分子生物学 题库汇总

名词解释：

1.基因(gene)：是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和某些小分子RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的的遗传单位。

2.基因组(genome)：泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。

3、端粒:以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。

4、操纵子:是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。

5、顺式作用元件:是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。

6、反式作用因子:是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。在反式作用因子中，可直接或间接结合RNA聚合酶的，称为转录因子。

转录调节因子结构

DNA结合域

酸性活域

脯氨酸富含域 TF 转录激活域

谷氨酰胺富含域

蛋白质-蛋白质结合域

（二聚化结构域）

7、启动子:是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。

8、增强子:位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。

9、基因表达:是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。

10、信息分子:调节细胞生命活动的化学物质。其中由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质称为细胞间信息分子；而在细胞内传递信息调控信号的化学物质称为细胞内信息分子。

11、受体:是存在于靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的的特殊蛋白质。

12、分子克隆:在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和

繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。

13、蛋白激酶:是指能够将磷酸集团从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。

14、蛋白磷酸酶:是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同

构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。

15、基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。

16、载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。

17、转化:指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。

18、感染:以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌

体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。

19、转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。

20、转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。

21、DNA变性:在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。

22、DNA复性:当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。

23、退火:指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。

24、筑巢PCR:先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为摸板扩增获取目的基因。可以提高PCR的效率和特异性。

25、原位PCR:以组织固定处理细胞内的DNA或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。

26、定量PCR:基因表达涉及的转录水平的研究常需要对mRNA进行定量测定，对此采用的PCR技术就叫定量PCR。

27、基因打靶:是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。

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28、DNA芯片:DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。

29、错义突变:DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。

30、无义突变:由于碱基对的取代，使原来可以翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子的突变。

31、同义突变:碱基对的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，有时虽然有碱基被取代，但在蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代，这是因为突变后的密码子和原来的密码子代表同一个氨基酸的突变。

32、移码突变:在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的蛋白质的突变。

33、癌基因:是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可使细胞无限制增殖，导致肿瘤的发生。包括病毒癌基因和细胞癌基因。

34、细胞癌基因:存在于正常的细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。

35、病毒癌基因:存在于病毒（大多是逆转录病毒）基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。它不编码病毒结构成分，对病毒无复制作用，但是当受到外界的条件激活时可产生诱导肿瘤发生的作用。

36、基因诊断:以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。

37、RFLP:即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。

38、基因治疗:一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。

39、反义RNA:碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA称为反义RNA。可以作为一种调控特定基因表达的手段。

40、核酶:是一种可以催化RNA切割和RNA剪接反应的由RNA组成的酶，可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。

41、三链DNA:当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区可结合形成三链，能特异地结合在DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键。

42、SSCP:单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。

43、管家基因:在生物体生命的全过程都是必须的，且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。

44、基因表达就是基因的转录及翻译，也包括RNA基因的转录。

基因表达的规律性包含时间特异性和空间特异性。

基因表达的方式有组成性表达及可诱导或可阻遏表达。

诱导和阻遏表达：可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。

如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。

基因表达的调控（control of gene expression）是指对基因组中某一个基因或一些功能相近的基因表达的开启、关闭和表达强度的直接调节。它是生物在进化过程中逐渐形成的精确而灵敏的生存和应变能力。

原核生物基因表达转录激活调控通常通过操纵子模式实现，并且以负性调节为主。

而真核生物基因表达调控则更复杂，多是通过反式作用因子（转录调节因子）与顺式反应元件（启动子、增强子、沉默子）的相互作用而实现的，大多数是正性调节。

45、SD序列:转录出的mRNA要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌呤的核苷酸序列与大肠杆菌16S rRNA3，末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。

46、反义核酸技术:是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。

47、核酸探针:探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段DNA或RNA分子。

48、周期蛋白:是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，它与周期素依赖性激酶共同影响细胞周期的运行。

49、CAP:是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。

50、顺反子（cistron）在反式构型中不能互补的各突变型所占有的那部分DNA片断（见互补测验）。

51、结构域是指超二级结构在空间上进一步聚集形成的紧密稳定的在蛋白质分子上明显可分的类似球状的结构。

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52、分子生物学（molecular biology）是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的学科。

53、医学分子生物学从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。

53、抑癌基因是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。

54、基因文库（gene library，gene bank）利用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入到宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。

55、cDNA文库将cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为cDNA文库。

56、表达载体（expressing vector）是用来在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件——转录和翻译所必需的DNA序列。

