放线菌的选择分离培养

厌氧培养方法

厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 1．生物学方法培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。 2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下： Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每 1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。（２）焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin) 。每 l00cm3 空间用焦性没食子酸1g 及 10％氢氧化纳或氢氧化钾l0ml ，其具体方法主要有下列几种： 1）单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸 0.2g 及 10％ NaOH 溶液 0.5mL 。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人 37C 温箱培养 24~48h 后，取出观察。 2） Buchner 氏试管法：取一大试管，在管底放焦性没食子酸0.5g 及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入 20％ NaOH 溶液 0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡， 37 培养 24~48h 后观察 (图１－６ )。３）玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢

微生物--土壤放线菌的分离与鉴定

土壤放线菌的分离与鉴定实验设计报告学院：生命科学学院班级： 2013级生科2班组长：刘瑜 2013506076 组员：汤界世 2013506070 李宇秀 2013506071 于淑婷 2013506075 陈洁作 2013506079

郑国梁 2013506083 2015年10月15日一、实验目的 1、了解采集土样的要求和方法。 2、掌握由土壤中分离稀有放线菌的基本原理和操作技术。 3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。 4、学习并掌握抗生菌的鉴别方法。二、实验原理土壤是微生物的大本营，其中的放线菌多以链霉菌为主，因此人们通常将除链霉菌以外的其它放线菌统称为稀有放线菌。一般地，放线菌在比较干燥、偏碱性、含有机质丰富的土壤中数量居多。若以常规方法进行分离，得到的几乎全部是链霉菌。然而，当采用加热处理土样、选用特殊培养基或添加某种抗生素等方法时，均可提高稀有放线菌的获得率。由土壤中分离放线菌的方法很多，其中包括稀释法、弹土法、混土法和喷土法等，本实验主要采用稀释法，并通过选用特

殊培养基的方法，来获得放线菌。

放线菌菌丝由基内菌丝，气生菌丝和孢子丝组成。其菌丝体在培养基内，即基内菌丝或称营养菌丝体。基内菌丝体一般没有横隔，由于菌丝体长入培养基内和培养基表面，并纠缠在一起形成密集的菌落，所以用接种针将整个菌落培养基挑起而不破裂。基内菌丝体大部分呈黄、橙、蓝、紫、绿、徽，但也有无色在显微镜下观察时，气生菌丝体颜色较深，且较基内菌丝体粗两倍左右。气生菌丝体发育到一定阶段，在它上面形成孢子丝。孢子丝形状有直、波曲、螺旋、轮生之分。螺旋有松、紧、大、小之分，其螺旋的方向也有左旋与右旋之分，大多数种为左旋，少数为右旋。孢子具有不同的形状，有球形、椭球形、杆状、柱状，在光学显微镜下就能看清楚。根据菌体基内菌丝，气生菌丝和孢子丝的这些特征即可判断出分离出的菌体为放线菌。三、实验材料试剂与仪器设备 1、材料：土壤样品（采集生科院门前草地土壤、16号楼内花圃土壤各500g） 2、试剂：1）培养基（高氏一号培养基）：可溶性淀粉（20.0g）、硝酸钾（1.0g）、磷酸氢二钾（0.5g）、硫酸镁（0.5g）、氯化钠（0.5g）、硫酸亚铁（0.01g）、水1000ml、pH7.2-7.4

放线菌筛选的一般方法

放线菌筛选的一般方法摘要：放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中（主要是链霉菌），其数量仅次于细菌。放线菌是革兰氏阳性细菌。因菌落呈放线状而的得名。常以孢子或菌丝状态存在，在自然界中分布很广，主要以孢子繁殖。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。关键词：放线菌筛选微生物 1 放线菌的情况放线菌（Actinobacillus）是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物。因在固体培养基上呈辐射状生长而得名。大多数有发达的分枝菌丝。菌丝纤细，宽度近于杆状细菌，约～1微米。可分为：营养菌丝，又称基质菌丝，主要功能是吸收营养物质，有的可产生不同的色素，是菌种鉴定的重要依据；气生菌丝，叠生于营养菌丝上，又称二级菌丝。是一群革兰氏阳性、高(G+C)mol%含量(>55%)的细菌。放线菌因菌落呈放线状而的得名。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等）、维生素（B12）和有机酸等。弗兰克菌属（Frankia）为非豆科木本植物根瘤中有固氮能力的内共生菌。此外，放线菌还可用于甾体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。少数放线菌也会对人类构成危害，引起人和动植物病害。因此，放线菌与人类关系密切，在医药工业上有重要意义。放线菌在自然界分布广泛，主要以孢子或菌丝状态存在于土壤、空气和水中，尤其是含水量低、有机物丰富、呈中性或微碱性的土壤中数量最多。放线菌只是

