2019版国科大生物信息学期末考试复习题

中科院生物信息学期末考试复习题

陈润生老师部分：

1.什么是生物信息学，如何理解其含义？为什么在大规模测序研究中，生物信息学至关重要？

答：生物信息学有三个方面的含义：

1)生物信息学是一个学科领域，包含着基因组信息的获取、处理、存储、分配、分析和

解释的所有方面，是基因组研究不可分割的部分。

2)生物信息学是把基因组DNA序列信息分析作为源头，破译隐藏在DNA序列中的遗传语

言，特别是非编码区的实质；同时在发现了新基因信息之后进行蛋白质空间结构模拟和预测；其本质是识别基因信号。

3)生物信息学的研究目标是揭示“基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律”。它

是当今自然科学和技术科学领域中“基因组、“信息结构”和“复杂性”这三个重大科学问题的有机结合。

2.如何利用数据库信息发现新基因，其算法本质是什么？

答：利用数据库资源发现新基因，根据数据源不同，可分2种不同的查找方式：

1)从大规模基因组测序得到的数据出发，经过基因识别发现新基因：

（利用统计，神经网络，分维，复杂度，密码学，HMM，多序列比对等方法识别特殊序列，预测新ORF。但因为基因组中编码区少，所以关键是“数据识别”问题。）利用大规模拼接好的基因组，使用不同数据方法，进行标识查找，并将找到的可能的新基因同数据库中已有的基因对比，从而确定是否为新基因。可分为：①基于信号，如剪切位点、序列中的启动子与终止子等。②基于组分，即基因家族、特殊序列间比较，Complexity analysis，Neural Network

2)利用EST数据库发现新基因和新SNPs：

（归属于同一基因的EST片断一定有overlapping，通过alignment可组装成一完整的基因，但EST片断太小，不存在数据来源，主要是拼接问题）

数据来源于大量的序列小片段，EST较短，故关键在正确拼接。方法有基因组序列比对、拼接、组装法等。经常采用SiClone策略。其主要步骤有：构建数据库；将序列纯化格式标准化；从种子库中取序列和大库序列比对；延长种子序列，至不能再延长；放入contig库①构建若干数据库：总的纯化的EST数据库，种子数据库，载体数据库，杂质、引物数据库，蛋白数据库，cDNA数据库；

②用所用种子数据库和杂质、引物数据库及载体数据库比对，去除杂质；

③用种子和纯化的EST数据库比对

④用经过一次比对得到的长的片段和蛋白数据库、cDNA数据库比较，判断是否为已有序列，再利用该大片段与纯化的EST数据库比对，重复以上步骤，直到序列不能再延伸；

⑤判断是否为全长cDNA序列。

（利用EST数据库：原理：当测序获得一条EST序列时，它来自哪一个基因的哪个区域是未知的（随机的），所以属于同一个基因的不同EST序列之间常有交叠的区域。根据这种“交叠”现象，就能找出属于同一个基因的所有EST序列，进而将它们拼接成和完整基因相对应的全长cDNA序列。而到目前为止，公共EST数据库(dbEST)中已经收集到约800万条的人的EST序列。估计这些序列已覆盖了人类全部基因的95%以上，平均起来每个基因有10倍以上的覆盖率。）

3.用蛋白或核酸序列数据库研究生物演化的主要步骤是什么？当前的困难是什么，如何克服？

答：计算步骤，构建系统进化树，其主要步骤如下：

(1.序列相似性比较: 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么，完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的序列包有BBLAST、FASTA等；

(2.序列同源性分析：将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其他序列间的同源性大小，这是理论分析方法中最关键的一步，完成这一工作必须使用多序列比较算法，常用的程序包有CLUSTAL等；

(3.构建系统进化树：根据序列同源性分析的结果，重建反应物种间进化关系的进化树，为完成这一工作，已发展了多种软件包，如PYLIP、MEGA等

(4.稳定性检验：为了检验构建好的进化树的可靠性，需要进行统计可靠性检验，通常构建过程要随机地进行成百上千次，只有以大概率（70%以上）出现的分支点才是可靠的。通用的方法使用Bootstrap算法，相应的软件已包括在构建系统进化树所用的软件包当中。