真核细胞——病毒做载体；原核细胞——质粒、噬菌体做载体

57、重组DNA技术采用载体基因与某目的基因在体外重组的方法克隆DNA的技术，称为重组DNA技术。过程包括：目的基因的获取、基因载体的选择与构建、目的基因与载体的拼接、重组DNA分子导入受体细胞、筛选并无性繁殖含重组体分子的受体细胞以及阳性克隆的表达。

58.C值佯谬：这种生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值佯谬（ C value paradox ）；

59.基因家族(genefamily)概念:指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定同源性的一些基因。

60..基因组学(genomics)：发展和应用基因作图、 DNA测序、基因定位等新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。

61.分子伴侣：是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。

62..信号肽：各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。

63..细胞凋亡（apoptosis)(有树叶凋零之意)或程序化细胞死亡（programmed cell death , PCD)

是指多细胞有机体在正常生理或病理情况下，发生的一种由多基因控制的主动死亡过程。

64..凋亡小体:指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。

65.DNA片段化（主）:凋亡细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带图谱

66.死亡受体(death receptors,DR)：指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子，并将信号传递至胞内引起细胞凋亡

的受体

67.“死亡结构域”概念：是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导细胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。

68.周期蛋白框:各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。

69.检验点:意指当DNA受到损伤时,复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。

70.蛋白质组的含义：一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质

蛋白质组学就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域

71.酵母双杂交系统:是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。

72.报道株:经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。

73.克隆(clone):来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。

74.克隆化(cloning):获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖

75.DNA克隆:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又称基因克隆(gene cloning)或分子克隆(molecular cloing)。

76..载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞, 并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。

77.质粒:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。

78.限制性核酸内切酶:由细菌自己产生的一种能识别和切割DNA内部特定序列的一类核酸酶

79.基因组文库(genomic library，G文库):用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合, 所有重组子

所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。

80.cDNA文库(cDNA library，C文库):用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。

81.定向克隆:将外源DNA片段定向插入到载体中的方法

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82.TA克隆定义:利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在70～75℃活性高)，使PCR产物的3′末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3′粘性末端含一个T的线性克隆载体中.

83.宿主细胞：被导入重组分子的细胞

84.转化:质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌的过程

85.感受态细胞:用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，

86.转导:通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。

87.核酸分子杂交:用一已知的DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。

88.探针:用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段

89.Southern印迹杂交:是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA 片段的一种技术。

90.Northern印迹杂交:将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA

或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。

91.核酸原位杂交:以特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法, 又称原位杂交组织化学或杂交组织化学。

.反转录PCR ( RT-PCR):是将RNA的反转录反应和PCR 反应联合应用的一种技术

92.表位标签:亦称附加表位由短肽序列组成的能显示抗体存在的一个表位，广泛用于分子生物学中附加到转基因蛋白中，翻译产物为融合蛋白，通过免疫组化或Western印迹杂交跟踪其表达，不会增加抗体对特异蛋白的反应。

93.:基因芯片技术:用已知序列的探针与样品cDNAs杂交，杂交信号阳性的探针序列即为细胞中表达的DNA序列

94.消减杂交法:将实验组mRNA(或cDNA)与对照组cDNA(或mRNA）杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成分（cDNA或mRNA），得到的为实验组独有的mRNA或cDNA，这些基因即是差异表达基因。

95.基因治疗:用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法称基因治疗

96.基因疗法:治疗过程中应用的目的基因就像平常临床上使用的药物一样，为了与传统意义上的基因治疗相区别，通常称之为基因疗法。

97.VNTR多态性:不同个体间重复单元[如(CA)n/(TG)n]的拷贝数(即出现的频率)不同，因而产生多态性，称为VNTR多态性。

98.生物芯片：在可识别的有序点阵集合上，试样与每个点阵发生分子间反应或杂交后，通过扫描检测同时获得各个点阵上的作用信息。

分子生物学大题

一、基因与基因组

1.鉴别蛋白质编码基因的五项标准:(1).开放阅读框（open reading frame, ORF）:是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。;(2).