技能点3细菌的分离培养及培养特性观察(精)

技能点3 细菌的分离培养及培养性状的观察实训目标能对不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤(疱肉)培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。方法与步骤一、细菌的分离培养 1．平板划线分离法平板划线是通过将被检材料连续划线而获得独立的单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落机会也愈多。具体操作步骤如下： (1)右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。 (2)无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。 (3)左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧(角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基)。 (4)将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30～40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与台面垂直且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。 (5)划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37℃温箱中，培养18～24h观察结果。凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。 2．倾注分离法取3支融化后冷至50℃左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物(或被检材料)移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37℃温箱中培养24h观察结果。(实图6)

细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化

土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。（一）系列稀释平板法 1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

降低NO和培养厌氧菌的几种方法

降低N O3和培养厌氧菌的几种方法（注：相关资料来源于网络，仅供参考。如有冒犯作者之处还望告知并谅解。）养虾可以说是淡水水族养殖里的最高境界之一,如果你能养好虾,养别的水族生物应该都不会遇到太多难题,而且养虾需要对整个水体的生态环境都有了解才能养的好. 养虾第一步就是建立硝化系统,其实大家不管用滤筒,滴流过滤还是上过滤水妖精,有足够的滤材够硝化细菌生殖并且有足够的耐心(通常建立好的硝化系统需要1个月左右)等待硝化细菌繁殖,建立硝化系统应该都不是难题. 难的是硝化系统建立以后,虾子每日吃喝拉撒,硝化细菌分解这些有机物剩下的NO3却很难除掉,NO3在自然界中是厌氧菌来分解的,自然界中的厌氧菌是藏在厚厚的河沙和淤泥的底层,因为与氧气隔绝形成厌氧区,厌氧菌就会在这里大量繁殖,分解NO3释放出氮气和氧气,可是厌氧菌在水族箱中很难培养出来,尤其养虾来说,底土铺太厚时间长了容易败坏.如果NO3堆积过多,常见的结果是母虾踢卵,小虾成活率低等要创造一个绝对的厌氧环境,本人总结下来有几个办法可以实现厌氧菌的培养. 1、每周定期换水,换1/3,可以有效降低NO3,好处是简单,缺点是对于水质比较硬的地区,换水成本太高,需要用RO软水机或者桶装RO水来换. 不换水的方法如下:? 2、买一根50米长的水管,一端接在潜水泵,一端放到虾缸中.让水流经过50米的水管流回虾缸,在这个漫长的过程中,氧气消耗大部分,在水管的后半段就可以培养出厌氧区,厌氧菌就会繁殖,他们就会把NO3分解掉,回到缸子中的水NO3会接近与0.注意问题:如果50米管子过细,时间长了可能会阻塞,管子要用深色的,不能用透明的,因为厌氧菌需要不能见光.入水口管子最好抬高,离水面有5公分以上的距离,以免反硝化作用不彻底产生硫化氢毁掉虾缸（这个方法我没有试过，大家有心的可以试试，曾经有网友发帖说过效果还不错） 3、台湾KU大发明的三串滤筒法：台湾KU大曾经有发明过一个三串滤筒法,原理是前两个滤筒放满培菌滤材,让硝化细菌大量繁殖,因为硝化细菌进行硝化作用需要消耗氧气,水流流经前两个滤筒到第三个滤筒的时候氧气消耗差不多了,在第三个滤筒营造出厌氧区,用来培养厌氧菌。好处是：因为滤筒水流速度较快，流到第三个滤筒时仍然速度不减，不会因为脱氮作用不彻底产生硫化氢不足的地方：第一、滤筒的容积要足够大,这个足够大是一个很虚的概念,这个要和你的缸子的容积大小匹配,比如说我用三个AT-3338带一个一米的缸子.对于一个60的缸子可能三个3338有点大,但是对于一个1米5的缸子可能3338又不够--这里只是举个例子具体大小要在实际应用中总结，二、是取决于滤材,如果有足够的空间没有好的滤材也不行,如果滤材不好培菌效果有限也无法在滤筒里产生足够的硝化细菌,我用的是伊罕的石英球和陶瓷环.但是具体滤材要多少,这个KU大也没有给答案,因为大家具体应用的缸的尺寸和环境各异,没有办法统一三,跟虾口的数量有关,这个应该很好理解,虾越多产生的废物越多,硝化作用下来的NO3也就越多. 四,NO3是厌氧菌-脱氮菌在无氧条件下通过脱氮作用将NO3分解成氮气和氧气,但是如果在绝对无氧的环境下,脱氮菌就会开始以硫化物为食产生硫化氢,硫化氢就会毁掉虾缸,三串滤筒的好处是水流速度快到最后一个滤筒也能带去少量氧气和足够的NO3源,所以不至于产生硫化氢,但是不好的地方是你也不知道他具体会带多少氧气进到第三个滤筒,如果带的太多了第三个滤筒仍然是硝化菌的天下,进行的还是硝化作用.第三个滤筒仍然会成为又一个硝化菌的培菌桶.或者是在第三个滤筒里形成的厌氧区域很小,不足以处理大量的NO3.

