生化考试复习题汇总及答案整理
核酸化学及研究方法
一、名词解释
1.正向遗传学：通过研究突变表型确定突变基因的经典遗传学方法。
2.核小体组蛋白修饰：组成核小体组蛋白，其多肽链的N末端游离于核小体之外，常被化学基团修饰，修饰类型包括：乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化，修饰之后会改变染色质的结构和活性。
3.位点特异性重组：位点特异性重组是遗传重组的一类。这类重组依赖于小范围同源序列的联会，重组只发生在同源短序列的范围之内，需要位点特异性的蛋白质分子参与催化。
4.转座机制：转座酶上两个不同亚基结合在转座子的特定序列上，两个亚基靠在一起形成有活性的二聚体，切下转座子，转座酶-转座子复合物结合到靶DNA上，通过转座酶的催化将转座子整合到新位点上。
5.基因敲除：利用DNA同源重组原理，用设计的外源同源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的靶基因发生重组，从而将外源DNA整合到受体细胞的基因组中，产生精确的基因突变，完成基因敲除。
6.Sanger双脱氧终止法：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在的条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，若双脱氧碱基掺入链端，该链便停止延长，若单脱氧碱基掺入链端，该链便可继续延伸。如此每管反应体系中便合成了以共同引物为5’端，以双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳，以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个碱基），根据片段3’的双脱氧碱基，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
7.荧光实时PCR技术原理
探针法：TaqMan探针是一小段可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA，它的5’和3’端分别带有一个荧光基团，这两个荧光基团由于距离过近，相互发生淬灭，不产生绿色荧光。PCR反应开始后，靶DNA变性，产生单链DNA，TaqMan探针结合到与之配对的靶DNA序列上，之后被Taq DNA聚合酶切除降解，从而解除荧光淬灭，荧光基团在激发光下发出荧光，最后可根据荧光强度计算靶DNA的数量。染料法：荧光染料（如SYBR GreenⅠ）能与双链DNA发生非序列特异性结合，并激发出绿色荧光。PCR反应开始后，随着DNA的不断延伸，结合到DNA上的荧光染料也相应增加，被激发产生的荧光也相应增加，可根据荧光强度计算初始模板的数量。
8.双分子荧光互补(BiFC)技术原理
将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N片段和C片段。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个目标蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。
简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若目标蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。
二.问答题：
1.怎样将一个基因克隆到pET32a载体上；原核表达后，怎样纯化该蛋白？
2.通过哪几种方法可以获得cDNA的全长？简述其原理。
（一）已知序列信息
1.同源序列法：根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，利用简并引物进行RT-PCR扩增，得到该基因的部分cDNA序列，然后再利用RACE（cDNA末端快速扩增技术）获得cDNA全长。
2.功能克隆法：cDNA文库；基因组文库
（二）未知序列信息：
1.基于基因组DNA的克隆：是在鉴定已知基因的功能后，进而分离目标基因的一种方法。
(1)图位克隆；（2）T-DNA标签法和转座子标签法
3.什么是DNA探针、种类及标记的方法有哪些？
DNA探针：人工合成的带有放射性或生物素标记的单链 DNA 片段，它能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后可用特殊方法检测。
探针种类：
⑴基因组DNA探针：它是某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列；
⑵cDNA探针：以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链；
⑶RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA；
⑷寡核苷酸探针：人工合成的碱基数不多的与基因序列互补的DNA片段。
探针标记方法：
⑴随机引物法：寡核苷酸引物与已变性的DNA单链结合，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的Klenow片段
作用下，以同位素标记的dNTP为原料，从3'-OH端开始沿5'至3'方向延伸，合成一条与模板互补的新DNA链。
⑵切口平移法：利用微量的胰DNA酶Ⅰ使待标记的双链DNA分子产生若干切口，然后利用大肠杆菌
DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切酶活性从切口的5'端除去核苷酸;同时利用该酶5'→3'的聚合酶活性将反应体系中的核苷酸底物连接到切口的3'羟基末端。由于切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,此时若反应体系中含有标记的核苷酸，它们就会掺入到新合成的链中，获得带有标记的DNA探针。
⑶末端标记法：分为5'端标记法和3'端标记法。5'端标记法：用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或
RNA单链5'末端的磷酸基团，使其成为5'-OH，然后经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将（ATP-γ35S）γ位上的35S转移到DNA或RNA分子的5'-OH末端，使DNA片段5'端带有35S标记。3'端标记法：利用TdT 在DNA的3'末端掺入SH-GTP，因-SH不稳定，常用顺丁烯二酰亚胺进行偶联反应
4.哪些方法可以检测转录水平(mRNA水平)的表达差异？简述原理。
1.Northern印迹杂交。
原理：基因若能正常表达，细胞内会有特异mRNA的生成。将提取的mRNA用变性凝胶电泳分离，不同的mRNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上，之后将他们原位转移到固定膜上，在适宜的离子强度及温度条件下，将DNA探针与特异mRNA进行杂交，杂交带的宽度越宽和亮度越大，表明mRNA的表达水平越高。
2.荧光实时定量PCR。