序列特征——密码子偏爱和剪接点;(3). 序列保守性;(4). 转录产物:寻找基因的表达产物——RNA或蛋白质.;(5). 基因失活。

2.真核生物基因组特点:（一）分子量很大的DNA与蛋白质形成染色体存在于核内。（二）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子结构。（三）基因组存在高比例的非编码序列 (non coding sequence, NCS), NCS可作进化标尺。（四）大量重复序列（repeat sequence）存在。（五）基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔(这种现象称为断裂基因（split gene）. 断裂基因由内含子（intron）（非编码序列）和外显子（exon）（编码序列）交替组成。（六）功能相关基因构成各种基因家族

3.重复顺序的功能：1）编码某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等; 2）与染色体构象、着丝粒形成有关; 3）参与基因的表达调控. 分类：1）倒位（转）重复顺序：指两互补顺序呈反向排列，形成回文结构或发夹状结构；2）串连重复顺序：由相同的核心顺序（2~70bp）成串（头尾相接）排列而成的高度重复顺序。3）散在重复顺序。

4.人类基因定位的基本方法:(1).家系分析法——发现感兴趣的基因。通过分析统计家系中有关遗传性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。;(2).体细胞杂交——初步的基因定位;(3). 核酸杂交技术——精确的基因定位。克隆基因定位法；原位杂交法；原位PCR；定位克隆技术。

5.基因论：1)相引是两个基因位于同一染色体上，相斥则反之；2)同源染色体在减数分裂时发生交换；3)位置相近的因子相互连锁。

6.HGP的主要成果——四张图：

1）遗传图:第一代遗传标记是RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性酶切片段多态性）;第二代遗传标记是STR（short

tandem repeat，简短串连重复序列），6000个标记;第三代遗传标记是SNP（restriction fragment length polymorphism，单核苷酸多态性），不再是分析长度，而是直接测序

2）物理图:以一段已知序列的DNA片段（STS，sequence tagged site，序列标记位点）并有染色体定位为路标，以Mb 或Kb为图距的基因组图。

3）转录图又称表达序列图或cDNA图的路标:是以部分5 '端或3'端cDNA序列（即表达序列标签，EST）为路标，根据表达顺序的位置和4

距离作图

4）序列图：测定总长约30亿个核苷酸组成的全染色体序列。

7.五大模式生物：E.coli、酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽线虫和小鼠，其序列分析被列为HGP的内容；

8.DNA多态性及其意义：DNA多态性:除同卵双生的两个体外，没有两个人的DNA组成是完全相同的，即人类DNA组成具有多态性。如果比较随机的十个人的常染色体的非编码区,就会发现约200~400bp就有一个核苷酸不同,这些可变区域即称为DNA多态性 (DNA polymorphism)位点。 DNA多态性标记的价值：1）为路标，构建DNA标记的遗传连锁图谱;2）

使遗传图谱从直接可见的表型多样性标记进步到DNA分子本身多态性标记。 DNA多态性的种类：1）DNA 位点的多态性；2）串连重复顺序多态性；3）单核苷酸多态性

2.细胞凋亡的生物学意义：1）具有清除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用；2）具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用。细胞凋亡是维持个体生存所必需的一种生物学机制。

3.Caspase的性质和种类：Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。1）已在哺乳类中发现14种，分为3个亚类：Caspase-1亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族；2）根据前体分子(procaspase)N端的原结构域(prodomain)分为2类:启始分子(initiator), 如-8、-9、-10等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下游Caspase；效应分子(effector),如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。

4.效应caspase引起细胞凋亡的机制：1）灭活细胞内凋亡抑制蛋白：非凋亡细胞中, CDA (caspase活化的DNAase)与其抑制蛋白(ICDA)结合;凋亡细胞中, caspase剪切ICDA; CDA游离并进入核内降解DNA,细胞凋亡.2）剪切细胞结构蛋白：如Caspase对核板的降解作用; 在凋亡过程中, caspase在单一位点剪切核纤层蛋白(lamin), 导致核板塌陷, 染色质浓缩.3）剪切效应蛋白: 如参与基因表达蛋白因子,如PARP；4）活化caspase抑制剂。

5.细胞凋亡的信号传递通路的特点:(1).同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。(2).多样性：环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。(3).分类：百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成一条条的信息传导通路，可分为基本传导通路和非专一性传导通路二类。

6.细胞凋亡的信号传递途径:(1)死亡受体介导的细胞凋亡;(2)线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径：线粒体跨膜电位(Δψm)的下降，线粒体膜通透性转运孔（MPT）破坏或开放，开放的后果是，Δψm 下降、氧化磷化脱偶联、GSH耗竭、ROS 产生等，并形成恶习性循环。;(3)细胞核凋亡诱导途径;(4)粒酶B介导的细胞凋亡：CrB由CTL分泌进入靶细胞胞浆后,其丝氨酸蛋白酶在胞浆pH