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集 1 目的 1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。 3 材料 3.1 培养基淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。 3.2 仪器或其它用具取样铲、塑料袋、记号笔、 1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。 2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。如下示意图。一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。每个点切取的土块宽度、厚度应基本一致。装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。 3．采样方法、数量：1)面积小，地势平坦，肥力均匀的田块，采用对角采样法。2)面积中等，地势平整，有些肥力差异的田块采用棋盘式采样法。3)面积大，地势又不平坦，肥力不匀的田块采用蛇型线采样法。土样由20个样点组成。样点分布范围不少于3亩（各地可根据情况确定）。每个点的取土深度及重量应均匀一致，土样上层和下层的比例也要相同。采样器应垂直于地面，入土至规定的深度。采样使用不锈钢、木、竹或塑料器具。样品处理、储存等过程不要接触金属器具和橡胶制品，以防污染。每个混合样品一般取1kg左右，如果采集样品太多，可用“四分法”弃去多余土壤。 4．样品编号和档案纪录：做好采样记录：土样编号、采样地点及经纬度、土壤名称、采样深度、采样日期、采样人等。

微生物的接种、分离纯化与培养方法

微生物的接种、分离纯化与培养方法实验目的：学习掌握无菌操作技术；学习接种方法；学习常用的分离、纯化菌种的方法。实验内容：一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３）图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45° C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。

实验十二___土壤中产抗生素放线菌的分离纯化

实验十二土壤中产抗生素放线菌的分离纯化实验目的： 1、从土壤中分离产抗生素的放线菌。 2、抗生素产生菌的抗菌谱测定。 3、掌握微生物的基本操作。实验原理：放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖，革兰染色为阳性的单细胞原核微生物，是细菌中的一种特殊类型。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。微生物大量存在与土壤中，其中包括细菌、放线菌和真菌等，采用选择性培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌。实验材料： 1、土壤菜园土。 2、实验菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的8h培养物。 3、培养基淀粉琼脂和淀粉液体培养基。 4、其它 10％的酚、牛津杯、灭菌生理盐水、接种环、无菌涂棒、酒精灯、无菌吸管等。实验方法：一、土壤中放线菌的分离 1、配制淀粉培养基配方一淀粉琼脂培养基（高氏培养基）可溶性淀粉 2克；硝酸钾 0.1克；磷酸氢二钾 0.05克；氯化钠 0.05克；硫酸镁 0.05克；硫酸亚铁 0.001克；琼脂 2克水 100毫升先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。配方二面粉琼脂培养基面粉 60克；琼脂 20克；水 1000毫升把面粉用水调成糊状，加水到500毫升，放在文火上煮30分钟。另取500毫升水，放入琼脂，加热煮沸到溶解后，把两液调匀，补充水分，调整pH值到7.4，分装，灭菌，备用。 2、土壤悬液梯度稀释（1）将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。（2）用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