当前的主要困难：是发现了基因的横向迁移（LGT）现象，即进化程度不同的物种间存在着遗传信息基因的传递，如果拿迁移的基因做进化分析就会出错。

克服LGT的方法（可能的解决途径）：

1)纵向思路：选择垂直进化而来的序列进行研究，即去除横向迁移的数据库，如COG

数据库；

2)横向思路：发展基于完整基因组构建进化树，即使用全基因组数据库进行基因组

水平上的对比；

4.什么是SNP？为什么SNP的研究是重要的？SNP研究有哪些优点？举出2~3个SNP相关的网站。

答：SNP是指单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性，代表了基因组水平上遗传密码的变异，由于这种变异很多以单碱基突变的形式出现，因此称为单核苷酸多态性；它反映了不同个体间、正常与异常个体之间基因组上的差别，现在这个概念有所扩大，不限于一个核苷酸的差异。

重要性：因为SNP研究是基因组领域理论成果走向应用的关键步骤，是联系基因型和表现型之间关系的桥梁，是研究人类基因组计划走向应用的重要步骤。

优点：

（1）SNP在基因组中分布相当广泛，使人们有机会发现与各种疾病相关的基因组突变；（2）不直接导致疾病基因表达的SNP，与某些疾病基因相邻，成为重要标记，有助于发现疾病基因

（3）从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变，比通过家系发现更加容易。（4）基础研究中非常重要，如对Y染色体SNP分析有重要成果。

SNP相关的一些网站：

1)SNP Consortium's database(https://www.360docs.net/doc/1a11194269.html,/index.html)

2)NCBI SNP database将这些数据进行整理，去掉冗余，使每个SNP都是唯一的。此时的

SNP被称为reference SNP或refSNP。（(https://www.360docs.net/doc/1a11194269.html,/SNP/overview.html) 3)The Human Genic Bi-Allelic Sequences Database(HGBASE) 这一数据库收录了人基因组中

所有已知的序列变化，包括：SNPs、序列的插入和缺失(Indels)、简单重复序列等。

（http://hgbase.cgr.ki.se/）

4)The Human Gene Mutation Database（HGMD）(https://www.360docs.net/doc/1a11194269.html,/)

5. 什么是系统生物学？系统生物学对生命科学概念上的发展？系统生物学对生物功能实现的理解有何本质变化？系统生物学的研究思路是什么？

答：系统生物学是指在系统的层面上研究生命活动，包含三个相互衔接的组成：

整合数据，即整合所有各个层次（DNA水平，RNA水平，蛋白质水平，蛋白质相互作用水平）的信息数据；

系统建模，即用这些信息构建描绘生命活动的数学模型；

预测未知，即用这个模型预测生命未来的发展及外界干扰后系统的变异。

学术概念上的发展主要有：传统生物学是从基因组序列到结构，再到功能，而它从各个层次的相互作用到网络，再到功能。与以往不同的是，系统生物学一开始就考虑元件之间的相互作用，把整个生命活动作为网络，考虑其相互作用。

看待生命活动本质的变化：因为没有一个生命活动是靠一个基因完成的，生命活动是一组基因相互作用实现的，这种相互作用形成一个网络，既包括每个单元的结构，又包括单元与单元之间的相互作用。因此，系统生物学不仅考虑每个基因的活动，还描述了基因间的相互作用并导致了网络的产生。

研究思路的变化：传统的分子生物学研究步骤一般为：DNA序列→蛋白结构→蛋白功能（一维），而系统生物学是在二维的角度研究生命科学，即：相互作用→网络→功能，是由一组基因产生并相互作用共同实现的。

