85或1:0.88等，稀释成适当的浓度系列。

(3)每个浓度为一组，至少设8组，一般每组3～5个双碟，每组双碟数m应相等。

(4)管碟法的线性考察，其直线的最低浓度端与最高浓度端的确定，应选择比所致抑菌圈直径在18～22mm高的浓度为最高浓度，即高浓度应涵盖能致抑菌圈直径在18～22mm的浓度。按中心浓度等比的关系，求算最低浓度。但最低浓度端应涵盖含量（效价）测定时高、低剂量之比为4：1的低剂量浓度。

(5)取制备好底层及菌层培养基的双碟，每3～5个双碟为一组，共分n组

(6)各组滴加完毕后，将双碟在规定温度下培养一定时间，测定各抑菌圈直径。

(7)以各组浓度C的对数值log与相对应各浓度的直径与中心点浓度直径的差值作线性分析，得回归方程及相关系数r，并对相关系数作显著性检验，同时绘制线性图。

Ⅱ、常见错误

（1）直接以浓度与直径作线性关系图。

（2）虽然以抗生素溶液浓度的对数值与抑菌圈直径作线性关系图，但不是等比系列，如浓度设计为：1、2、3、4、5、6、7u/ml等。

以上两种现象显然违背抗生素微生物检定法的原理，也不可能得出直线关系。

（3）抑菌圈直径太大或太小：大于24mm或小于14mm均不正常。如：

效价测定中高浓度溶液所制的抑菌圈直径大于26mm时已超出双碟的直径围而无法测量，低浓度溶液所制的抑菌圈直径小于14mm时，其浓度的对数剂量与直径已不成线性，而在线性研究中结果为抑菌圈直径在5mm～35mm围与浓度的对数剂量线性关系良好，显然上述数据是不符合实际情况的。

（4）以浓度与效价建立线性关系。如：

剂量浓度（u/ml）0.0010.010.02010.02510.04020.05020.1004

该方法显然不符合抗生素微生物检定方法学中线性的含义，线性是指滴加抗生素溶液的浓度与所致抑菌圈直径或面积的关系，若以浓度与效价建立线性关系，则是利用已建立好的方法去测定含量的高低，而非对方法本身进行验证。况且由于高低剂量相差较大，低者仅为1u/ml，高者达50u/ml，也可能不在同一线性围。

以上几种结果均不是从真实试验得到，也无法进行实际实验操作。

3、准确度（回收率％）准确度系指用该方法测定的结果与真实值接近的程度，通常用回收率（％）评价。准确度验证，可根据具体试验情况选择如下试验方法。回收率试验一般用至少9次测定结果进行评价，按标示量的80％、100％、120％分别投入已知量的被测物，分别测定3次。标示量的80％、120％的回收率可在线性围调整标准品的剂量，使其满足抗生素微生物检定法的要求。应报告己知加入量的回收率或测定结果平均值与真实值或认可参照值之差及其可信限。

⑴模拟回收率试验：按处方成分和比例，分别加入敷料和已知量的被测物，测定回收率。

⑵加样回收率测定：如不能得到制剂的全部组分，可先测定制剂中被测物的量后，再加入己知量的被测物，根据被测物的原含量和加入量，计算回收率。

4、精密度

Ⅰ、测定方法

⑴重复性试验至少用9次测定结果进行评价，如制备80％、100％、120％三个不同浓度的样品，各测定3次进行试验，其中80％和120％浓度按抗生素微生物检定法的要求，重新估计效价后进行测定，再折算测定结果。或把被测物浓度当作100％，至少测定6次的结果进行评价。

⑵中间精密度考察测定结果的日间差、不同分析人员之间的测定结果的差异。

Ⅱ、常见错误

以一个浓度点重复测定n次，得到n个抑菌圈直径数据，对抑菌圈直径直接进行统计分析，RSD%结果常常是小于2%。

例：浓度5u/ml，直径测定结果：16.75、17.00、16.88、16.58、17.02、16.55, RSD% = 1.2%. 由于管碟法碟间差异很大，需通过统计分析分除碟间差异才能得到含量测定结果，此种方法不但不符合抗生素微生物检定法的原理，在实验中也得不到这样的结果。正确的方法应是对不同次的效价测定结果进行统计分析。

5、耐用性适用性系指测定条件有较小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，成为该方法可用于提供常规检验的依据。如果测定条件苛刻，则应注明。管碟法主要考察不同来源及批号的培养基、培养基的pH值、缓冲液的pH值及抗生素溶液稳定性等对测定结果的影响。