植物根际土壤中稀有放线菌的选择分离及生物活性-厦门大学学报

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201604056 鹭宁两地植物根际土壤中放线菌的多样性分析及抗菌等生物活性评估王霏1，黎丹1，黄耀坚1，邓贤明1，吴莹莹2* （1.厦门大学生命科学学院天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，福建厦门361005；2. 上海市农业科学院食用菌研究所，上海2 01406）摘要：为探究不同地区植物根际土壤中可培养放线菌的多样性，筛选具有抗菌及抗肿瘤活性的药源菌株，本研究采用改良聚乳酸-明胶和海藻糖-脯氨酸两种培养基，选择分离采自厦门市翔安区香山风景区、南京中山植物园及南京玄武湖公园的17份植物根际土壤样品中的放线菌，并进行16S rRNA基因鉴定、系统发育分析及抗菌、抗肿瘤生物活性测定. 共分离到178株放线菌，其中链霉菌151株，其余27株为稀有放线菌，占总数的15.2%. 稀有放线菌包含9个属：微杆菌属（Microbacterium）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）、韩国生工菌属（Kribbella）、野野村氏菌属（Nonomuraea）、小单孢菌属（Micromonospora）、链孢囊菌属（Streptosporangium）、拟孢囊菌属（Kibdelosporangium）、纤维微菌属（Cellulosimicrobium）和栖白蚁菌属（Isoptericola），包含2株新种. 对分离得到的所有放线菌进行液体小量发酵，并测定其发酵粗提物的抗菌和抗肿瘤活性. 结果显示，所测定的178株放线菌中，有82株对一种或多种指示菌表现出抗菌活性，占供测菌株的46.1%；有60株对一种或多种肿瘤细胞具有抑制作用，占供测菌株的33.7%. 研究结果表明植物根际土壤中放线菌资源丰富，其中抗菌和抗肿瘤活性显著的菌株可为后续微生物药物研发提供有利资源. 关键词：放线菌；选择分离；系统分析；活性测定中图分类号：Q 939 文献标志码：A 放线菌是天然药物的重要来源，目前临床及农业上使用的抗生素中，超过60%是放线菌产生的[1]. 自1944年美国放线菌学家Walksman[2]从灰色链霉菌（Streptomyces griseus）中发现链霉素以来，大量新型抗生素被陆续从放线菌中分离得到，其中大部来自链霉菌，约占自然界来源抗生素总数的45%，另有16% 来自非链霉菌属的放线菌[3]. 随着对链霉菌资源的

细菌分离培养及移植

细菌分离培养及移植在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。 [目的要求] (1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。 (2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。 [实验材料] 菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。 [需氧性细菌分离培养法] 1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：

(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。 (2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。 (3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。 (4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。 (5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。 2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：