系统生物学的研究思路（研究流程）：

1.针对选定生物系统进行实验设计，了解系统所有组成成分：基因，RNA，蛋白,膜脂等

2.通过系统行为动力学分析，总结系统设计和控制规律

3.通过总结规律来提出新的实验设计，验证系统模拟的正确性

6.（1）什么是非编码序列，非编码RNA，非编码基因？

（2）以人的基因组为例回答：在基因组中有多少非编码序列，有多少存在转录本，举2~3个非编码核酸的生物学功能？

答：（1）非编码序列是基因组中不编码蛋白质和多肽的序列；(基因组中不归属于基因调控元件，稳定元件之外的，也无明确生物学功能意义的基因序列统称为非编码序列，即不编码蛋白质同时也无明确生物学功能的序列)

非编码RNA是指来自基因组的非编码的转录元件，即基因组中非编码序列的转录本；

非编码基因指那些具有明确生物学功能的非编码RNA在基因组上非编码序列上的位置，即功能性的非编码RNA对应基因组上的位置称为非编码基因；

（2）人类基因组中97～98%的序列是非编码序列，有70%～80%存在转录本，非编码核酸的生物学功能：

1)Xist:X-inactivation（X染色体失活）是哺乳动物的一种剂量补偿机制，其中一半拷贝转

录被抑制从而失活，抑制转录是通过一个2kb的非编码RNA（Xist RNA）实现的,xist RNA装配在失活X染色体的外侧，引起结构改变导致失活；

2)Small RNA and RNAi: RNAi是由RNA（siRNA、microRNA）导致的转录后基因沉默现

象，如由双链小RNA引起的干扰和转录后基因沉默现象，在植物病毒抗性和线虫中的转座子沉默；一些小核RNA调控基因转录。(单链易降解，但发现细胞中存在另一种pathway，双链小RNA进入细胞后结合组蛋白形成复合体，该复合体和识别并降解target) 3)piRNA（具有大量转录本，功能不详）和Prions（生物复杂度到一定程度后会出现发病

情况，可能和非编码RNA有关）等。

7.精准医学的重大意义是什么？实现精准医学的重要基础是什么？

精准医学的重大意义；精准医学有可能导致医疗体系本质上的转变，把目前的医疗体系由诊断治疗过渡到健康保障，使得健康体系的关口前移，有可能产生新兴产业。健康人可以通过组学等一系列研究，对现在的健康作以评估。在健康检查的基础上，对未来可能导致疾病的部分进行干预，使得能够延缓疾病的发生，或者排除某些疾病的发生，使得健康得以保障。实现精准医学的重要基础：

1.必须获取分子水平上的数据信息，并挖掘其内涵，在挖掘组学数据时，一定要使用大数据分析技术，因此是大数据与组学的交汇。组学包括基因组，转录组，蛋白质组，代谢组；大数据包括人群和队列

2.建立分子水平上的知识与宏观疾病表型的联系，即基因型和表型的关联，搭建分子水平信息和疾病间的桥梁，在搭建桥梁时，生物信息学，生物网络，系统生物学的知识是其核心知识。

3.在此基础上，融合临床检验，影像学等指标，使得医学做得更加精准。

【定义：精准医学是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。

本质上：是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标志物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确亚分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。

精准医学是因人因病而异的、更加精确的个体化医疗，其进步之处是将人们对疾病机制的认识与生物大数据和信息科学相交叉，精确进行疾病分类及诊断，为疾病患者提供更具针对性和有效性的防疗措施，最终目的是更好地为患者服务。

与个体化医疗相比，精准医疗更重视“病”的深度特征和“药”的高度精准性；是在对人、病、药深度认识基础上，形成的高水平医疗技术。精准医学实现了从诊断治疗到健康保障这一本质性转变。

精准医学包括精准诊断和精准治疗，而“迈向精准医学”需要构造的生物医学知识网络是建立在系统生物学的基础之上。

实施精准医学计划的战略意义总共有4点：提高疾病诊治水平，惠及民生与国民健康;推动医学科技前沿发展，增强国际竞争力;发展医药生物技术，促进医疗体制改革;形成经济新增长点，带动大健康产业发展。】

【有可能将基因组变异作为疾病诊断，精准医学导致医疗体系本质的转变，把目前阶段治疗过渡到健康保障，使健康体系关口前移，在健康筛查基础上，排除疾病发生。就是评估----检查----干预的过程。