原理：基因若能正常表达，细胞内会有特异mRNA的生成。将提取的mRNA逆转录成cDNA，补齐成双链DNA后，在具有荧光探针的体系中进行PCR。荧光强度越高，表明cDNA量越多，也就表明mRNA 的表达水平越高。
3.RT-PCR。
原理：将一条mRNA链逆转录成为cDNA，补齐成双链DNA后，通过PCR进行DNA扩增，将扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据条带的有无，确定某种mRNA表达与否。
4.基因芯片:
原理：将大量已知序列的核酸片段集成在同一基片上，组成密集分子排列的基因芯片，然后用mRNA 反转录出的cDNA与已知核酸片段进行杂交，根据杂交信号的强弱，检测出mRNA表达水平的高低。
5.试述绿色荧光蛋白的结构特征及其在分子生物学中的应用。
绿色荧光蛋白的结构特征：荧光蛋白具有238个氨基酸残基，其中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，三维结构由11个反向平行的β-折叠环绕成1个桶状结构，一个较长的α-螺旋从桶的中心穿过，这些β-折叠和α-螺旋之间通过Loop环连接起来。GFP的发色团位于桶中心的α-螺
旋上，由荧光蛋白通过自体催化，将3个氨基酸残基Ser65-Tyr66-Gly67进行环化。
GFP蛋白在分子生物学中的应用：
1.GFP作为报告基因用于转基因研究；
2.GFP作为报告蛋白用于基因表达调控效果的研究；
3.GFP融合蛋白用于研究蛋白质的定位、迁移和相互作用；
4.CFP用于对细胞的追踪。
6.试述RNA沉默的机理及其应用。
RNA沉默的机理：将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的dsRNA导入细胞后，dsRNA会被一种名为Dicer的酶识别，并将dsRNA加工成21nt的小片段。之后，这些小片段与RNA沉默复合体（RISC）结合，RISC除去其中一条链，留下另一条链与自己结合在一起。接着，RISC寻找与自己携带的RNA 匹配的mRNA分子，一旦发现，就会与该mRNA结合，发生特异性的降解，导致产生相应的基因沉默。RNA沉默的应用：
⑴基因消减：利用RNAi会降低或停止目标基因的表达；
⑵作物品质改良；
⑶产生抗病毒植物：植物可利用PTGS（转录后基因沉默）来抵抗病毒侵染。
7.试述CRISPR/Cas系统结构、CRISPR/Cas技术的原理及应用？
CRISPR/Cas系统结构：它包括一个前导区、多个短而高度保守的重复序列区、多个间隔区以及一系列与CRISPR相关的蛋白的基因cas。
细菌体内CRISPR/Cas作用原理：
（1）CRISPR的高度可变的间隔区的获得：外来入侵的噬菌体或质粒DNA进入细菌体内后，它们的一小段DNA序列会被整合到宿主菌的基因组中，整合的位置位于CRRSPR的两个重复序列之间的间隔区。（2）CRIPSR基因座的表达(包括转录和转录后的成熟加工)：CRISPR基因座被转录成前体pre-RNA，然后由tracrRNA(与pre-crRNA重复序列互补的序列)指导，在Cas蛋白或是核酸内切酶的作用下，
pre-RNA被剪切成一些小的RNA单元，这些小RNA即为成熟crRNA。
（3）CRISPR/Cas系统发挥活性，对外源遗传物质的干扰：成熟的crRNA与特异的Cas蛋白形成核糖核蛋白复合物，再与外源DNA结合并扫描到外源DNA，寻找其上的靶序列，crRNA的间隔序列与靶序列互补配对，外源DNA在配对的特定位置被核糖核蛋白复合物切割。
CRISPR/Cas技术用于敲除基因原理：
根据待敲除基因的上下游的DNA序列分别设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将向导RNA的基因（相当于是细菌间隔区的基因）与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，转录加工后，向导RNA（相当于crRNA）与Cas9蛋白结合，之后通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，对目标序列进行切割，从而切断待敲除基因上下游的DNA双链，实现基因敲除。
CRISPR/Cas技术的应用：
作为一种新的基因编辑技术，可以对动植物、微生物的基因进行修饰，具有多样的基因调控方式，例如敲除、插入、抑制、激活等。
8.哪几种方法可以检测蛋白质和DNA之间的相互作用，简述原理。
（1）酵母单杂交技术（yeast one-hybrid）
技术原理：GAL4是酵母自身的转录因子，该蛋白质包括两个结构域：DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD），两结构域可完全独立地发挥作用，BD区负责与顺式作用元件的结合，AD区负责激活启动子。利用这一特性，我们可以用酵母单杂交技术来检测蛋白质和DNA之间的相互作用。
第一步，在酵母体内，我们把待测DNA作为顺式作用元件构建在启动子的上游，把报告基因（一般为lacZ基因）构建在启动子的下游。
第二步，我们再构建一个融合表达载体，载体里包括编码待测蛋白的基因与编码AD结构域基因。
第三步，将融合表达载体导入酵母细胞，表达出的融合蛋白包括两个部分，一个是待测蛋白，另一个是酵母的转录激活结构域（AD）蛋白。融合蛋白中，待测蛋白相当于替换掉了GAL4中的DNA结合结构域（BD）。
第四步，进行观察。若待测蛋白能够与待测DNA结合，那么，融合蛋白上的酵母转录激活结构域（AD）就能够激活酵母的启动子，下游的报告基因就可以表达，那么，我们就能通过表型（是否是蓝色菌落）来鉴定待测蛋白和待测DNA之间是否具有相互作用。
(2)电泳迁移率变动实验（EMSA），又称凝胶阻滞实验
技术原理：
第一步：在实验中,将纯化的DNA特异结合蛋白或细胞粗提液与经32P标记的DNA探针一同温育,形成DNA-蛋白质复合物，将该复合物加到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
第二步：电泳结束后，用放射性自显影技术显现具有放射性标记的DNA条带的位置。
第三步：观察条带所在部位。若蛋白不能与DNA探针结合，那么，所有放射性标记的DNA条带都会出现在凝胶的底部；若蛋白能与DNA探针结合形成DNA-蛋白质复合物，由于DNA-蛋白质复合物相对分子质量较大，复合物受到凝胶阻滞，它的迁移速率要比游离的DNA慢得多，那么，放射性标记的DNA 条带就会出现在凝胶的不同部位。
（3）染色质免疫沉淀技术（ChIP）
技术原理：
第一步：将活细胞用甲醛交联（甲醛能够使蛋白质与DNA通过Schiff键交联,形成稳定结合的复合物），之后将细胞裂解, 采用超声物理破碎或特定酶切消化将染色体打碎为一定大小的片段；
第二步：用特异性抗体去免疫沉淀靶蛋白与DNA交联的复合物,并富集该交联复合物；
第三步：在低pH值条件下反交联,将DNA与靶蛋白之间的Schiff键水解,释放DNA片段。
第四步：对目标DNA片段的纯化与检测。由于特异性抗体已知，其所对应的抗原蛋白也就可知，从而可以获得目标DNA与蛋白质相互作用的信息。
蛋白质结构与功能及研究技术
一、名词解释
1.蛋白质的分子伴侣：可帮助新生肽链或错误折叠的多肽链正确折叠、组装、跨膜定位、转运及激活、解聚非正确折叠蛋白质的聚集体以便被蛋白酶降解的一类蛋白质。