由于一般均为已有国家标准的注册品种，方法较成熟，目前对抗生素微生物检定法方法学验证中耐用性进行考察的较少

微生物限度方法学验证

WOIRD格式微生物限度检测方法学验证方案&D.|[0w#j!Q+{/w 7^#E:k'p(t9J!T 3W#O&W!d8S*\7k!y$k!C1A |*Q4X*I)[5@8g %_8H0}!X:c5V4s :w%J'K)}0Q-W :H1f9N$[4V7L7} 文件编号：P-AMV002-1101 "r%|2C7e-IY#s%f 1v8U8D4M(n(q*a6o3e2f0z/_ 9`'j5[+y9c&C)D!O*O \%X:d,r0C(o3D "A2c,\6C'j+^ (L1L-n3{/J;K 执行前批准签字页2N+}8E8x%C!M1b2~1o'} 方案起草姓名公司/岗位签字日期 :c"s'R:u"l1q#l'o)}8h (@.}&N#s;[2E)H&U!R 1G5Q-h5N)|+I2p 方案审核姓名公司/岗位签字日期 +N:w0{4j"`"} -x4r(Z#P;a3Z/|0U 1\2P&v6j*`2h 方案批准姓名公司/岗位签字日期$p1h:X#G"u.} )B;d.V7R!@7t5v&D 9a0l!i,W4p4o6f+Z4V 7s*X3F8A7B3q"`1g 6T9y;U,k+k9b 目录 ,t,n2w&_4mT 1.目的4 2.范围4,V*l"_%Q5f,K#k 3.责任者及职责43^X*Q$x(E3g:B)E

4.验证简介4 5．验证过程7 6．结果判断76c9[/O1U&R 7．结论和建议7%{)x.{$f%I 8．异常情况报告7*E.Q.`;?!k#q 9．再验证7 10．附件8/O0@.@8O!`:c5c1n!k 1L)N.^2w+d3Y%V 1.目的$M;j2K6p'|:y3F'K+K 按照中国药典2010版（第一部），采用平皿法对龙加通络胶囊（成品）进行微生物限度检查，本方案是对此方法进行验证。;x'?8a'^6C5@!^ 2.范围&J+b'o7r7m6Z5t 龙加通络胶囊成品8A,S/U]3h1J 3.责任者及职责部门职责 QC起草并审核验证方案进行验证试验的具体操作完成验证记录中相关操作记录的填写根据验证结果起草和审核验证报告6q5D5e1|(h,f3C QA审核并批准验证方案和验证报告(S&h:^!z#k,K:B1Q!j)?&^ 监督验证方案的实施7?4y(`6P(r 4.验证简介 4.1定义 CFU：菌落数供试液3].N/E/p"O8}6C7R4d 取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。'S#h$n1U:X's/J)e"C 试验组取规定量供试液采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。菌液组测定所加的试验菌数。%I8Y$G*Q4f;u.C*|%l+N 样品组样品溶液菌悬液（50-100CFU）稀释液平均菌落数 (CFU/皿) 供试液对照组+-+C供试液对照组3G#_,O-A'P#P;H 试验组+++C试验组菌液组-+-C菌液组'z5n%U:j2A(~"}N 4.2菌悬液 4.2.1菌种及来源(y)W#A2Q$p.I8y4M4m"z.|#p 本次验证涉及到金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，其详细情况如下：培养基名称名称及代号编号批号代次有效期至来源

微生物限度检查办法验证方法

精心整理微生物限度检查方法验证方案 1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4

4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：

药品微生物检验替代方法验证指导原则

药品微生物检验替代方法验证指导原则本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。微生物检验的类型及验证参数药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。表1 不同微生物检验类型验证参数注：尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。替代方法验证的一般要求在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法

抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析

发布日 20070423 期栏目化药药物评价>>化药质量控制标题抗生素微生物检定方法学验证中的常见问题分析作者审评三部部门正文容审评三部审评五室英摘要：本文对抗生素微生物检定法中的管碟法在方法学验证中的常见问题如线性与围中溶液浓度与直径的关系、精密度的测定方法等进行了分析，归纳其错误的问题，给出了正确的操作方法。关键词：抗生素微生物检定法多组分抗生素方法学验证抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素测定方法。自20世纪40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价已被化学分析法所取代，但由于①微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素品种的抗菌活性； ②多组分抗生素由于结构与不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和生物活性间的关系；③许多抗生素品种由于各种原因如无特征紫外吸收等，目前没有适当的化学分析方法表征其活性，故抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要的地位，且短期化学分析法不可能完全取代微生物检定法。中国药典2005年版仍采用抗生素微生物检定法中的管碟法测定其效价，目前申报已有国家标准的该类制剂较多，在质量研究中存在诸多问题，现就常见的问题加以分析，希望对注册申请人有所帮助。一、方法的建立 1、供试品与标准品的同质性抗生素微生物检定法的原理以供试品与标准品同质为前提，方

法建立前，首先应确定供试品与标准品是否同质，包括化学结构、所含组分及组分比例的一致性，对于制剂还要考虑辅料的影响是否造成供试品与标准品不同质。 2、培养基、试验菌、缓冲液和培养条件的选择可参照中国药典建立，在此不再赘述。 3、检定方法的确定可采用一剂量法（标准曲线法）、二剂量法及三剂量法等。一般确定线性与围采用一剂量法（标准曲线法），常规含量测定采用二剂量法，标准品标定采用三剂量法。 4、抗生素溶液的稳定性选定的品种可参照中国药典现行版附录抗生素微生物检定法的品种，若溶剂和缓冲液与其不同，应考察抗生素储备溶液和测定溶液在室温、40℃和不同pH值缓冲液中，以及放置不同时间的稳定性，以确定抗生素储备溶液和测定溶液的存放时间和条件。二、方法的验证验证的目的是证明采用的方法适合于检测的要求。验证容有：准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、专属性、适用性和线性。在申报资料中常见的错误有：线性测定不符合抗生素微生物检定法一剂量中心浓度等比测定的原理；精密度的测定方法不正确；无专属性试验。下面就方法验证的容与常见的错误加以简述。 1、专属性考察杂质、辅料等对测定结果准确性的影响，可通过以下试验验证： (1) 用辅料等替代抗生素进行试验，应不产生抑菌作用。 (2) 采用回收率试验进行验证，至少有9对以上数据，并进行显著性检验。

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案 1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件：根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、

微生物限度方法学验证

微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。二、菌种、培养基及稀释液表1菌种

表2培养基

表3对照用培养基

表4试剂

稀释液：（1）pH6.8缓冲液取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。（2）0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。（4）靛基质试液

取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～ 100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。四、验证内容 1、计数方法验证

抗生素微生物测定法操作规程

抗生素微生物测定法操作规程 1．目的：建立抗生素微生物测定操作规程，便于操作者正确进行抗生素效价测定。2．适用范围：适用于抗生素的效价测定。 3．责任人：QC质量检验员 4．正文： 4.1 仪器设备与试液： 4.1.1 仪器设备 4.1.1.1 操作室：应在抗生素检定室中进行。 4.1.1.2 超净工作台：（用于菌种的接种或传代） 4.1.1.3 恒温培养箱：隔板上可备有带孔的玻璃板并垫平。 4.1.1.4 电热鼓风干燥箱 4.1.1.5 电热压力蒸汽灭菌器 4.1.1.6 电热恒温水浴锅 4.1.1.7 天平：分析天平，感量0.1mg 4.1.1.8 游标卡尺：精度0.05mm，长度125mm。 4.1.1.9 双碟：为硬质玻璃培养平皿，内径90mm，高16～17mm，碟底厚薄均匀水平，无气泡。 4.1.1.10 陶瓦盖：内径约130mm，外径108mm，平坦，吸水性强。 4.1.1.11 钢管：内径（6.0±0.1）mm 或（7.8±0.1），高（10.0±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端面光滑平坦，管壁厚薄一致。 4.1.1.12 钢管放置器：置于半无菌操作间内，应保持清洁，防止抗生素污染。可定期按钢管放置器操作规程进行消毒。 4.1.1.13 毛细滴管：用玻璃管拉制，管口光滑。 4.1.1.14 称量瓶：25ml、50ml、100ml、200ml、250ml 4.1.1.15 刻度吸管：1ml、2ml、5ml、10ml、20ml 4.1.1.16 移液管2ml、5ml、10ml、20ml 4.1.1.17 其他玻璃仪器 4.1.2 试液： 41.2.1 缓冲液、磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.8） 4.1.2.2 生理盐水 4.1.2.3 0.1%新洁尔灭 4.1.2.4 5%石炭酸 4.1.2.5 75%乙醇溶液（配制酒精棉球用） 4.1.2.6 3%煤酚皂溶液