基础：1获取分子水平上数据信息，挖掘信息内容，发展大数据新算法，理论技术如组学的信息。2 建立分子水平知识宏观疾病表型关联，搭建分子水平信息与疾病的桥梁。

问题：样本量少，有效治疗事件频率低，疾病相关复杂网络构建分析的困难。】

陈小伟老师部分：

1.芯片间标准化的方法：

排序：每列由小到大排序，而可以得到

每一组基因表达量的真实值

求排的平均值作为标准值

重排：按颜色重排

基本方法：芯片间标准化的目的是基于Gene1~Gene5五个基因表达量理论的和应该保持恒定，即S1~S3三列每一列的和是相等的。但实际测定过程中不可能完全相等，因此将这种不等归结于每一组芯片自身的差异而进行芯片间标准化，基本步骤为通过排序取平均重新排序的方法消除芯片间误差，从而可以得到每一组基因表达量的真实值。（老师给的这组芯片基因完全相同的情况下S3一列数据明显偏高，通过这种标准化实现了芯片间差异的消除）。

【Quantile归一化过程：

首先假设不同芯片整体分布一致，归一化后芯片的分布一样。

下图四个部分代表四步，行代表基因，列代表样本，图一对每个列的表达值排序，图二计算每行的平均值，图三用每行计算的平均值代替该行的原值，图四将排序后的行恢复到未排序前的位置。】

2.FDR控制假阳性的方法——Benjamini–Hochberg procedure

基本方法：对于m个独立的样本，其p-value记为p i，i=1,2,3…m；

（1）对所有的p-value进行从小到大排序p(1)≤p(2) ≤p(m)；

（2）对于一个给定的α（此时的α即为统计里的显著水平，范围0~1，通常取0.05），找到最大的k值，满足错误!未找到引用源。；

（3）拒绝从p(1)~p(k)的无效假设H0（即表示p(1)~p(k)表达量存在显著差异）。

计算方法1（α=0.05）：

P(4)=0.03<0.05*4/6=0.033；P(5)=0.045>0.05*5/6=0.041；

k=4. 即G2, G6, G5, G4差异表达，FDR<0.05

计算方法2（q-value法）：

根据错误!未找到引用源。可以推出错误!未找到引用源。因此直接计算并与α进行对比即可：

由于G3的q-value大于0.05，因此G2, G6, G5, G4差异表达。

【FDR过程，如何控制FDR：

首先，FDR过程是为了控制假阳性率的过程。假阳性指样本本质为假但判定为真。比如在找到一组差异表达的基因之后，我们要考虑这个差异是否够显著，即假阳性率是否足够低。

BH 过程是FDR 矫正的一种，首先对检验得到的P 值进行排序，然后从1开始增加找K 的值，使K 满足，其中m 为个数，a 一般取0.05或0.1。所有满足P 值的基因认为表达有显著差异且假阳性不超过a 。】

3. 转录本表达量的表示方法（RPKM ：Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads ）：

（1）RPKM 的作用：

RNA-seq 是透过次世代定序的技术来侦测基因表现量的方法，在衡量基因表现量时，若是单纯以map 到的read 数来计算基因的表现量，在统计上是一件相当不合理的事，因为在随机抽样的情况下，序列较长的基因被抽到的机率本来就会比序列短的基因较高，如此一来，序列长的基因永远会被认为表现量较高，而错估基因真正的表现量，所以Ali Mortazavi 等人在2008年提出以RPKM 在估计基因的表现量

假设一个物种的基因组上只有两个基因，基因G1的外显子长8 Kb ，基因G2的外显子长2 Kb 。对该物种的一个样本做RNA-seq ，共得到23 millions 的read ，其中能够比对到G1的read 有16 million 个，能够比对到G2的有4 million 个.计算G1和G2的RPKM 。 Total mapped reads=16 million+4 million=20 million