2.（晶体生长的）气象扩散法原理：在一个封闭体系中，液池内缓冲液中的各种试剂浓度均略高于蛋白质液滴中的浓度(液池内不含蛋白质)，通过体系内蒸汽扩散，溶剂分子从液滴向液池迁移，使液滴内盐浓度增高，蛋白质溶解性降低，达到过饱和而结晶。
3. 固有无结构蛋白质：生理条件下缺乏刚性折叠结构，结构松散，肽链呈无规卷曲构象，不能行使酶等具有刚性结构蛋白质所具有的功能，但却具有明确功能的蛋白质。
4. 多肽链主链折叠的空间限制
1) 肽平面：肽键具有部分双键性质，不能旋转，使得形成肽键的四个原子（C、O、N、H）及相邻的两个α-C原子在一个平面上，为刚性平面。肽键通常呈反式构型，二面角ω=180°。
2)α-C的一对二面角（Φ，Ψ）：由于非成键原子的空间位阻，成对二面角Φ、Ψ不能任意取值，即许多成对二面角所决定的主链骨架的构象是不能存在于蛋白质构象中的。
上述两个因素使得能够存在于蛋白质中的主链构象大大减少。
5.多肽链折叠规律
1)蛋白质三级结构折叠信息来自一级结构；
2)在体外，折叠可以是自发的；
3)在给定环境条件下中，总是采取低自由能的构象状态；
4)多肽链的折叠具有手性效应；
5)折叠倾向于疏水侧链在分子内部，亲水侧链分布于分子表面。
6.二硫键异构酶：它是催化新生多肽链形成正确配对的二硫键的酶，在加速折叠中间体二硫键改组中起重要作用。
7.肽基脯氨酰异构酶：在新合成的多肽链中，脯氨酸氨基酸端形成的肽键基本都是反式的，而在球形蛋白质中大约10% X-Pro肽键是顺式的，催化肽键顺反式构象改变的酶就是肽基脯氨酰异构酶。
8.拉氏构象图
根据蛋白质中非键合原子之间的最小接触距离，根据此距离确定多肽链主链Ca的成对二面角（fy）在蛋白质构象中哪些是空间允许的、哪些是部分允许以及不允许的。并以f作横坐标，y作纵坐标作图，将允许区、部分允许区、不允许区标注在图中得到拉氏构象图。
9.蛋白质免疫印迹：利用抗原抗体的特异性反应在蛋白质混合液中定性及半定量检测某种特定蛋白质的方法。
基本步骤是：蛋白质混合液先经SDS-PAGE分离，利于电转移方法将SDS-PAGE凝胶中所分离的蛋白质转移到固相载体(如NC膜、PVDF膜），即印迹过程，再在转印膜上进行抗原抗体特异性反应，利用二抗上所带标记来鉴定、检测目的蛋白。
10. 蛋白质晶体学：利用X-射线衍射的方法研究蛋白质及蛋白质复合物晶体的三维结构，并在此基础上揭示蛋白质结构与功能关系的一门学科。
二、问答题
1. 影响蛋白质二级结构改变的因素有哪些？
1)温度，多聚赖氨酸在pH=11.8时，4℃时为α-螺旋，52℃时为β-折叠；
2)pH能改变肽链的二级结构；
3)邻近氨基酸残基的二级结构倾向；
4)肽链中远程肽段的影响；
5)肽段是处于分子表面还是被包埋在分子内部。
2.如下图所示。多聚谷氨酸poly(Glu)是由多个L-Glu聚合形成的多肽链，在pH为3的溶液中能形成α-螺旋构象，当pH升高到7时，则由α-螺旋变为无规卷曲，旋光率陡然下降。同样，多聚赖氨酸poly(Lys)在pH为10的溶液中具有α-螺旋结构，当pH降低至7时，旋光率也发生陡然下降，由α-螺旋结构变为无规卷曲。请解释pH对poly(Glu)和poly(Lys)构象变化的影响。
pH=3接近Gluγ-COOH的pK R(4.07)，侧链基团为质子化不带电荷状态，可形成α-螺旋结构。其余情况按此思路分析。Lys e-NH2pKR为10.54。
答：多聚赖氨酸在pH7.0的环境下不形成α螺旋，因为Lys是碱性氨基酸，在此pH下R基带正电荷，静电排斥，不能形成内氢键，因而构象变为无规则卷曲，而在pH=11的环境下自发形成α螺旋。
Glu侧链的pKa约为4.1,当 pH值为3时,几乎所有的多聚谷氨酸侧链为不带电荷的状态,多肽链能够形成α-螺旋.在pH 值为7时,几乎所有的侧链都带负电荷,邻近电荷之间的静电排斥力阻止螺旋的形成,因此使同聚物呈现出一种伸展的构象。
3.胶原蛋白的结构特点（原胶原分子的一级结构和高级结构）
1)在体内，胶原蛋白以胶原纤维的形式存在，胶原纤维的基本结构单位是原胶原分子；
2)每个原胶原分子由三条α-肽链组成三股螺旋结构，每条α链约含1000个氨基酸残基；
3)链间靠H-键和范得华力维系，胶原纤维可以通过分子内和分子间的进一步交联增强稳定性；
4)α链一级结构的序列96%遵守(Gly-X-Y)n，x多为脯氨酸（Pro）；y多为羟基脯氨酸（Hyp）或羟基赖氨酸（Hly）；
5)胶原蛋白是糖蛋白，少量糖与5-羟赖氨酸(Hyl)残基的碳羟基共价连接；
6)具有较好的弹性和抗张强度。
4.形成结构域的意义是什么？
1)各结构域分别折叠，其动力学上更有利；
2)结构域自身紧密装配，结构域之间的柔性连接使每个结构域间可以作较大幅度的相对运动；
3)多个结构域形成的间隙部位往往是蛋白质的功能部位，结构域的相互作用有利于蛋白质分子产生别构效应。
5.简述三种浓缩蛋白质溶液的方法及原理。
1)超滤法：将蛋白质样品装入适当的超滤管中，经一定时间离心，溶剂穿过超滤管滤膜流出而使蛋白质溶液得以浓缩；
2)硫酸铵沉淀法：通过盐析作用使蛋白质在高浓度中性盐中析出而浓缩。
3)透析袋浓缩法：将蛋白质样品装入透析袋中，封闭透析袋两端，将透析袋包埋与蔗糖、甘油或聚乙二醇8000中，放置于4°C，透析袋中溶剂将被吸出而达到浓缩的效果。
4)有机试剂沉淀法（如丙酮、聚乙二醇即PEG等）：破坏蛋白质的水化层及表面电荷而使蛋白质沉淀
5)冷冻干燥法：将待干燥物快速冻结冰后，在高真空条件下将其中的冰升华为水蒸气而去除的干燥方法。由于冰的升华带走热量使冻干整个过程保持低温冻结状态，有利于保留一些生物样品(如蛋白质)的活性。
6. 某一溶液（20mmol/LNaCl，50mmol/L Tris·HCl，pH
7.5）中含有A、B、C、D四种蛋白质，其等电点分别为A(pI
8.3)、B(pI7.0)、C(pI6.8)、和D(pI6.2)。将该溶液经阴离子交换柱层析来对蛋白质进行分离纯化，将其上样、清洗，然后再逐渐提高盐浓度进行洗脱。从理论上判断哪种蛋白质会最先从层析柱中被洗脱出来？为什么？
提示：A蛋白质最先流出。
阴离子柱结合带负电荷的分子。当溶液pH>蛋白质pI时，蛋白质所带净电荷为“负”，能够结合在层析柱上。当溶液pH 7. 分子伴侣均采用的基本循环作用模式是什么？ 分子伴侣是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能的组份。 1)结合底物（结合错误折叠的蛋白质或新生肽链）； 2)去折叠化（或防止新生肽链折叠）； 3)解聚聚集的多肽链并同时自发折叠成天然构象，若不能形成天然构象则进入蛋白酶体介导的降解途径。 8. 蛋白质一级结构的比较可以获得哪些信息？ 1)不同种属来源的同一蛋白质比较：揭示生物进化信息； 2)功能相似的蛋白质比较：功能越相近的蛋白质，结构上的同源性越高，可划分蛋白质家族； 3)功能相差较远的蛋白质一级结构比较：建立蛋白质超家族；发现蛋白质含有的新motif或结构域，并揭示可能的新功能。 9. 为什么可以采用Ni-柱亲和层析（固定化金属螯合亲和层析，Immobilized Metal-chelate Affinity Chromatography，IMAC）纯化His-tagged蛋白质？ 固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面暴露一些氨基酸残基与固定化金属离子的亲和力的不 同来进行蛋白质分离的一项技术。