7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一。

7.P53蛋白的调控作用：自N端起包括：转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区；

1）P53的表达与活性调节。正常状态下：胞浆P53水平很低，半衰期很短；胞内P53被严格监控，受HDM2的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。异常情况下：当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时； P53水平迅速升高和活化；

2）P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用：野生型P53蛋白具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用； P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。

突变型P53蛋白：丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。

8.Bcl-2家族的功能:(1)属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响.(2)阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。(3)Bcl-2蛋白具抗氧化作

用;(4)Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+ 离子向胞质释放，而凋亡必须有Ca2+ 离子参与。

9.bcl-2家族成员：1）抑制凋亡：bcl-2，bcl-xL，Mcl-1 。2）促进凋亡：bax，bcl-xs ，bad。

10. Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制:(1)Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统;(2)当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；(3).随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了‘Bax/Bax'诱导凋亡的作用。即Bax和Bcl-2 比值调节凋亡；(4) 当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2 ，使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。

11.原位末端标记技术(in situ end –lableing, ISEL)：原理: ISEL的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）或DNA聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（biotin-16-dUTP）掺入到断裂的DNA的3'端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经DAB显色后，便可观察到细胞内是否存在DNA片段端存在。主要方法有2种: 1）. TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)； 2）. DNA聚合酶I 或klenow大片段介导的原位的缺口平移(ISNT)。该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.

12.与细胞凋亡减少有关的疾病：1）.癌症；2）.自身免疫性疾病，红斑浓疮，免疫介导的肾小管肾炎。3）.病毒感染

与细胞凋亡增加有关的疾病：1）.AIDS；2）. 神经退行性病变，帕金森病，老年痴呆；3）再生性障碍贫血；4）.缺血性损伤，心肌梗塞，脑卒中，再灌注损伤；5）.酒精肝

13.细胞凋亡自身免疫性疾病：正常情况下：1） 90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生免疫应答；2）如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋巴细胞被激活，产生5

大量的效应细胞攻击靶细胞，导致发生自身免疫性疾病。

发病的分子机制：1）淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表面受体Fas（又称APO或CD95）， Fas受体与FasL （配体）结合即可激活凋亡信号传导途径，细胞凋亡；2） T细胞表面受体Fas和FasL发生突变时，T细胞不能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。3）除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性改变（Fas和FasL突变）有关。

14.细胞凋亡病毒性疾病：病毒的溶解性感染所产生的细胞病变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感染与病毒抑制细胞凋亡有关。1）病毒感染引发细胞凋亡：牛疱疹病毒、鸡白血病毒和HIV等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞缺失。如HIV感染后引起CD4+T细胞凋亡而缺失。2）病毒感染抑制细胞凋亡：许多病毒具有抑制细胞凋亡的机制，有利于建立持续感染、延长病毒复制时间、以最大限度产生子代病毒。如EB病毒产生LMP-1，使Bcl-2基因上调；牛痘病毒产生crmA,可抑制由caspase所介导的细胞凋亡。

15.细胞凋亡与肿瘤：肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾病，同时也是细胞凋亡异常疾病。1）大多数肿瘤P53突变、而有些肿瘤过度表达Bcl-2蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。2）P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。3）Bcl-2属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。

三、细胞周期调控：

1.细胞周期：1）间期：G1期 (合成前期)； S期 (DNA合成期)； G2期 (合成后期)。 2）分裂期：前期；中期；后期；末期。

2.细胞周期调控的主要分子机制：细胞周期引擎——异二聚体蛋白激酶复合体，包括二个亚单位：1）调节亚单位：细胞周期蛋白，其浓度随细胞周期不断变化，不仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化；2）催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 (CDK)，单独存在时无活性，与cyclin结合才具有蛋白激酶的活性。

参与细胞周期调控的分子：1）异二聚体蛋白激酶复合体；2）生长因子；3）泛素与APC：泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。4）周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）3.细胞周期的运行：1）细胞周期的启动（G0→G1）；2)DNA复制（ G0→S ）；3）进入M期 (G2-M)；

1）细胞周期的启动：细胞在生长因子的刺激下，Cyclin D表达，与CDK4、CDK6结合而活化激酶?下游蛋白质磷酸化?促进基因的转录

2）DNA复制：CyclinE与CDK2结合-?S-CDK触发前复制复合体（pre-RC）启动，同时阻止DNA再次进行复制.