G1: total exon reads=16,000,000 exon length=8kb

RPKM=16,000,000/(20*8)=100,000

G2: total exon reads=4,000,000 exon length=2kb

RPKM=4,000,000/(20*2)=100,000

（2）FPKM 与RPKM 的区别：

两者基本相同。RPKM 代表Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads ，FPKM 代表Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads 。在RNA-Seq 中，由于cDNA 来源于RNA 的逆转录，转录物的表达量与cDNA 片段成比例。RNA-Seq 配对末端实验每个片段产生两个reads ，但这并不意味着两个reads 都可在图上标注。例如，第二个read 低品质。如果我们对read

计数而不是片段，我们可能对某些片段重复计数，而对另一些只计一total exon reads RPKM total mapped reads (millions) * exon length (KB)

=

次，导致对表达量估计的偏差。因此FPKM以片段为单位计数，而不是reads数。（来源于网上，原网址：https://www.360docs.net/doc/1a11194269.html,/faq.html#fpkm）

预测：

1.高通量测序数据分析总括：

高通量测序数据库程序读出的reads数据及对应的质量分值以文件格式为fastq的格式保存。

①测序的原始数据为荧光信号，首先将荧光信号转换为序列信息，即读段数据及对应的质量分值；

②为了方便测序数据的发布和共享，一般需要对数据进行格式化转换，最常用的数据格式为fastq格式；

③对得到的原始数据必须对其质量进行评估，评估指标包括G、C含量，碱基质量，插入分布等。方便过滤掉质量较差的读段；

④若数据质量评估过关，接着将原始读长通过序列映射定位到基因组上；若无参考基因组，则必须使用denovo的组装方法；

⑤得到测序数据的组装图后，便可根据实验目的对组装好的数据进行相关分析，如分析基因的剪接位点，SNP位点，变异位点还可以分析基因的差异化表达（RNA-Seq），转录因子结合位点（Chip-Seq），甲基化模式（MeDIP-Seq），同时还可利用此数据发现新的编码基因和非编码基因；

⑥使用可视化组件对分析结果进行可视化处理。

2.表达谱数据分析流程

Intensity→Expression profile→Quality control→Normalization→Differential gene expression analysis

①基因芯片在一个颜色通道扫描后得到的原式图是色调单一，强度不同的亮点陈列图；

②将原始的图像数据转换为基因表达矩阵；

③对得到的基因表达矩阵的数据质量进行检测，对得到的数据进行统计学分析，从而估计和校正试验误差，筛选出有效数据。

④标准化就是消除基因芯片实验过程中系统变异对基因表达水平所带来的影响。标准化包括芯片内的标准化和芯片之间的数据标准化。芯片内的标准化方法，如局部加权线性回归标准化，参照点标准化，芯片之间的标准化方法如Quantile；

⑤前几部都是对表达谱数据的预处理，后期的数据分析包括差异基因表达分析、聚类分析、判别分析等；

a)差别基因表达分析可分析不同样本中起关键作用的基因，为后续研究提供方向；

b)聚类分析是基因表达谱最广泛使用的统计技术，聚类分析的目的再与寻找可能标准化或关联的基因，从而预测位置基因的功能信息或已知基因的未知功能；

c)判别分析能够依据样本的某些特性，判别样本的所属类型，利用已有数据建立分类器，然后利用建立的分类器对未知样本的功能或状态进行预测。方法主要有SVM，贝叶斯分类和神经网络法等。

3.无生物学重复和有生物学重复时如何进行差异表达分析？

答：（1）无生物学重复：

方法：FC（Fold change倍数变化）

①描述数据初值与终值之间的差异（一般是两个差别表达基因间或处理与对照之间），用标准化后的两组数据相除得到的比例，一般2-fold表明两组数据是有显著差异的；

②这种计算方法可以得到一组相对值，而不是绝对值变化，消除了系统误差以便于统计学分析；

③一般得到的FC值与设定的阈值进行比较即可得到表达有差异的基因；

（2）有生物学重复：

方法：假设检验

a)具体步骤：①提出实际问题；②提出无效假设（H0）与备择假设（H1）；③选择显著性水平（一般α=0.05）；④选择统计模型与相应的统计量；⑤根据实验结果计算实验统计量；⑥判断检验统计量的p-值(表示事件发生的概率具有偶然性)；⑦将p值同选定的显著性水平比较；⑧拒绝或不拒绝H0；⑨回答①所提出的实际问题。