它以配基简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。 如何能够将His-tagged蛋白质从Ni-柱上洗脱下来？ 1)由于His-tagged蛋白质通常在N端或C端带有6′His标签，这些His能专一性地结合在螯合有Ni2+ 亲和柱上，将混合蛋白通过亲和柱，杂蛋白穿过亲和柱而与His-tagged蛋白质分离。 2)增大洗脱液中的咪唑浓度。高浓度咪唑溶液中的咪唑可与His-tagged蛋白质竞争结合Ni-柱中的Ni，从而将His-tagged蛋白质洗脱下来。 10. 蛋白质的分类方式主要有哪几种？（答出两种即可） (一)按化学组成分类 简单蛋白质：仅由氨基酸组成的蛋白质 简单蛋白质根据其溶解性又可分为7类 清蛋白球蛋白醇溶(谷)蛋白谷蛋白 精蛋白组蛋白硬蛋白 结合蛋白质：由氨基酸和非蛋白质组分，以共价结合或非共价形式结合的蛋白质 结合蛋白质根据其结合的非蛋白质组分又可分为8类 糖蛋白粘蛋白核蛋白脂蛋白 磷蛋白金属蛋白血红素蛋白黄素蛋白 (二)按分子形状和溶解性分类 球状蛋白质纤维状蛋白质膜蛋白质 (三)按功能分类 活性蛋白质非活性蛋白质 11. 丝心蛋白的主要结构特点有哪些？ 1)反平行的β折叠片以平行的方式堆积成多层片层结构； 2)一级结构多为Gly-Ser/Ala的重复排列，Gly位于折叠片平面的一侧，Ser/Ala等排列在平面的另一侧，层与层间，Gly与Gly相对，Ser/Ala与Ser/Ala相对； 3)链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华作用维系。 12.蛋白质翻译后修饰主要有哪些方式？这些修饰一般发生在哪些氨基酸的侧链上？ 1)N-端乙酰化； 2)蛋白质多肽链中Ser、Thr、Tyr侧链的磷酸化； 3)蛋白质多肽链中Ser、Thr、Asn侧链糖基化； 4)蛋白质多肽链中Lys侧链泛素化。 13. 凝胶过滤柱层析测定蛋白质分子量的原理。 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，大部分为一些交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 测定几种已知分子量的蛋白质中在凝胶过滤层析中的洗脱体积Ve，Ve与对应蛋白质分子量自然对数 (logMr)成反比，以logMr为横坐标、Ve为纵坐标做出标准曲线。之后，测定目的蛋白质的Ve，从标准曲线上查出目的蛋白质分子量的logMr，即可得到蛋白质的分子量。 14．Pro（脯氨酸）为什么既不利于a-螺旋的形成，也不利于b-折叠的形成？ Pro的α-NH2形成吡咯环成为亚氨基，在多肽链中形成肽键后，其N上无H，不能形成稳定α-螺旋和β-折叠结构中的氢键；此外，吡咯环的限制，二面角f不能满足α-螺旋所需的二面角角度，所以，Pro既不利于α-螺旋的形成，也不利于β-折叠的形成。 15.蛋白质主要有哪些重要功能？请作简要说明。（答出4种即可） 1) 酶的催化作用，代谢过程中几乎每一步反应都有酶的催化。 2) 运输功能。如血红蛋白对O2、CO2的运输，跨膜运输的通道蛋白、载体蛋白等。 3) 免疫保护（如抗体对机体的保护作用，凝血酶的凝血作用 4) 生长和分化的控制（蛋白类激素如胰岛素，真核生物转录因子等 5) 神经冲动的产生和传递（如乙酰胆碱受体蛋白） 物质代谢的联系与调控 一、名词解释 1.GSH：还原型谷胱甘肽，它是一种由三个氨基酸组成的小分子肽，是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂。 2.共价修饰：酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，这一过程称为酶的共价修饰。 3.氧化磷酸化： NADH和FADH2上的电子通过一系列电子传递载体传递给O2，伴随NADH和FADH2的再氧化，释放的能量使ADP磷酸化形成ATP的过程。 4.NADH：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型辅酶Ⅰ，由NAD+接受氢负离子形成，用来实现电子传递。 5.糖异生：生物体将非糖物质（乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等）转变为葡萄糖或糖原的过程。 6.脂肪酸的β-氧化：脂肪酸在一系列酶的作用下，其羧基端α位C原子与β位C原子间发生断裂，每轮生成一个乙酰-CoA和较原来少两个C单位的脂肪酸，这个不断重复进行的氧化过程称为脂肪酸的β氧化。 7.双功能酶：具有一条肽链的酶蛋白，由于某些氨基酸的磷酸化和去磷酸化使之具有两种酶活性，这种酶称为双功能酶。例如：PFK-2/FBPase-2就是一种双功能酶。 8.别构效应：调节分子可与酶分子（活性中心或其他部位）可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性。磷酸果糖激酶就是一种别构酶，ATP是其中一种别构效应剂。 二、问答题 1.胰岛素使如何调节果糖-2,6-二磷酸酶活性的？ PFK-2催化F-2,6-BP的形成；FBPase-2催化F-2,6-BP的水解。PFK-2与FBPase-2位于同一条肽链上，是同一个蛋白质的两种不同形式，是一种双功能酶，二者的活性由酶分子上的一个丝氨酸的磷酸化和去磷酸化控制。磷酸化时，表现为FBPase-2活性，去磷酸化时，表现PFK-2活性。而胰岛素促进PFK-2/FBPase-2去磷酸化，使酶具有PFK-2活性，F-2,6-BP（果糖-2,6-二磷酸）含量升高。注：PFK-2：磷酸果糖激酶2 FBPase-2：果糖二磷酸酶2 F-2,6-BP：果糖-2,6-二磷酸 2.请阐述乙醛酸循环的生理意义。 1.乙醛酸循环实现了脂肪到糖的转变，使萌发的油料种子将贮藏的三酰甘油通过乙酰-CoA最终转变为葡萄糖，对植物的生长发育起着重要的作用。 2.乙醛酸循环提高了生物体利用乙酰-CoA 的能力。只要极少量的草酰乙酸做引物，乙醛酸循环就可以不断产生琥珀酸，进入柠檬酸循环，为柠檬酸循环补充四碳单位。 3.为什么说6-磷酸葡萄糖是各个糖代谢途径的交叉点？ 在糖的分解代谢方面，葡萄糖经过己糖激酶的催化转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖可以进入糖酵解途径氧化，也可以进入磷酸戊糖途径参与代谢。 在糖的合成代谢方面，非糖物质经过糖异生途径转变生产6-磷酸葡萄糖，经葡萄糖-6-磷酸酶催化生成葡萄糖；或者，6-磷酸葡萄糖经过磷酸葡萄糖变构酶的催化，生成1-磷酸葡萄糖，之后再形成UDP-葡萄糖，进一步生成糖原。 由于6-磷酸葡萄糖是各种糖代谢途径的共同中间体，沟通了糖代谢的众多途径，因此 6-磷酸葡萄糖是各个糖代谢途径的交叉点。 4.ATP是磷酸果糖激酶的底物，为什么ATP浓度高，反而会抑制磷酸果糖激酶？ 磷酸果糖激酶有两个ATP结合位点，一是活性中心内的催化部位，ATP作为底物结合；另一个是活性中心以外的与变构效应剂（ATP也是它的变构效应剂之一）结合的部位，该部位与ATP的亲和力较低，即只有在高浓度ATP状态下，才会结合ATP。 