3）进入M期 (G2-M)：CyclinA、CyclinB与CDK1结合，形成 M-CDK?CDK-Cyclin能够积累?CDK1使底物蛋白磷酸化?细胞分裂.

4.检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检验点有4个：1) G1/S检验点: 在哺乳动物中称R点(restriction

point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA损伤？细胞外环境适宜？细胞体积足够大？

2) S期检验点：DNA复制是否完成？3) G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA损伤？细胞体积足够大？4)中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。

四、蛋白质分离纯化

1.蛋白质的含量测定方法：

1）紫外光谱 (A280)吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280 nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所

以测定蛋白质溶液280

nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。注意事项：石英比色杯；调零所用溶液；配制标准蛋白所用溶液；光密度范围。

2）Bradford检测法：考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光吸收值大小计算蛋白的含量。缺点：对各种纯化蛋白质反应不同；这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性。注意事项：标准曲线在2.5 ug～15 ug BSA浓度范围内保持线性关系；反应10～15 min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀；若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确。

3）Lowry检测法：在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745 ～750 nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。缺点：干扰物质多；反应速度慢；某些试剂不稳定；使蛋白质发生不可逆变性。注意事项：在加入试剂30 min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱；许多干扰物质降低颜色反应；高盐浓度可引起沉淀。

4）BCA (二喹啉甲酸)检测法：改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。原理：在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。注意事项：与Lowry相比，采用BCA法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值；为促进BCA法的反应进程，可将样品适当加热。

2. 经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：

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(1). 清洗组织或细胞;(2). 裂解细胞;(3). 离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质;(4). 离心、层析、电泳等进一步纯化;(5). 获取产物蛋白。

3. 包涵体的成份：包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主细胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和质粒编码蛋白以及LPS。

4. 包涵体的形成原因：表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度聚集在一起形成的不溶物。

5.影响包含体形成的因素：除分子伴侣和折叠酶外；还与蛋白质本身的性质（形成转角的残基数目及平均带电性等）和生长条件（宿主、培养温度、培养基和pH等）有关。

6.防止包涵体形成：降低细胞生长温度；共表达分子伴侣；改变渗透压；融合蛋白

7.包含体中蛋白质的提取：用变性剂使之成为可溶性的伸展的肽链，然后再在适当的条件下复性折叠成天然的、有活性的蛋白质分子。

8.分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤：破碎细胞-?分离包涵体-?溶解包涵体（用6～8mol/L或 9～10mol/L尿素或pH2.0 ～4.5酸性溶液）-?蛋白质产物的构型复原

9.影响电泳迁移率的主要因素：(1)带电颗粒的性质：即净电荷数量、颗粒大小及形状;(2)电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度，或电势梯度;(3)溶液的pH值：决定带电颗粒的解离程度，亦即决定所带净电荷的多少;(4)溶液的离子强度：影响电动电位，缓冲液离子强度越高，电动电位越小，泳动速度慢;(5)电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动.(6)支持介质的选择：(7)其它因素：10.不连续系统原理概要:(1)．在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液.(2)．所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分及pH不一样。(3)．在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

11.以下为四个不连续性：(1)凝胶层的不连续性：浓缩胶 (stacking gel)；分离胶 (separating gel

(2)缓冲液离子成分的不连续性：快离子(前导离子, leading ion)；慢离子(尾随离子, trailing ion)；缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,the

buffer counter ion); (3)电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。(4)pH的不连续性：

浓缩胶pH：6.7：分离胶pH：8.9；缓冲液pH：8.3。在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。

12.SDS-PAGE： SDS作用：

1）SDS与蛋白牢固结合，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异；2）SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与菌、酵母等的破碎。

2）SDS物理法： A. 超声法：在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用。注意: 超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大。 B.反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质。 C.冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。 D. 低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解

3）SDS化学法：A.有机溶剂法：有些有机溶剂(如苯、甲苯等)可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来。 B.表面活性剂：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等。 C.酶解法：必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶

15.分离方法：1）利用溶解度的差异分离：A.盐析法。 B.有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。 C.温度。 2）根据分子量的不同分离：.A.透析和超滤； B.平衡离心法； C.凝胶过滤。 3）根据电荷的不同分离：A.电泳； B.离子交换层析。

4）亲和层析。

16.分配定律：1）假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂；2）A 物质在两相中相互扩散；3）A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数K=CAS/ CAM。