厌氧微生物培养技术的目的和原理

厌氧微生物培养技术的目的和原理关键词：焦性没食子酸碳酸氢钠柠檬酸氯化锌亚甲蓝氮气标准气体标准溶液北京标准物质网对简单，可用于那些对厌氧要求相对较低的一般厌氧菌的培养，如碱性焦性没食子酸法、厌氧罐培养法、庖肉培养基法等。本实验将主要介绍这三种，它们都属于最基本也是最常用的厌氧微生物培养技术。其中有些厌氧微生物要求高的培养研究，对实验仪器也有较高的要求，如主要用于严格厌氧菌分离和培养的亨盖特技术、厌氧培养箱(手套箱)法等。厌氧培养箱已逐渐普及，本实验也作简要介绍。 1．碱性焦性没食子酸法焦性没食子酸与碱溶液(NaOH、Na 2CO 3 或NaHCO 3 )作用后形成易被氧化的碱性没食子盐，能通过氧化作用而形成黑、褐色的焦性没食子橙从而除掉密封容器中的氧。这种方法的优点是无需特殊及昂贵的设备，操作简单，适用于任何可密封的容器，可迅速建立厌氧环境，适用于前期实验性探索研究；而其缺点是在氧化过程中会产生少量的一氧化碳，对某些厌氧菌的生长有抑制作用，同时，NaOH 的存在会吸收掉密闭容器中的二氧化碳，对某些厌氧菌的生长不利。用NaHCO 3 。代替NaOH，可部分克服二氧化碳被吸收问题，但却又会导致吸氧速率的降低。当然，大批量厌氧培养需消耗大量实验药品，并产生大量废液，可能引起环境污染。 2．厌氧罐培养法利用一定方法在密闭的厌氧罐中生成一定量的氢气，而经过处理的钯或铂可作为催化剂催化氢与氧化合形成水，从而除掉罐中的氧而造成厌氧环境。由于适量的CO 2 (2％～10％)对大多数的厌氧菌的生长有促进作用，在进行厌氧菌的分离时可提高检Ⅲ率，所以一般在供氢的同时还向罐内供给一定的CO 2。厌氧罐中H 2 及CO 2 的生成可采用钢瓶灌注的外源法，但更方便的是利用各种化学反应在罐中自行生成的内源法，例如，镁与氯化锌遇水后发生反应产生氢气，碳酸氢钠加柠檬酸水后产生CO 2： Mg+ZnCl 2+2H 2 O→MgCl 2 +Zn(OH) 2 +H 2 ↑ C 6H 8 O 7 +3NaHCO 3 →Na 3 (C 6 H 5 O 7 )+3H 2 O+3CO 2 ↑

放线菌的分离与筛选方法

放线菌的分离与筛选方法放线菌介于细菌和丝状真菌的一类丝状原核生物，多为腐生，少数寄生。腐生型在自然界物质循环中起着重要作用。放线菌突出特性产生抗菌素，常以孢子或菌丝状态存在，以土壤最多，常存在肥土农田土中性或偏碱性土壤中。 1.拮抗放线菌的筛选方法： 1.1平板划线法：待测菌株与检测病原菌通用培养基制成平板，在平板中央划线接种待测菌株，28-30℃ 3-5d，将病原菌垂直方向划线于待测菌生长线的两侧，不能与待测菌相连，在37℃ 24h取出观察。如果待测菌株对病原菌有抑制活性，病原菌靠近待测菌的一端生长会受到待测菌抑制产生抑菌带。可根据抑菌带的长短来判断待测菌活性强弱。选择抑制活性强的复筛。 1.2抑菌圈法或十字交叉法：常用的初筛方法将待测菌接种于平板，长出成熟菌落后，用打孔器将供试病原菌苔打成直径5-6mm小菌块，并将其移入到病原菌平板培养基中，将待测菌与病原菌呈十字交叉排列，即病原菌在中央，待测菌置于病原菌的四周，培养3-4d。若有抑菌活性在待测菌周围形成一个没有生长病原菌抑菌圈。若菌块厚度大小一致的，抑菌圈的大小可直观反应待测菌抑菌活性的强弱。 1.3纸片法或生长速率法：主要测定发酵液的抑菌活性，即将相同灭菌后的圆形滤纸片放于待测