所以，当细胞内ATP浓度较低时，ATP主要作为反应底物，保证酶促反应正常进行；当细胞内ATP浓度较高时，ATP作为变构效应剂与磷酸果糖激酶的调节位点结合，使磷酸果糖激酶与6-磷酸果糖的亲和力下降，从而降低磷酸果糖激酶的催化活力。 5.请阐述核苷酸代谢与氨基酸代谢的关系。 氨基酸代谢过程中，产生的甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺可以作为合成嘌呤的原料；天冬氨酸、谷氨酰胺可以作为合成嘧啶的原料。 6.体内代谢在不同层面受到严格调控，包括酶水平、细胞水平、整体水平调节等，请分别阐述这些层次的调节是如何进行的。 细胞水平的代谢调节——主要是酶水平的调节： 1.细胞内酶的隔离分布避免了各种代谢途径互相干扰。 2.酶活性的调节：别构调节和共价修饰调节。代谢途径的方向由关键酶的活性决定。 3.酶量的调节：通过酶的合成和酶的降解来实现的。 激素水平的代谢调节：主要是胞内受体激素作用的调节和膜受体激素作用的调节。 整体水平的代谢调节： 1.饱食状态。进行糖原合成、蛋白质合成、甘油三酯合成、尿素合成、糖酵解。 2.饥饿状态。 ①短期饥饿：（1）蛋白质代谢变化。分解加强，氨基酸异生成糖；（2）糖代谢变化。糖异生加 强，组织对葡萄糖利用降低；（3）脂代谢变化。脂肪动员加强，酮体生成增多。 ②长期饥饿：（1）蛋白质代谢变化。蛋白质分解减少；（2）糖代谢变化。肝肾糖异生增强；肝 糖异生的主要原料为乳酸、丙酮酸；（3）脂代谢变化。脂肪动员进一步加强，脑组织利用酮体增加。 3.运动状态。 ①100米：糖酵解和磷酸分解供能； ②1000米：糖酵解和糖的有氧氧化； ③马拉松：糖原分解和脂肪酸的有氧氧化。 7.糖原分解采用磷酸解而不是水解的生理意义是什么？ 糖原磷酸解产物（糖原先磷酸解成1-磷酸葡萄糖，然后在变构酶的催化下生成6-磷酸葡萄糖）可以直接进入糖酵解途径进行降解；而水解产物（葡萄糖）需要消耗ATP进行磷酸化（耗能），磷酸化后生成的6-磷酸葡萄糖才可以进入糖酵解途径进行降解。糖原分解是为了产生能量，采用磷酸解可以避免了消耗能量，这样就可以提供更多的能量用于其他反应。 8.体内产生NADPH的途径主要是什么？NADPH具有哪些生理功能。 体内产生NADPH 的途径主要是磷酸戊糖途径。 生理功能： 1.作为供氢体，参与体内多种生物合成反应，如从乙酰-CoA合成胆固醇； 2.参与肝脏生物转化反应； 3.参与体内嗜中性粒细胞和巨噬细胞产生离子态氧的反应，有杀菌作用； 4.NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，能维持细胞中谷胱甘肽的还原状态，进而维持红细胞的正常结构和功能。 酶动力学分析及活性调节 1.酶的活性中心：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物的部位。 2.寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。 3.抑制剂：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质。 4.竞争性抑制：抑制剂与底物的结构类似，二者都可以与酶的活性中心结合，但不能同时结合，即二者竞争酶的活性中心。抑制原理是抑制剂与酶可逆地结合形成EI复合物，但不能分解为E和P。 5.酶原：在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，必须经过适当的改变才能变成有活性的酶，此前体物质称为酶原。 6.同工酶：催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质和免疫学性质不同的一组酶。 7.比活力：酶的比活力是指每毫克酶蛋白所具有的酶活性单位数，反映了酶的纯度。 8.K cat：当酶被底物饱和时，每秒每摩尔酶分子将底物转换成产物的摩尔数，K cat值越大，酶的催化效率越高。 简答题： 1、别构酶在结构、动力学等方面与米氏酶有怎样的区别？ 与米氏酶相比，别构酶有以下特点： （1）别构酶一般都是寡聚酶，通过次级键由多亚基组成； （2）别构酶分子中包括活性中心和别构中心。二者可位于同一亚基上，也可位于不同亚基上；（3）别构酶具有别构效应，通过改变自身的构象来改变酶的活性。它具有两种构象，R型对底物亲和力高，T型对底物亲和力低。 （4）别构酶的v-[S]的关系不符合米氏方程，其曲线非双曲线，而是呈“S”形。 2、请阐述酶催化高效性的机制。 (1)邻近效应与定向排列 邻近效应：底物和底物之间，酶的催化基团和底物的反应基团需要互相靠近，才能反应。 定向排列：酶的催化基团与底物的反应基团之间，或底物的反应基团之间的正确取向所产生的效应。 (2)诱导契合：底物与酶活性部位结合，会引起酶发生构象变化，使两者相互契合从而发挥催化作用。 (3)酸碱催化：酶活性中心的功能基团可作为酸或碱向底物提供H+或提供 H+受体，相互作用形成过渡态，降低活化能。 (4)共价催化 亲核催化：酶分子中具有非共用电子对的亲核基团攻击缺少电子的，具有部分正电性的原子，形成暂时的共价键，稳定了过渡态。亲核基团有：His的咪唑基，Cys的巯基，Ser或Thr的羟基。 亲电催化：酶蛋白分子中的亲电基团攻击底物分子中富含电子的原子，形成共价键，稳定了过渡态中间产物。亲电基团有：H+、NH3+ 、Mg2+ 、Mn2+ 、Fe3+。 (5)酶活性中心的疏水环境效应。疏水的氨基酸残基形成的反应口袋提供了非极性的环境，使极性的离子或离子化的氨基酸残基在疏水口袋中进行催化反应。 3、酶的辅助因子在催化作用中发挥着哪些作用？ 全酶包括酶蛋白和辅助因子，辅助因子主要是金属离子和小分子有机化合物。 金属离子的作用：稳定酶的构象；酶活性中心的组成部分；在酶与底物间起桥梁作用。 小分子有机化合物的作用：在酶促反应中传递电子、质子或其它基团。 4、什么是米氏常数？它的意义是什么？ 米氏常数：K m值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L 意义： (1) K m是酶的特征常数: 只与酶的性质有关，与酶的浓度无关，K m随着底物、反应温度和pH等条件而改变，故对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的K m值，可用来鉴别酶。 (2) K m可判断酶的专一性和天然底物，K m最小的底物是该酶的天然底物； (3) K m可以作为酶与底物结合紧密程度的一个度量，表示酶和底物结合亲和力的大小； (4)已知某个酶的K m值，就可以计算出在某一底物浓度时，其反应速率相当于V max的百分率； (5) K m可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。例如根据K m值可以推断在丙酮酸浓度较低时，容易走乳酸脱氢酶催化丙酮酸形成乳酸的途径。 5、为什么过渡态底物类似物可作为酶的竞争性抑制剂？ 与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心从而阻碍酶底物复合物的形成、使酶活性受到抑制的抑制剂，即酶的竞争性抑制剂。而过渡态底物类似物正好满足竞争性抑制剂的特征。 6、pH是怎样影响酶活性的？ 酶的活力受环境pH的影响，在某pH条件下，酶表现最大活力，此pH称为酶的最适pH。 