17.塔板理论的要点：1）分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的；2）没有吸附和电渗作用. 通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好；3）由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备，不致污染样品。18塔板制备：1）原料：丙烯酰胺(Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(Bis)；2）催化剂：引发剂（过硫酸铵, (NH4)2S2O8），加速剂（四甲基乙二胺,

TEMED；3）化学聚合和光聚合两种；4）凝胶浓度和交联度；5）不连续系统制备。

19踏板可能出现的问题及解决措施：1）条带过淡：上样量不足；染色操作错误；2）条带丢失：电泳时间过长，小条带已跑出胶；胶浓度不正确。3）多余条带：还原剂过量。4）条带模糊：被降解; 药品不纯。5）条带位置错误：被降解；上样量过大；电泳条件不正确；上样前加热不够；还原剂失效。6）条带不整齐：孔径不均一；胶聚合太快，不均一；可能有气泡；样品离子强度过大。7）条带扩散：电压过低，电泳时间过长；缓冲液离子强度太低；样品本身结构不均一。8）条带弯曲：电泳过程产热过多；染色、固定时间短。9）拖尾：样品溶解不7

充分；胶板不干净。

20.蛋白质的浓缩：1）超滤法；2）冷冻干燥法；3）吸收法：聚乙二醇 (PEG)、蔗糖、凝胶等； 4）沉淀法。

五、酵母细胞双杂交

1.研究蛋白质相互作用的常用方法：1）酵母双杂交；2）亲和层析；3）免疫共沉淀；4）蛋白质交联；5）基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法；6）噬菌体显示系统筛选。

2.酵母双杂交系统的基本原理：转录激活因子上有DNA结合结构域(BD)与转录激活结构域(AD);单独的BD虽然能和启动子结合,但不能激活转录;单独的AD也不能激活转录;与调控目的基因有关的两个蛋白质X蛋白与Y蛋白,将X蛋白的编码基因与BD结构域基因融合(表达所得的融合蛋白为”诱饵”蛋白), ,Y蛋白的编码基因与AD结构域基因融合(表达所得的融合蛋白称为”猎物”蛋白);如果X蛋白与Y蛋白之间存在相互作用,那么分别位于这两个融合蛋白(”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白)上的BD和AD就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因(报告基因)的转录与表达. 通过对报告基因表达产物的检测,反过来可断别作为”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白的两个蛋白质之间是否存在相互作用.

3.以酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: (1)．易于转化、便于回收扩增质粒;(2)．具有可直接进行

选择的标记基因和特征性报告基因;(3)．酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合

4.改造后的酵母细胞的特点：(1)．基因组中GAL4基因是缺失型的;(2)．基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS;

(3)通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。

5.酵母双杂交系统的基本策略：1）表达“诱饵”和“猎物”蛋白；2）检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。

6.酵母双杂交系统的优点：(1)．高敏感性；(2)．真实性；(3) 简洁性；（4）广泛性。

(1)．高敏感性。原因：①采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；②激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；③通过mRNA使信号放大；④检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。

(2)真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。

(3)简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。

(4)广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。p

7.酵母双杂交系统的应用现状：(1)分析已知蛋白之间的相互作用;(2)对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。(3) 用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。(4) 分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。

(5) 绘制蛋白质相互作用系统图谱;(6) 在药物设计中的应用。

8.酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施：1）假阳性较多；2）转化效率偏低；3）阴性干扰。

1）假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。原因：①BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。②如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。③AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；④AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。排除假阳性的措施：①作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。②采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。

③报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。④优化3-AT(3-aminotriazole)浓度。适当增加浓度可减少假阳性。

2）转化效率偏低：办法：引进酵母接合型

3）阴性干扰：两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。原因：（1）融合蛋白的表达对细胞有毒性时，应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体；（2）蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。（3）蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。

9.酵母双杂交系统局限性：(1)某些诱饵蛋白具有自身激活性质。双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域;(2)某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。(3)双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。(4)有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，了融合蛋白的正确折叠。(5) 哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗体进行共定位研究. 双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。

10.Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，结构域中的DNA-BD位于N-末端，能识别位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C- 8

末端。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位点的报告基因LacZ的酵母菌株后，通过SNFl与SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD 与Gal4的AD靠近, 形成复合物，激活报告基因LacZ的转录。

11.酵母单杂交系统：原理：利用靶DNA序列，捕获具有与该元件特异结合的结构域的蛋白质。即靶DNA序列特异的结

合蛋白(BDPX)与Gal4

P的激活结构域可融合形成融合体，BDPX与其特异DNA结合位点之间通过相互作用激活报告基因的表达。应用：研究DNA-蛋白质相互作用。①确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用。②分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因。③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结