发酵液中，取出并黏贴在接种有病原菌的平板培养基，培养后观察有无抑菌圈或抑菌圈的大小。 2.放线菌分离与筛选. 2.1培养基； 2.1.1改良高1号：可溶性淀粉20g/L KH2PO40.5g/L NaC10.5g/L MgSO40.2-0.5g/L KNO3 1g/L FeSO40.01g/L 重铬酸钾（3%） 3.3mL/L PH7.2-7.4（分离保存用）每100ml培养基加入1ml0.1℅的FeSO4溶液。 2.1.2淀粉培养基和秸秆腐解物培养基 2.1.3拮抗试验培养基：高1号牛蛋 PDA改良培养基加3g牛肉膏2.2抑菌剂的选择：有效降低细菌真菌的数量，细菌扩散真菌蔓延速度迅速。重铬酸钾50-75ug/ml(150ug/ml为宜)或另添加1-2ug/ml青霉素，可显著抑制细菌和真菌生长，不影响放线菌的数量和种类。 2.3靶标菌：枯草杆菌大肠杆菌金黄葡萄球菌八联球菌变形杆菌 2.4放线菌分离与筛选 2.4.1传统的分离筛选思路；以对某些如病原菌或杂草，昆虫为靶标的抑制和杀灭效果为标准筛选产生活性物质的放线菌，即筛选拮抗放线菌。初筛：将分离得到菌株进行真对靶标抑制活性筛选。优点：较早知道是否筛选到拮抗菌株，筛选范围广。缺点：方法粗放，

土壤中放线菌的分离

土壤中放线菌的分离纯化和染色实验方案一、实验目的 1.掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程； 2.掌握高氏一号培养基的配制方法； 3.复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方法以及接种技术； 4.学会使用高压蒸汽灭菌锅、培养箱、超净工作台、显微镜等实验仪器设备； 5.培养微生物实验的设计思路和动手能力。二、实验材料 1、实验仪器培养箱、超净工作台、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、分析天平、接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀等其它常规的实验仪器 2、实验耗材擦镜纸、吸水纸、标签纸、无菌称量纸、无菌水、蒸馏水 3、实验药品草酸铵结晶紫、番红、95%酒精、碘液、可溶性淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁、琼脂、重铬酸钾 4、实验材料土壤四、实验步骤 1、土壤取样在实验前，取学校体育馆附近树木下10~20㎝土壤作为土样。 2、培养基的配制高氏一号培养基（分离和培养放线菌）：可溶性淀粉 2.0g 硝酸钾0.1g 磷酸氢二钾0.05g 氯化钠0.05g 硫酸镁0.05g 硫酸亚铁0.001g 琼脂2g 水100ml 先把淀粉放在烧杯里，用5毫升水调成糊状后，倒入95毫升水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。在烧杯外做好记号，加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整pH值到7.2～7.4，分装后灭菌，备用。 3、仪器灭菌将培养基溶液的三角瓶用报纸包扎好以及玻璃珠、试管、三角锥瓶、载玻片、盖玻片放到高压灭菌锅内进行高温蒸汽灭菌。

4、制备土壤稀释液（1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。（2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度） ①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4. ②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，分别将土壤悬液制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10的土壤稀释液。 5、稀释涂布法分离土壤中放线菌（1）倒平板将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。（3）涂布平板用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。（4）倒置平板将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d 6、放线菌的纯化（1）倒平板同上（2）平板划线将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。 7、放线菌的观察玻璃纸法（1）将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。（2）将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。（3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种。（4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。（5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在超净工作台上，打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察。