b)假设检验根据数据类型（是否符合正态性）分为参数检验与非参数检验：

①参数检验：符合正态分布可使用，常用的方法主要有t检验法，配对t检验法、最小二乘法

②非参数检验：不符合正态分布可使用，常用的方法有Wilcoxon秩和检验法，其基本方法是根据表达量排序并按照排列顺序检验，检验结果较参数检验法更粗犷。

4.全基因组测序的步骤？

答：（1）第一期：基因组调研图

整体测序深度不低于20倍覆盖度。进行初步的数据分析，对基因组大小，GC含量等做出初步评估，确定框架图梯度文库构建具体策略；

（2）第二期：基因组框架图

基因组覆盖度达到90% 以上，基因区覆盖度达到95% 以上，单碱基的错误率达到1万分之一以内，整体测序覆盖深度不低于60倍覆盖度。同时对框架图进行基本基因注释和功能注释，和简单的比较基因组学分析。

（3）第三期：基因组精细图

基因组覆盖度达到95% 以上，基因区覆盖度达到98% 以上，单碱基的错误率达到10万分之一以内，整体基因组覆盖度不低于100倍，Scaffold N50大小不低于300Kb，对基因组精细图进行详细基因注释，基因功能注释，基因代谢途径注释和比较基因组学分析。

5.转录本测序，各数据分析工具的特点？

转录本测序可分为Small RNA-seq和RNA-seq：

①Small RNA-seq主要用于检测small RNA（主要是miRNA）的表达水平，发现新的small RNA

②RNA-seq：Poly(A)用以检测蛋白质编码基因的可变剪切体及表达水平；Total RNA（除rRNA）用于检测mRNA及long noncoding RNA的表达水平并发现新的long noncoding RNA；数据分析工具主要有：Bowtie，TopHat，Cufflinks，具体作用如下：

a)Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。Bowtie并不是一个简单的拼接工

具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。

b)TopHat 是一个快速的将RNA-Seq 数据进行快速剪接映射的程序。它使用超快的高通量短读比对程序，将RNA-Seq的信息比对到哺乳动物大小基因组上，然后分析映射结果来鉴别外显子之间的剪接点。

c)Cufflinks 利用Tophat比对的结果（alignments）来组装转录本，估计这些转录本的丰度，并且检测样本间的差异表达及可变剪接调控。它通过接受线性的RNA-Seq reads并将线性片段组装为一套最大简约的（parsimonious）转录本。然后根据reads数估计估计相关转录本的丰度并将实验室预设的偏差考虑在内。

6.转录本拼接

最大简约转录本的组装方法：组装一套转录本←→在链中找到最小的分割单元P←→找到最大的反义链←→在二分图中找到最大匹配数←→找到最小点覆盖

二分图：指顶点可以分成两个不相交的集使得在同一个集内的顶点不相邻（没有共同边）的图。设G=(V,E)是一个无向图，如果顶点V可分割为两个互不相交的子集(U,V)，并且图中的每条边（i，j）所关联的两个顶点i和j分别属于这两个不同的顶点集(i in U,j in V)，则称图G为一个二分图。

最大匹配：给定一个二分图G，在G的一个子图M中，M的边集中的任意两条边都不依附于同一个顶点，则称M是一个匹配，选择这样的边数最大的子集称为图的最大匹配。

最小点覆盖：给定一个二分图G，在G的一个子图N中，N的点集中的点与所有的边都有关联（把所有的边都覆盖），则称N是一个点覆盖，选择这样的点数最小的子集称为图的最小点覆盖。

7.Illumina测序原理

①在聚合反应体系中加入修饰过的四种核苷酸，它们分别被标记上终止基团和荧光基团：3’羟基上标记上叠氮基——在延伸时起阻止聚合的作用，胞嘧啶上标记上荧光基团。每一种核苷酸标记的荧光分子是不一样的。