1）过酸、过碱引起酶空间结构的破坏，酶构象的改变，导致酶活性丧失； 2）当pH改变不是很剧烈时，酶虽然没有变性，但是酶活受到影响； 3）pH影响酶蛋白氨基酸侧链的解离, 酶构象的改变，酶活性受到影响。 7、当一酶促反应进行的速率为V max的80%时，K m和［S］之间有何关系？ 由米氏方程式：v= V max[S] /（Km+[S]）可得： 80%xV max=V max[S] /（Km+[S]） 0.8=[S] /（Km+[S]） Km=25%[S] 8、激酶是如何调节酶的活性的？试举一例说明。 激酶是一类从高能供体分子（如ATP）转移磷酸基团到特定靶分子（底物）的酶。 例：糖原合酶在磷酸化后无活性，而蛋白激酶A（PKA）可以通过催化它的磷酸化来抑制它的活性。 生物膜与细胞信号转导 一、名词解释 1.脂筏：脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域，大小约70nm左右，是一种动态结构，位于质膜的外小页。 2.转运蛋白：转运蛋白是膜蛋白的一大类，能够通过渗透性屏障（细胞膜）转运糖，氨基酸，离子，药物等亲水性化合物，介导生物膜内外的化学物质以及信号交换。 3.P-型ATPase：是分布于各种生物细胞质膜中的ATP动力泵的一类，为阳离子转运蛋白，含有两个相同的催化性α亚基，转运时至少有一个α亚基被磷酸化，磷酸化使得转运蛋白的构象发生变化，转运阳离子做跨膜运输。 4.次级主动运输：第一种溶质(S1)通过初级主动运输产生浓度梯度后，接着，第一种溶质顺着浓度梯度提供能量，驱动第二种溶质(S2) 逆浓度梯度运输。 5.G蛋白分子开关：G蛋白的异源三聚体（α、β、γ）作为分子开关。⑴当外界有信号时，G蛋白受体与相应的配体结合，受体构象改变，G蛋白的α亚基释放GDP，由GTP代替；⑵接着，α亚基与β、γ亚基分开，α亚基携带着GTP从G蛋白复合体上解离下来，与腺苷酸环化酶结合，分子开关打开，腺苷酸环化酶催化产生cAMP；⑶然后，G蛋白的GTPase活性水解结合的GTP，使G蛋白失活，α亚基重新与β、γ二聚体结合，重新形成三聚体G 蛋白，分子开关关闭，腺苷酸环化酶的活性丧失。 6.激酶锚定蛋白：它是一种支架蛋白，位于脂筏的胞质侧，将信号通路中执行功能的蛋白聚集在一起，便于反应的进行。 7.信号蛋白：信号蛋白是蛋白质的一种，可在细胞内和细胞间进行信号传递，协调和控制相关代谢和生命活动。它包括了接头蛋白、停靠蛋白、转录因子和信号酶。 8.MAP激酶级联反应：MAP家族的三个激酶级联起作用。当Ras蛋白激活MAPKKK后，MAPKKK磷酸化MAPKK，从而激活MAPKK，然后，MAPKK再磷酸化MAPK，最终激活MAPK。 二．简答题： 1.溶质分子跨膜运动，有哪几种机制？ (a)直接跨膜简单扩散：从高浓度区向低浓度区运输； (b)离子通道简单扩散，通过亲水通道，从高浓度区到低浓度区运输； (c)易化扩散：溶质与位于膜一侧的易化转运蛋白结合，引发蛋白构象变化，将溶质暴露到膜的另一侧的表面，然后溶质顺着浓度梯度扩散出去； (d)主动运输：通过转运蛋白放能过程(如ATP水解)释放的能量，使转运蛋白上特异结合位点的亲和性发生改变，溶质分子的运输方向总是逆浓度梯度，从低浓度区到高浓度区。 2.以细菌KcsA钾离子通道为例，说明电压门控的钾离子通道结构与运输的关系 细菌钾离子通道是由四个亚基组成，每个亚基由两个跨膜的螺旋(M1和M2)和通道胞外的孔区域(P) 组成。P是由一个长约1/3通道宽度的短的螺旋和一个能形成“衬里的”狭窄的选择性过滤器的无螺旋的环(loop)组成，允许K+通过。 选择性过滤器的衬里含有高度保守的Gly-Tyr-Gly-Val-Thr，这五肽骨架的羧基(C=O)形成四个连续的羰基氧原子环和一个Thr侧链产生的氧原子环。产生5 个连续排列的氧原子环。每个环由四个氧原子组成(四个亚基，各贡献一个)，直径是3nm，而失水K+直径是2.7nm。当K+进入通道时，电负性的氧原子替代了与K+结合的水分子。 具有“门”，每个亚基的M2 螺旋与另一个亚基的M2螺旋相互交叉形成一个“helix bundle”，封闭了面向质膜的孔；M2螺旋可以在具有甘氨酸残基的位点弯曲，将通道门打开。 3.乙酰胆碱受体门控通道结构及离子运输机制 结构：由5个亚基组成，包括2个α，1个γ，1个β和1个δ亚基。每个α亚基带有1个乙酰胆碱结合位点。每个亚基含有4个跨膜双螺旋，5个亚基围成1个中心孔，孔直径约20?，突出在胞质和细胞表面。 离子运输机制：无乙酰胆碱时，组成5个亚基的M2螺旋所含有的共5个Leu侧链突出在通道，限制了通道的直径，离子无法通过；当乙酰胆碱与乙酰胆碱受体结合时（2个乙酰胆碱结合到2个α-亚基上），构象发生变化，M2螺旋的轻微扭曲，5个 Leu 残基旋转，远离通道中心，由较小的极性氨基酸代替，通道门打开，允许Ca2+、Na+和K+通过。 4.试述Na+/K+-ATPase结构及转运过程 Na+/K+-ATPase结构：它是由一个跨膜的催化亚单位α亚基和与其结合的一个糖蛋白β亚基所组成。转运过程： ①泵蛋白在胞内结合3个Na+，ATP水解； ②泵蛋白被磷酸化； ③构象发生变化由E1转变为E2，此时Na+结合位点暴露在胞外，蛋白失去对Na+的亲和性，将Na+释 放到胞外； ④3个Na+被释放后，泵蛋白获得2个K+； ⑤去磷酸化； ⑥构象恢复到初始E1，结合位点在膜内表面打开，并失去对K+的亲和性，将K+释放到胞内。 5.依据受体类型可将信号传导途径分为哪几类？这几类信号途径的受体都有哪些区别？ 分为六类： 1)G蛋白偶联受体介导的信号通路 ①以cAMP为第二信使的信号通路； ②肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)双信使的磷脂酰肌醇信号通路 2)酶活性受体介导的信号转导 3)受体鸟苷酸环化酶 4)门控的离子通道 5)粘附受体整合素 6)核受体 G蛋白偶联受体含有7个跨膜双螺旋，每个跨膜α-螺旋由20-28个氨基酸残基组成，α-螺旋之间由长度可变的loop相连，N-末端在细胞外侧，C-末端在细胞质侧。3个loop在胞外，形成配体结合位点，同时，有3个loop在胞内，G蛋白与胞内第3个loop结合。C-末端与分子支架结合，可与许多信号蛋白和效应器相互作用。 ⒍以肾上腺素调节血糖为例，试述cAMP为第二信使的信号转导途径的作用机制 ①肾上腺素与G蛋白耦联受体结合后，激活了G蛋白α-亚基； ②G蛋白α-亚基激活了效应子腺苷酸环化酶； ③腺苷酸环化酶催化ATP形成cAMP； ④cAMP在胞质中扩散，与蛋白激酶A调控亚基结合，引起调控亚基分离，释放了有活性的PKA的催 化亚基； ⑤肝细胞中PKA的底物包括葡萄糖代谢中2个重要的酶：糖原合成酶和磷酸激酶。糖原合成酶的磷 酸化抑制它催化活性，使葡萄糖不能转化成糖原；而磷酸激酶被PKA磷酸化后，又催化磷酸基团转到糖原磷酸酶分子上，该酶被激活； ⑥糖原磷酸酶催化糖原的分解，生成葡萄糖-1-磷酸； ⑦葡萄糖-1-磷酸转化成葡萄糖，扩散到血液，达到身体各组织中。 ⒎IP3（肌醇三磷酸）和DAG（二酰甘油）双信使磷脂酰肌醇信号途径 乙酰胆碱与受体结合激活异三聚体G 蛋白，依次激活效应子磷脂酶C（此处涉及的是其中一种磷脂酶——PLCβ），PLCβ定位在质膜的内表面，通过其PH domain与嵌入在脂双层中的磷酸肌醇相互作用。