放线菌选择性分离方法综述_钱恒

放线菌选择性分离方法综述钱恒段淑蓉* （南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，江苏南京211171）摘要：综述了近年来选择性分离放线菌的几种方法，包括样品来源的多样化，物理机械与化学分散剂结合法，稀有碳源的选择，CaCl2富集培养等。关键词：放线菌；分离方法；综述中图分类号Q939.13文献标识码A文章编号1007－7731（2011）15－60－02 Summarization of Selective Isolation Methods for Actionmycetes Qian Heng et al．（Nanjing Xiaozhuang College，School of Biochemical and Environmental Engineering，Nanjing211171，China）Abstract：This article introduces several selective isolation methods for actionmycetes in recent years，including sample source diversification，combining physical mechanical approach and chemical dispersant，rare carbon sources，CaCl 2 en-richment cultivation，etc． Key words：Actinomycetes；Isolation methods；Summarization 放线菌是一类重要的微生物，能产生有用的酶［1－2］和二次代谢产物如抗生素、生物活性分子和抗肿瘤化合物等［3－5］，具有重要的经济价值。发现新的生物活性代谢产物的有效方法是通过分离新的微生物尤其是产生70%的已知生物活性代谢产物的放线菌［6］。近年来，分子生物学方法已经证明，自然界实际存在的绝大部分放线菌仍然难以培养。如何获得这些难培养的未知放线菌是微生物资源利用的重大研究课题，而探索新的分离方法则是解决这一问题的根本途径。本文主要从样品来源的选择、预处理、培养基选择、富集培养等方面介绍几种选择性分离放线菌的方法。 1样品来源的选择绝大多数的放线菌来源于土壤［7］。但近年来，人们将目光投向各种生境放线菌的分离，包括海洋放线菌［8］、极端环境放线菌［9］、内生放线菌［10］、沙漠土壤［11］等。分离放线菌新生态系统调查对于发现新的放线菌以及最终发现自然产物的药物是至关重要的。近期，多项研究报道了作为生物活性化合物丰富来源的新的放线菌不同生境的调查［12］。新的生态环境样品将大大提高新的放线菌的分离几率。 2土样预处理预处理的主要目的在于减少真菌、细菌等非目的菌的数量，增加目的放线菌的数量［3］，活化放线菌的休眠孢子以及杀灭非目的菌。江翠翠［13］等研究了不同物理机械与化学分散剂结合及加热与化学物质预处理土样对放线菌分离效果的影响，以期提高放线菌检出率。采用涂布平板稀释法进行放线菌的分离，为达到更好的分散效果，物理机械（玻璃珠振荡机）分散常与化学分散相结合，促进微生物与土粒的分离。结果表明，使用一种分散剂处理土壤悬液后，土壤分散效果均优于纯蒸馏水。胆酸钠的分散效果最好，焦磷酸钠次之。胆酸钠处理的土样，分离得到的放线菌菌落数约是生理盐水和纯水的1.4倍和1.8倍多。这可能是因为胆酸钠对土壤腐殖质具有较强的结合能力，有利于破坏土壤团聚结构所致。使用分散剂时，同时加入洗涤剂Na+离子交换树脂和螯合剂PEG处理土壤悬液后，土壤分散效果均较未加入任何洗涤剂和螯合剂的好。胆酸钠、Na+离子交换树脂和PEG的分散效果最好，分别比仅加入胆酸钠处理的放线菌菌落数高11.2%和8.9%［13］。范丽霞［14］等对最有利于土壤放线菌分离的自然风干时间展开了研究。研究结果表明：土样放置7d和21d均适合放线菌的分离，放置7d的放线菌菌落较多，种类也较齐全，而细菌和真菌数量下降较快。而放置21d的土样培养皿内的细菌和真菌都非常少，几乎全是放线菌单菌落，且放线菌种类下降不明显，非常适合放线菌分离。放置7d的放线菌的种类更多更全，而放置21d的放线菌单菌落更突出。 3培养基的选择 06安徽农学通报，Anhui Agri.Sci.Bull.2011，17（15）DOI:10.16377/https://www.360docs.net/doc/2015007944.html,ki.issn1007-7731.2011.15.003 作者简介：钱恒（1989－），男，专业方向：微生物学。*通讯作者收稿日期：2011－07－07

放线菌抗生素的发酵及其目的产物的提取实验报告

放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取一、实验目的 1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法 2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法 3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论 4、了解小型发酵罐的基本结构 5、熟悉掌握小型发酵罐的使用方法和保养 6.掌握抗生素生物效价测定的原理和方法； 7. 掌握管碟法测定抗生素生物效价相关的操作方法。 8.掌握放线菌次级代谢物的初步纯化及牛津杯实验的基本原理和操作技术二、实验原理 ①发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约lL至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，5L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。 ②抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现

临床常用的抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 ③放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合的次级代谢物，并采用加热发酵液70 ℃，2 min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去除蛋白。抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法。管碟法是目前抗生素效价测定的国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.l mm，外径8.0±0.l mm，高10±0. lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散中心浓度高而边缘浓度低。因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律的推导，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。常用的管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典。二剂量法系将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比