微生物方法学验证范本

编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案起草人：年月日审核人：年月日年月日年月日批准人：年月日目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告验证立项表（REC）立项题目立项部门申请人

申请日期要求完成日期验证类别负责部门参与部门及人员验证原因质量部审核意见审核人：日期：验证领导小组审批人：日期：审批意见备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。

3.判定标准 3.1验证小组成员姓名职务职责组长负责验证方案、报告的批准项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号菌珠名称传代次数大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501

抗生素效价测定操作规程

QCA/QC-SOP-006 1.主题内容和适用范围本规程规定了公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定方法及要求。本规程适用于公司外购原料药品及生产成品中抗生素的效价测定。 2.引用标准《中国药典》2010年版二部。 3.术语抗生素微生物检定法：在适宜的条件下，根据量反应平行原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）方法。抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。本法采用的是管碟法。 4.操作技术（仪器与用具） 4.1操作室：光线明亮，操作间分a.一般操作间b半无菌操作间。室温控制20-25℃。注意抗生素的污染。 4.2双蝶：内径90mm高16-17mm.用后经高压灭菌倒出培养基后，置专用洗液或清洁液中浸泡过夜，冲洗，沥干150-160℃干热灭菌2小时或高压灭菌121℃30min,备用。 4.3陶瓦盖：内径103mm,外经108mm,吸水性强，定期清洗、干燥或干热灭菌。 4.4钢管：内径6.0±0.1mm高7.8±0.1mm或8.0±0.1mm,10.0±0.1mm.重量差异不超±0.05g. 用后置1:1000苯扎溴铵溶液内浸泡2h以上,再灭菌洗涤,先用水洗,超声波30min或用去污粉的沙布条串擦内外壁,水冲洗,淋干,PW冲洗3次150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.5钢管放置器 4.6恒温培养箱:隔水式为宜35-37℃ 4.7灭菌刻度吸管:用于吸取菌液及培养基（5ml、20ml），用后立即置5%石碳酸或1:1000 苯扎溴铵溶液中消毒后再常规洗涤.150-160℃干热灭菌2小时备用. 4.8玻璃容器:滴定管、移液管、刻度吸管、容量瓶.符合一等品规定用前用清洁液浸泡, 水洗、PW冲3次

微生物限度检查办法验证方法

微生物限度检查方法验证方案 1. 目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件：根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3

微生物检验方法验证方案

微生物限度检查方法（平皿法）验证方案目录一、验证方案的制定二、验证方案的起草与审批三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 2．验证方法步骤 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.2验证试验操作 3.3试验结果 4．验证结果评价分析

5．附件微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定二、验证方案的起草与审批 1验证方案的起草

2．验证方案的审核与批准验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2．验证方法步骤 2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。 2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、

抗生素微生物检定法

抗生素微生物检定法 --------2017 1 简述抗生素微生物检定法系在适宜条件下，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。依试验设计原理不同，可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。《中国药典》也采用这两种方法。抗生素微生物检定管碟测定法系琼脂扩散法，是利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。抗生素微生物比浊法是将一定量的抗生素加至接种有试验菌的液体培养基内，混匀后，经培养，测量培养基的浊度。此法系根据抗生素在一定的浓度范围内，其浓度或浓度的数学转换值与试验菌生长产生的浊度(浊度与细菌数量、细菌群体质量及细菌细胞容积的增加之间存在直接关系)之间存在线性关系而设计，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品与供试品对试验菌生长抑制的程度，计算出供试品的效价。抗生素效价以“单位(u)”或“微克(μg)”表示。抗生素管碟测定法 2 仪器与用具 2.1 操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100级~10000级）及空调设备，控制室温在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。操作台应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内抗生素污染。 2.2 双碟内径约90mm , 高16~17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。

2015版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程

微生物限度/无菌方法学验证流程 1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐， 2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间） 3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证： 1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天（若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证）五种实验菌分别验证 1金黄色葡萄球菌 2铜绿假单胞菌 3枯草芽孢杆菌 4白色念珠菌 5黑曲霉菌五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间假设验证一次成功 3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间 2.控制菌适用性验证：共需要20天大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证： 1.方法适用性验证：验证实验共需要30天（若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证）五种实验菌分别验证 1金黄色葡萄球菌 2大肠埃希菌菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5白色念珠菌 6黑曲霉菌 6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行假设验证一次成功每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等，方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认