②聚合终止，每次加入一个修饰核苷酸，链聚合就被终止了，如下图

③用激发光照射，被修饰的碱基发出荧光，记录荧光信号，则知这一步加入的是什么核苷酸。

④延伸回复：加入二巯基丙醇去掉叠氮基；用TCEP(Tris (2-carboxyethyl) phosphine,三(2-羧乙基)膦)处理，去掉荧光基团。

⑤进入下一轮延伸，加入一个新的碱基。

原理的关键之处在于如何形成足够强的荧光信号。无疑这需要大量的模板。怎样来获得大量模板呢？同时二代测序技术还要实现高通量测序，即同时对大量序列测序。如何将混合样品中序列彼此分开呢？illumina桥式PCR技术可解决以上两个问题

（1）样品准备

①序列片段化：将混合样品中的核酸序列打断至400bp左右

②短序列收集，并将末端补平。在5’端加一个Pi基团；3’端加一个“A”

③在两端分别加上不同的接头序列

（2）桥式PCR

①将样品平铺到预制的含与接头序列互补的平板上（flow cell），平板结构如下：

Flow cell 表面是寡聚引物加上接头的序列与平板上寡聚引物互补配对②加上接头的序列与平板上寡聚引物互补配对，然后进行酶聚合反应

④变性使原始模板链分离并洗净

模板链脱离单链弯曲杂交在相邻的引物上

⑤单链弯曲杂交在相邻的引物（与另一端结合的引物）上。

⑥酶聚合形成双链桥式结构；之后桥式结构打开形成的两个copy又在其各自周

围形成新的copy。

酶聚合形成双链桥式结构每个簇都有约10000个拷贝，且每个簇都代表一个独特序列⑦桥式双链分开，反向链（底3’-5’上）被切掉后洗脱（通过切反向链引物）；

正向链3’端被封闭，防止不必要的DNA延伸。

⑧加入测序引物测序，如图右。

8.高通量测序数据的分析流程

高通量测序数据以程序读出的reads数据及对应的质量分值的格式保存，其文件格式为fastaq格式

①高通量测序最原始的数据为荧光信号，首先将荧光信号转化为序列信息，即reads数据及对应的质量分值。

②为了便于测序数据的发布以及共享，一般需要对数据进行格式转换，最常用的数据格式是fastaq。

③对于得到的数据必须对其质量进行评估，评估指标包括GC含量，碱基质量，插入缺失错误，以便过滤掉质量差的reads。

④若数据质量评估过关，接着将原始reads map 到基因组上。若无参考基因组，则需用de novo 组装方法。

⑤得到测序数据的组装图后，便可以根据实验目的，对组装好的数据进行相关的分析。如分析基因的剪接位点，SNP位点，变异位点，还可以分析基因的差异化表达(DNA,RNA），转录因子结合位点（Chip-seq），甲基化模式（MeDIP-seq），同时还可利用此数据发现新的编码基因和非编码基因。

⑥使用可视化软件对分析结果进行可视化处理。

王秀杰老师部分：

想知道转录因子的结合位点用什么方法？

转录调控是基因表达的关键步骤：转录调控因子（transcription factors，TFs）有序地结合在目标基因启动子序列中的特殊位点，启动基因的转录和控制基因的转录效率。这些位点被称为转录因子结合位点（transcription factor binding sites，TFBSs），又被称为顺式调控元件（cis-regulatory elements），其长度从几个到十几个碱基对不等。每个转录因子的结合位点通常都有特定的模式，被称为模体（motif）。找到这些特定的序列片段对研究基因的转录调控有着重要意义。

一、什么是genome assembly 里的N50、L50？

Contig, scaffold 的定义为：

（contig/scaffold是按照长度降序排列的）

N50:contig/scaffold的降序序列中的一个正好使其累计长度大于50%的一个片段的长度

L50: N50对应片段的在contig/scaffold降序序列中的序号

Statistics of genome assembly :

二、评价算法软件准确度

TP TN FP FM的含义：

Sensitivity Specificity的含义：

三、预测RNA二级结构中的最低自由能计算模型-Nearest Neighbor Model

四、基因相关的名词解释基因型、表型：

性状：

基因座、等位基因、突变、多态性：

纯合子、杂合子、半合子：

群体、群体遗传学、基因库、基因流动