PLCβ使PIP2分解成IP3（1,4,5-三磷酸肌醇）和DAG（二酰甘油），它们可作为第二信使。 DAG是一种脂类分子，生成后仍存留在质膜里，募集和激活蛋白激酶C（PKC）效应蛋白， PKC可以磷酸化多种不同靶蛋白的丝氨酸和苏氨酸。 IP3是一种能快速扩散的水溶性磷酸糖小分子，IP3在质膜上形成后，快速扩散到细胞质基质中，与光面内质网(SER)表面的特异IP3受体结合。SER中贮存大量的Ca2+，由于IP3 受体不只是结合配体，本身是一个四聚体的Ca2+通道，所以IP3的结合使通道开放，让 Ca2+离子扩散到细胞质中。 Ca2+是细胞内信使或第二信使，与各种靶分子结合，激发各种特异反应。 ⒏胰岛素是怎样通过受体酪氨酸激酶信号通路调控血糖？ 胰岛素受体是一种跨膜蛋白，是由α和β两种亚基通过二硫键组成的四聚体型受体，α亚基处于 细胞膜外，β横跨于细胞膜上，β亚基具有酪氨酸激酶（TK）活性，能催化ATP的γ磷酸基转移到受体底物的酪氨酸残基上，将受体底物磷酸化。 胰岛素与胰岛素受体上的α亚基结合后，将信息传递给β亚基，β亚基酪氨酸激酶发生自身磷酸化而激活，之后被激活的β亚基催化胰岛素受体底物（IRS）的磷酸化。 糖生物学与糖组学 1、糖生物学：通过运用分析化学、合成有机化学、生物化学与分子生物学、遗传学和细胞生物学等多学科手段研究糖及其衍生物的结构、合成代谢、生物学功能，以及与疾病的关系的一门交叉科学，包括糖化学、糖链合成、糖链在生物系统中功能及糖链操作技术等。 2、糖组学：是从分析和破解一个生物或一个细胞全部糖链所含信息这一角度入手，研究糖链的分子结构、表达调控、功能多样性以及与疾病的关系的科学。 3、糖缀合物：又叫糖偶联复合物，他是糖与蛋白或脂类形成的共价结合物，如糖蛋白、糖脂、糖胺聚糖、蛋白聚糖及小分子糖苷等。 4、糖基化反应：核苷糖供体和受体（如单糖、寡糖、蛋白质、脂和DNA）在特定的糖基转移酶的催化下生成糖基化受体同时释放出核苷酸的过程。 5、糖基转移酶：负责催化糖苷键的合成，是膜结合蛋白，由跨膜区，茎区和催化域组成。糖基转移酶对受体结构有高度的特异性，并且酶的底物专一性相互重叠。糖基转移酶的表达是基本水平组成型表达，还有发育阶段依赖及组织专一性，有105家族。 6、核苷糖转运子：在真核细胞中，能够将在细胞质中合成的核苷糖转运到亚细胞器（如内质网/高尔基体）的腔内，并从亚细胞器中送出核苷二磷酸转化生成的核苷一磷酸的蛋白载体，位于膜上。 7、N-糖链：糖链连接到蛋白质的天冬酰胺（的-NH2）上，核心结构是Asn-GlcNAc2Man3，糖链较长，结构较复杂。（注：其中Asn是天冬酰胺，GlcNAc是N-乙酰葡萄糖胺，Man是甘露糖。） 8、O-糖链：糖链连接到蛋白质的丝氨酸或苏氨酸（的-OH）上，糖链短，结构简单。 9、糖苷酶：是一类催化糖苷键水解的酶。在酸性条件下，能催化由半缩醛羟基与醇羟基反应形成的糖苷键的断裂，有内切糖苷酶和外切糖苷酶。根据结构差异分为135个家族（GH1-GH135）。 10、凝集素：一类非免疫来源的糖结合蛋白，没有酶活性，蛋白上有糖识别域，特异识别糖链末端特定的糖结构，能引起细胞凝集。 11、植物疫苗：病原体侵染植物，细胞表面半纤维素类多糖降解为寡糖，寡糖作为信号分子诱导植物基因表达，使植物表现出多种防卫功能，这些寡糖类物质具有类似疫苗的功能，植物疫苗有壳寡糖和几丁寡糖、葡寡糖、寡聚半乳糖醛酸。 问答题 1、糖生物学研究的什么？ (1) 糖链的结构； (2) 糖链的生物合成与代谢； (3) 糖链在生物体中的功能 2、为什么糖链具有多样性和复杂性？ 1、单糖具有异构现象，结构异构、立体异构、旋光异构、开链和环状、吡喃和呋喃，α-异构糖和β-异构糖。 2、单糖的修饰：甲基化、脱氧、氨基化、酯化（乙酰化、磷酸化、硫酸化） 3、寡糖：单糖组成的顺序，糖苷键连接位置和异头碳（α/β），空间结构 4、糖链上有分支糖或分支糖链 5、多糖有同多糖和杂多糖 6、糖偶联复合物：寡糖、多糖与蛋白质、脂和核酸等形成藕联复合物。糖蛋白（糖基化位点）、糖脂、蛋白聚糖 3、真核细胞中蛋白质的N-糖链是如何合成的？ （1）UDP-糖作为供体，在内质网（ER）膜外侧合成。UDP-GlcNAc被糖基转移酶GlcNAc-1-P转移酶加到膜上的多萜醇磷酸（Dol-P）上，合成Dol-P-P-GlcNAc。 UDP-GlcNAc+Dol-Dol-P-P-GlcNAc （2Dol-P-P-GlcNAc- GlcNAc。再在甘露糖转移酶的作用下将5个甘露糖依次连接到糖链上合成N-糖链的核心结构 Dol-P-P-GlcNAc2Man5 （3）然后糖链被转位到内质网膜内侧，在内质网腔中,在特定糖基转移酶的作用下糖链继续延伸，加入甘露糖（Man）和葡萄糖（Glc），形成复杂的糖链Dol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3 （4）多帖糖连接的寡糖链在寡糖转移酶（OST，oligosaccharyltransferase）的作用下被转移到蛋白质天冬酰胺（Asn）上。葡萄糖和几个甘露糖被水解下来，其他糖被加到蛋白质的N-糖链上。（5）更复杂的糖基化修饰在高尔基体中完成。 4、分离纯化糖链的方法有哪些？解析鉴定糖链技术有哪些？ 一、分离纯化糖链的方法 (1) 阴离子交换柱色谱（HPAEC）：糖类分子在强碱性流动相中以阴离子的形式存在，能在阴离子交换柱上被保留并得到分离。 (2) 亲水作用液相色谱（HILIC）：以强亲水性的极性吸附剂作为固定相，以高比例有机相和低比例水相作为流动相，分离极性和亲水性化合物。如分离单抗IgG（免疫球蛋白）上的寡糖。 (3) 多孔石墨化碳色谱：分离极性很强的糖等物质如非衍生化的糖链和带有极少量氨基酸的糖肽。 (4) 柱前衍生-反相高效液相色谱（RP-HPLC）：要进行糖链的柱前衍生，在糖链进入色谱柱前，先将其与具有紫外或荧光活性的物质进行标记，使糖链带上紫外或荧光吸收基团，使衍生物在反相色谱柱上保留并实现分离，此外也能提高样品对质谱检测的灵敏度。 二、糖分析技术 1. 样品的前处理：水溶液提取、亲脂性有机溶剂提取 2. 色谱技术：高效液相色谱（HPLC）和离子色谱（HPAEC) 3. 电泳技术：毛细管电泳，荧光辅助糖电泳（FACE)，二维凝胶电泳，亲合色谱（Lectin)，微流技术，TLC（薄层色谱法） 三、糖链结构的鉴定技术 1. 电喷雾离子化质谱（ESI-MS) 2. 基质辅助激光解吸离子化质谱（MALDI-MS, MLADI-TOF-MS) 3. 核磁共振技术（NMR)。通过化学位移鉴定单糖组成，通过耦合常数等确定单糖之间的连接键。5、糖基化工程主要研究什么？ 1、糖蛋白、糖链的功能分析 影响蛋白质的物理化学性质（如：热稳定性、溶解度、分子构象、药物代谢动力学）；影响蛋白质的生物学性质（如：免疫原性、半衰期、活性、促进亚细胞之间的运输、分泌和清除、安全性） 2、糖基化表达体系的构建。糖基化有种特异性、组织特异性、细胞特异性，选择合适的细胞株特定表达具有天然糖型或更接近天然糖型的糖基化蛋白。 各表达体系及其特点如下： 酵母细胞：由于没有加工糖链的酶，不能将糖链加工成复合型； 丝状真菌：能大量表达分泌蛋白，其蛋白质的糖基化修饰更接近于哺乳动物细胞； 昆虫细胞：可以合成N-糖链、O-糖链； 哺乳动物细胞：是最佳的途径，但培养和大量表达有一定难度。 6、功能寡糖的合成与制备方法？ 