抗生素微生物检定管碟法

抗生素微生物检定管碟法抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法；（2）比浊法；（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。管碟法：利用抗生素在摊布特定试验菌的固体培养基内成球面形扩散，形成含一定浓度抗生素球形区，抑制了试验菌的繁殖而呈现出透明的抑菌圈。此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计算出供试品的效价。原理：利用抗生素在固体培养基中的平面扩散作用，依据量反应平行线原理并采用交叉实验设计方法，在相同实验条件下通过比较标准品（已知效价）和供试品两者对所接种试验菌产生的抑菌圈（直径或面积）大小，来测定供试品效价的一种方法。管碟法的操作步骤： 1、预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定：一剂量法中心点的抑菌圈直径应在16～17.5mm，二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm。 2、试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。 3、双碟的制备：每只双碟加底层培养基约20ml，待培养基凝固后，将双碟放入35～37℃培养箱中，待用。 4、供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。 5、菌层的制备：注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。 6、滴加抗生素溶液：注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。 7、双碟的培养：根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。 8、抑菌圈的测量：抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺 9、结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果。操作要点第一步一般应制成500或1000单位/毫升的溶液，以后逐步稀释至供试浓度的溶液，稀释步骤应为3～4步。溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。标准品溶液与供试品溶液浓度的比值D应控制在±5%以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。试验菌的菌龄对抑菌圈有一定影响。故检定时应保持菌种及菌液的新鲜。一般菌种一月转种一次，冰箱冷藏保存。对易变异的菌株，如藤黄微球菌等在制备菌悬液前进行单菌分离；其他菌株可半年分离一次。试验菌传代最好不超过5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在65℃加热30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢85%以上。加入菌悬液的体积，一般不少于0.3ml，并且不大于上层培养基体积的2%。如果加入菌悬液的体积过小，则在同次实验中，不同次加入菌悬液的体积相差较大，造成实验误差；如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于

微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据《中国药典》2015版。 3 范围所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株

铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将

微生物限度方法学验证方案(沙门菌)剖析

微生物限度检测方法学验证方案文件编号：YZ-WJ-001-0

批准签字页

目录 1.目的 (4) 2.责任者及职责 (4) 3.验证简介 (4) 4．验证过程 (5) 5．结果判断 (5) 6．结论和建议 (5) 7．再验证 (5) 8．附件 (5) 附件1：培养基的灵敏度复核 (6) 附件2：稀释液的无菌性检查 (7) 附件3：方法验证 (8) 附件4：培养基厂家报告 (9)

1.目的按照中国药典2015版（第四部）规定，确认所采用的方法适合该药品的沙门菌的测定。照此检测法和检验条件进行沙门菌检查，能保证结果的准确、可靠。 2.责任者及职责 3.验证简介验证时，按供试液的制备控制菌检查法所规定的方法及要求进行，验证实验至少进行3次独立平行实验。 3.1验证用菌株 3.2样品名称及数量 3.3实验用品

3.4培养基检查人：复核人：检查日期： 4．验证过程 4.1试验器具准备试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和所用仪器一同放入无菌室的传递厨内。用消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。 4.2测定 4.2.1 按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。 4.2.2 用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。 4.2.3菌液制备：沙门菌菌数控制在10~100cfu/ml 4.2.4取胰酪大豆胨液体培养基两份，分别加入10ml供试液及1ml10~100cfu/ml沙门菌菌悬液，混匀，30~35℃培养18~24小时。取上述各培养物0.2ml，接种至木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板上。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色透明或半透明，中心有或无黑色。未接种的木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板作为空白对照。用接种针挑选疑似菌落于三铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~24小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。 5．结果判定若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面为黄色、底层为黄色或黑色，应进一步进行适宜鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色，底层未见黄色或黑色，判定供试品未检出沙门菌。 6．结论和建议此项中将根据实际测试的结果给出运行确认的结论，有异议的将给出建议。 7．再验证如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。 8．附件 8.1附件1 培养基灵敏度检查记录 8.2附件2 稀释液无菌检查记录 8.3附件3 微生物方法学验证记录 8.4附件4 培养基厂家报告

2015年版中国药典微生物限度检查方法验证的方案.doc

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审

1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表

版药典微生物限度检查方法验证方案

版药典微生物限度检查方法验证方案 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法试验菌株需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审

1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，