反硝化培养_-_翻译
附录C.通过细菌反硝化法进行硝酸盐氮同位素分析的准备程序
培养板的制作
1. 准备培养板
a. 混合到一起：
i. 23 g胰蛋白大豆琼脂培养基(TSA)
ii. 0.5 g KNO3
iii. 500 mL E-pure or Milli-Q water
b. 高压灭菌30分钟。
c.冷却大概15分钟（直到戴手套时可以把住烧瓶）。
d. 倒入无菌塑料培养皿中，每做3～4块板以后，烧一下烧瓶的边缘（500mL可以制作大
约20块板）。
e. 让培养板过夜凝固。
f.用标签给袋子做上标记；包括培养板的种类（TSA，加NO3–），今天的日期以及培养
板最初的制作人。
g.把培养板保存在冰箱中待用。
2.划线培养细菌：
a. 在–80 °C的冰箱中，有一个盒子包含有P. aureofaciens冰冻储存物的美国型培养菌种集
（ATCC）13985。
b.从库存中取出细菌：不要等到小瓶融化—用一个牙签从管子中挖一些细菌。在做其他事情
之前，密封管子。冰冻存储物是我们最重要的资源。
c.用牙签轻轻地接触一个培养板的表面以转移细菌浆。它应该形成一个小胶团。
d. 用一个烧过的环，通过来回的经过胶团划线将胶团平铺开。烧环。继续划线，沿着第一
次的划线轨迹穿过路径两次。烧环。沿着第二次的划线穿过路径两次并且继续。这块培养板的序号定为#1。
e.从先前的培养板中划线培养新板：用来自于#1板的单一菌落，划线，烧，划线，烧，划线
（同上冰冻存储物的操作）。这块板的序号定为#2。
f. 培养板标记：
i. 菌株(P. aureofaciens)
ii. 板号
iii. 今天的日期
iv. 括号中的信息来源(“冰箱” 或者先前培养板的制作日期)
g.培养板需2～3天的时间长成，所以一个培养板一周会典型地经历一个回合。
h. 将板宗族放在一起以便于管理。当#2板长成并准备用来接种时，丢掉旧的板宗族。如果
划线培养#3板，那么在同一天也要划线培养新的#1板。
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB的准备）
1.清洗（新的不需要清洗）580ml的特制培养基瓶子（580ml的瓶子附带一个23 × 75.5 mm，
20 mL 的顶部瓶颈）用作血清瓶：
a.用Liqui-Nox清洗剂刷洗内部。
b. 用温水以及去离子水清洗。
C. 在烤炉中，200° C 下过夜烘干。
2.培养基的制作：（配制7000mL培养基分装到14个580ml的瓶子中）：
a.混合到一起:
i. 210 g胰蛋白胨大豆肉汤琼脂(TSB)
ii. 7.0 g KNO3
iii. 3.5 g (NH4)2SO4
iv. 34.3 g磷酸钾
b. 加7000 mL去离子水。
c. 将500ml均质化良好的混合培养基通过蠕动泵分装到一个580mL的瓶子中。
d.用蓝色橡胶塞子和aluminum crimp-seals封住瓶子。
e. 高压灭菌60 min,当灭菌锅温度达到120 °C时计时开始。
3. 配制无NO3–培养基: (配制2000 mL 培养基并分装到20个100ml的血清瓶中):
a.混合到一起:
i. 30 g TSB
ii. 0.5 g (NH4)2SO4
iii. 4.9 g KH2PO4
b.加2000 mL 去离子水.
c. 将100 mL均质化良好的无NO3–培养基用蠕动泵分装到160-mL的血清瓶中。
d. 高压灭菌60 min,当灭菌锅温度达到120 °C时计时开始。
4. 培养细菌:
a.取5ml经高压灭菌的培养基放入无菌塑料试管中。
b. 用一个烧好的环从#2或是#3板中（除非紧急情况，不要从#1号板上接种）选一个
菌落。
c. 打开试管，使环的底部接触到试管内部或者在培养基中敲打环的底部以转移菌落。
无论你做什么，都要迅速。进出瓶子越快越好。
d.标记试管:
i. 菌株
ii. 今天的日期
iii. 接种体的来源(板号和日期)
e. 把试管放在摇床上过夜培养，仅一天比较好。
f. 每个580-mL的培养瓶中加入5ml初始溶液，并且在培养记录中登记每个培养瓶，
每个瓶子占一行。
g.把瓶子放到摇床上，培养细菌一周。
5. 总地的来说，一星期可以接种四次（从周二到周五），每天2～4个瓶子，这些培养物要
生长一周的时间才能收获，所以你下周需要的话，今天就开始接种。
测试细菌对NO3–的非完全转化
1. 从每个将要收获的580ml培养物中取出1 mL。
2. 加入40 μL 磺胺.
3.加入40 μL N-(1-haphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NED).
4.如果变为粉红色，说明细菌没有把NO3–完全转化为N2O，而是停止在NO2–的状态。
不要再用那个瓶子。如果转化好的话，是没有NO2–的并且5天以后培养物很稠。
收获细菌—通过离心浓缩培养物
1. 在200-mL离心瓶中倒入200 mL 培养物。
2.把离心瓶放入离心机中，确保它们相互平横。
3.离心15 min,18 °C ，73,800 rpm. (细菌应该在瓶底成丸状)。
4. 弃掉上层清液，注意不要搅乱细菌球体。
5. 从一个100-mL，无NO3–的培养基中分别取出10ml加到每个瓶中。
6. 充分震荡以重新悬挂细菌。
7. 把重新悬挂的细菌转移到一个200-mL的烧杯中。
8. 用剩余的无NO3–培养基清洗所有的四个离心瓶。
9.把它们都合到一个200-mL 的烧杯中。
10. 加10滴止泡剂B。
在样品瓶中加入浓缩细胞培养物，纯化上层空间并加入样品
1.在样品瓶中加入3 mL 浓缩细胞培养物。
2. 用聚四氟乙烯衬里的硅胶隔膜和aluminum crimps封住瓶子。
3. 在瓶子里插入一个氦孔针（1.5－英寸. 长，25计）。
4.将每个样品瓶上下颠倒插入纯化架上。
5.用3～4 psi氦气纯化样品瓶1小时。
6. 用一个带有25－计针头的密闭注射器注入适量样水以产生5～20 nmol N2O (1 to 10 mL)，如果所需水量超过4ml，插入一个排气针以避免过压。倒转样品瓶数次以使其充分混合。
7. 上下颠倒样品瓶，培养2小时。
8. 现在样品准备引入GasBench做同位素分析。