1、从天然产物中分离寡糖 植物的根茎叶种子。采用水和乙醇提取寡糖，再纯化精制。糖蛋白和糖脂中的糖链用特定的糖肽酶或内切水解酶，用无水肼、稀碱水解。通常用于糖芯片。 2、自然界多糖经提取、降解、转化等手段大规模制备寡糖。 酶学方法降解：条件温和，速度快，定向可控。关键是找到合适的糖苷酶，酶降解反应工艺。 化学方法降解：酸水平、碱水平、氧化降解。快、剧烈、产品多为单糖双糖，活性高的寡糖少，条件难以控制，环境污染严重。 3、化学合成寡糖 程序化一釜法，合成3-6个糖残基的直链或分支寡糖，以对甲基酚硫代糖苷为糖基化试剂，将要合成的寡糖序列输入计算机，由计算机从反应活性不同的糖基供体中选择合适的供体并混合，合成从寡糖的非还原端开始，到还原端结束。但成本太高，难以大规模产业化应用。 4、酶促合成寡糖：利用从动物微生物中克隆表达的糖基水解酶、糖苷酶，其他糖链代谢酶用于糖链、糖缀合物的合成。 5、化学法和酶法联合产生寡糖。 7、简述功能寡糖的生物活性功能的研究机制 1、抗氧化的作用机制 多种植物寡糖有清除自由基和抗脂膜过氧化的活性，增强肝SOD的活性。如酸性木寡糖可抑制胃炎，降低胃粘膜出血点。 2、免疫调节作用机制 1．对先天免疫的调节作用包括对巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和NK细胞（自然杀伤细胞）的调节作用 2．在获得性免疫系统中，对T细胞、B细胞和补体具有调节作用 3、抗肿瘤作用机制 1．抑制肿瘤细胞的增殖 2．引起肿瘤细胞的凋亡 3．抑制肿瘤血管的生成和迁移 4．通过调节免疫系统发挥抗肿瘤作用 5．影响肿瘤细胞信号转导 4、调节肠道菌群的机制 益生元等物质诱导双歧杆菌小亚基核糖体RNA的量，诱导双歧杆菌生长 5、降血糖、血脂及预防肝脏疾病 II型糖尿病人饮食中加入木寡糖可以降血糖、血脂，木寡糖导致红细胞中的CAT活性降低。 灵芝中提取的蛋白多糖抵抗四氯化碳诱导的肝损伤，抑制TNF-（肿瘤坏死因子-α）的水平，清除自由基。 给酒精肝的小鼠喂食壳寡糖，肝损伤明显改善。 6、抗炎作用 对盲肠切除术后的大鼠施以新霉素（一种氨基糖苷类抗生素）；-半乳糖抑制气道嗜酸性粒细胞；壳聚糖调节磷酸化信号级联放大抑制一些过敏反应。 8、植物糖信号有哪些？ 1、植物正常生理过程中的糖信号 可作为信号分子通过调节相关基因的表达和酶的活性，在植物中起重要信号作用。如在种子萌发时，己糖信号能调控细胞分裂，加快胚发育速度；在种苗发育期，己糖信号与植物激素协同作用抑制子叶绿化，子叶伸展和枝条发育。 2、豆科植物与固氮菌共生过程中的糖脂信号 植物根释放出类黄酮类物质可诱导固氮菌nod基因表达，参与合成nod因子（3-5个几丁寡糖连接一条脂肪酸），nod因子在固氮共生过程中起重要作用，刺激根瘤的形成。脂几丁寡糖是糖信号。 3、植物逆境糖信号 在病原菌和植物的互作中，一系列糖苷酶活力被激发，将病原菌与植物细胞壁的多糖降解为寡糖片段（如寡聚半乳糖醛酸、葡聚糖、几丁寡糖、壳寡糖），这些寡糖在极微量时能激活植物免疫，发生强烈的抗病反应。 9、凝集素有何特点，有哪些应用？ 凝集素：一类非免疫来源的糖结合蛋白，无酶活性，蛋白上有糖识别域，特异识别糖链末端特定的糖结构，能引起细胞凝集。 特点： 1、亲和力低，通过成簇聚集来提高其亲和力。 2、多价，有多个结合位点，和细胞结合同时也可与肽链结合。 3、专一性的识别能力 4、改变受体的生物特征，特异结合使受体的结构和空间构象改变，产生相应的生物效应，如细胞凝集。 应用： 1、作为生物探针检测特定的糖链； 2、作为疾病的生物标记（biomarker），用于早期癌症的检测； 3、细胞俘获，如细胞分类，细胞富集 4、作为原料，如增加细胞亲和力，细胞相互作用 5、作为抑制剂阻断细菌病毒等对宿主细胞的粘附感染 10、简述糖组学研究的三大段：上游、中游、下游。 一、糖组学的上游——研究糖组的产生和形成及影响糖组的因素（也称为结构糖组学） 1、糖基转移酶及其基因 合成糖蛋白聚糖中糖链的糖基转移酶GnT（N-乙酰氨基半乳糖转移酶）有6种，具有不同的专一性，它们的不同组合使N-糖链更加地复杂，从而得到不同的N-糖链。 2、植物和微生物多糖合成的酶系 如直链淀粉的合成由一种糖基转移酶完成，而支链淀粉的合成需要九种糖基转移酶。核心寡糖和O-抗原都需要在一系列的糖基转移酶作用下合成。 3、微生物中含糖抗生素的合成 如红霉素、阿霉素、链霉素等都含有糖基：万古霉素是糖肽类抗生素。 4、植物中修饰小分子的糖基转移酶 如生物碱和小的亲脂化合物被糖基化，通过糖基化调节母体化合物的生物活性、细胞内定位和代谢。 5、修饰和改变糖基的酶 多糖链在合成后的修饰（如糖苷酶水解、磷酸化、硫酸化、酯化、醛酸化）；微生物中稀有糖的合成。 6、参与糖链合成的其他分子 如CDGS（先天性糖基化病），供体糖合成发生障碍。 7、糖链合成异常导致糖组的改变 糖链结构的改变和某些糖链绝对含量及各种糖链之间相对含量的改变，其综合的结果是糖组的改变。 二、糖组学的中游——研究糖组产生和改变的生物学意义（功能糖组学） 1、糖与蛋白质的相互作用：参与诸多的生理和病理过程。 植物凝集素，可能与植物的防卫有关；与壳寡糖结合的蛋白在固氮中起作用。 动物凝集素，参与细胞分化、发育、凋亡、免疫调节等。 微生物凝集素，具有很强的专一性，识别粘附细胞。 2、糖与糖基转移酶及其他蛋白质的相互作用 如：β1-4半乳糖基转移酶存在于精子细胞的表面，比细胞内的酶多13个氨基酸，作用是参与精子与卵细胞的黏着。 3、糖与抗体的相互作用 如血型相关糖链和抗体的相互作用是输血和动物器官移植时必须考虑的。类风湿的一个原因是人类lgG上各种糖型间比例的改变，更多的lgG上的糖链还原端变成N-乙酰氨基葡萄糖基，导致机体将这些糖链视为异物，诱发产生抗体。 4、糖和糖的相互作用 不普遍，是一种细胞和细胞之间的作用方式，如胚癌细胞之间的黏附。 三、糖组学的下游——研究糖组的降解或消失 研究较少，糖链被溶酶体中糖苷酶降解。如果糖苷酶缺失，这些酶作用的底物贮积导致病变，如糖脂贮积症和黏多糖贮积症。 11、简述糖组分的研究策略有哪些？ 一、结构糖组学的研究策略 1.糖捕获技术 1）利用凝集素亲和层析分离糖蛋白 2）特异的蛋白酶的消化产生糖肽； 3）利用凝集素亲和层析分离糖肽； 4）利用高效液相色谱HPLC纯化糖肽； 5）鉴定糖肽（糖组数据库，PNGaseF作用N-糖链，用18O确定N-糖基化位点） 2、其他技术 荧光标记糖肽，过凝集素亲和层析柱子，ESI-MS和HPLC联用； 双向凝胶电泳和MS联用 二、功能糖组学的研究策略 1. 芯片技术 在一定程度上可以解决研究的高通量问题。 糖与支持物的交联，即在芯片上固定寡糖、单糖、双糖，而且使用多价的糖链以提高糖结合蛋白与糖链的亲和力，检测糖结合蛋白质。或者糖与凝集素等糖结合蛋白质交联，检测糖链对蛋白质的结合。在糖微阵列和糖芯片研究中的困难是糖链结构的复杂性和大量结构不同糖链的来源。 2. 细胞模型和动物模型的利用 1）细胞模型是指糖链表达发生突变的细胞株。通过细胞诱变可得到一系列糖链表达发生突变的细胞株，借助这些突变的细胞株和糖基转移酶基因的转染技术可研究细胞的表型，如发现癌细胞表面糖链发生改变的糖蛋白。 2）模型生物（研究糖链改变对整体动物的影响） 通过改变不用类型的糖基转移酶的表达水平，观察糖链结构改变将会产生怎样后果；通过改变各种糖结合蛋白的表达水平，观察模型生物会发生哪些变化。