合的核苷酸序列。

12.反向酵母双杂交系统：该系统是一项鉴定阻断蛋白间相互作用的技术，核心在于构建一种反向筛选的报告基因。在

这系统中，野生型BD-X/AD-Y间的相互作用激活一种毒性标志作为报告基因，对酵母宿主是毒性或致死性的，即所谓的阴性筛选。在此情况下BD-X/AD-Y作用的解离赋予酵母一种选择生长优势。利用这种方法能方便地鉴定作用缺陷等位基因、解离肽或相关的小分子物质。应用：1）用于筛选缺陷等位基因的研究：在稳定、全长及能够形成正确蛋白质折叠的条件下，已有了几种遗传学策略来筛选作用缺陷性等位基因；2）在反式作用解离分子方面的应用；3）在蛋白质组研究方面的应用：利用反向双杂交系统对文库进行预清除，则可能大大减轻以后的假阳性鉴定工作。反向双杂交系统作为正向双杂交系统的补充，提出了创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想。

13.酵母三杂交系统：基本原理：构建3个杂交体：1） BD与一个位点特异的RNA结合蛋白融合，可结合到报告基因上；2） RNA(Y)，含有“诱饵”顺序，且可结合到BD融合的蛋白质上；3）与AD融合的X蛋白。若X蛋白能与RNA结合，

则AD靠近报告基因，使其激活。种类：两个融合蛋白的相互作用必须借助于第三种分子，而这第三种分子可以是

蛋白质、小分子多肽和核酸，因而产生了：1）蛋白质三杂交系统；2）激酶三杂交系统；3）小配体三杂交系统；4）RNA 三杂交系统。

六、DNA重组\杂交

1. DNA重组技术基本程序：外源DNA的获取-----克隆载体的选择与构建----目的基因与载体的连接---- DNA导入受体菌----重组体的筛选----克隆基因的表达

2.DNA重组的基本步骤：分、切、接、转、筛。

3.作为基因工程载体所需具备的基本条件：(1)有自身的复制子，能借助自身的复制和调控对携带的目的基因进行复制

和增殖。(2)有多克隆位点(多种酶单一位点)，易于外源DNA分子与载体及重组。(3)有多个利于选择和筛选的遗传表型或标志，包括抗药性、营养缺陷型、噬菌斑形成及显色反应。(4)表达型载体还应有强启动子、前导序列、增强子等调

控元件。

4.载体的分类：（一）按功能分类：1）克隆型载体； 2）表达型载体。（二）按受体细胞分类：1）原核细胞载体：原核克隆型载体，原核表达型载体； 2）真核细胞载体（穿梭载体）：真核表达型载体，真核转递型载体。（三）按载体来源分类：质粒载体，噬菌体载体，病毒载体，酵母人工染色体，粘性载体。

5.质粒载体具备的特点：1）分子相对较小，具有较高的拷贝数； 2）含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，非使质粒的拷贝数增加；3）具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。

6.抗药基因或营养代谢基因：1）氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β-内酰胺酶，水解amp β-内酰胺环使amp失效；2）四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将tet从细胞移出； 3）大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落为蓝色。

7.l噬菌体作为载体具有两个特点：① l噬菌体生长繁殖所必需的序列位于其左右二臂上，噬菌体基因组中央含有30%

的DNA是l噬菌体生长所非必需的。② l噬菌体的成熟需要包装，当与外源DNA重组后的大小介于原来的75%～105%之间时，重组的DNA分子才可包装为成熟的噬菌体颗粒。

8.酵母人工染色体载体(YAC)：1）酵母基因：着丝粒，端粒，自主复制顺序； 2）质粒pBR322衍生物：复制起点(ori)，Ampr基因。用途：构建真核生物基因组DNA文库

9.酶切反应体系的建立：1）标准的酶切体系：1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推荐的Buffer和温度，反应1h； 2）酶切体系组成：内切酶根据实验目的选择，保存，使用，稀释（避免失活与污染）； DNA底物纯度，含量；反应buffer 严格按产品说明书高、中、低盐； 3）酶切温度与时间：一般为37℃, 1h； 4）酶切反应过程：容积：20μl，50μl, 酶容积≤10%, 即甘油≤ 5%；注意混匀；反应终止：三种方法 :①10mM EDTA或0.1%SDS; ②65℃，20min; ③酚/氯仿抽提，乙醇沉淀；酶切鉴定：琼脂糖凝胶电泳

10.Klenow片段：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段，缺5′→ 3′外切酶活性。用途：1）随机引物标记法标记探针---主要用途；2）双脱氧末端终止法进行DNA测序；3）cDNA第二链的合成；4）DNA 3′突出末端进行末端标记

11.DNA连接酶(DNA ligase)——基因工程的缝纫针：催化双链DNA相邻碱基5′P和3′-OH间磷酸二酯键形成的酶。主要功能与用途：①催化两个独立DNA片段(粘性末端和平末端) 5′P和3′-OH之间形成磷酸二酯键。催化平末端连接要比粘性末端效率低得多。②修复双链DNA分子中单链缺口。

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12.末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)：功能：催化多个脱氧核苷酸依次加到单链或双链DNA分子的3′-OH末端。用途：1）主要作用是在载体或目的基因 3′末端加上同源多聚尾巴，形成人工粘性末端，便于DNA重组。 2）DNA 3′末端的同位素标记。

13.碱性磷酸酶功能：催化DNA，RNA以及核糖和脱氧核糖三磷酸上的 5′磷酸基团水解。用途：1. 在连接反应中去除载体DNA片段5′-P，防止载体自我连接. 2. 用32P标记5′末端时，用此酶去除5′-P，再用激酶进行5′的 32P 标记.

14.基因组文库的构建和筛选：1）基因组文库(G文库)用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合, 所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列； 2）G文库构建方法：鸟枪法； 3）分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术。

15.cDNA文库的构建和筛选：1）cDNA文库(C文库)用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。2）C文库构建方法：反转录法合成的cDNA 与合适的载体重组并导入宿主细胞而形成。3）分离、筛选基因方法：分子杂交及探针技术。

16.化学合成法制备基因片段：1）使用DNA合成仪。2）适用于氨基酸残基数目较少的蛋白基因。3）缺点：只能合成较小片段的DNA；目的基因DNA序列需通过氨基酸序列推测，难于保证与天然基因序列一致，导致表达效率大大降低。

17.PCR产物的克隆策略：1）限制性内切酶酶切位点添加法； 2）T/A克隆法

18.外源DNA片段和载体的连接：1）粘性末端连接法：适用于插入片段和载体具有相同的粘性末端。缺陷：高背景(自身环化)；双向(正、反)插入；多拷贝插入。 2）平头末端连接法：适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。3）人工接头法：用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。4）同聚物接尾法：适用于在质粒和目的基因上没有相同的酶切位点。

19.转化原理及转化、转染程序：

对数生长期的细菌―――感受态细菌(4℃保存24h) 37℃，倒置培养

重组质粒DNA+细菌热休克蛋（42度，90秒）普通培养基温育涂布于含抗生素的培养基平板单菌落

20. Southern印迹杂交是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA 片段的一种技术。程序：限制性内切酶消化DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段→转印到NC膜或尼龙膜→碱变性、中和→预杂交、杂交→放射性自显影. 其基本原理---毛细管转移

21.Northern印迹杂交程序: 将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。

22.Northern与Southern印迹杂交异同点：

相同点：基本原理; 不同点：(变性方法) Northern印迹杂交：聚乙二醛、二甲亚砜、甲醛、甲基氢氧化汞; Southern 印迹杂交：碱变性

23.核酸分子杂交的基本原理: 用一已知的DNA或RNA片段(探针)来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。具有一定同源性的两条核酸单链在适宜的条件（温度及离子强度）下可以按碱基互补配对的原则退火形成双链分子，由此可用来检测核酸分子存在与否。实质是核酸分子的变性与复性过程。核酸分子杂交应用：1）基因克隆的筛选；2）酶切图谱的制作；3）基因组中特定基因序列的定量和定性分析；4）基因突变分析；5）疾病的诊断。

24.核酸探针的种类：1）寡核苷酸探针；2）基因组DNA探针；3）cDNA探针；4）RNA探针。

25.理想探针标记物应具备的条件:(1).高度灵敏性;(2).标记物与核酸探针分子的结合，不影响探针的主要理化特性，绝对不能影响其碱基对特异性;(3).具有较高的化学稳定性，能耐较高温度和保存时间;(4).检测方法具有高度特异

性;(5).标记及检测方法简单;(6).对环境无污染，对人体无损伤;(7).价格低廉。

26.放射性核素-----目前最常采用：优点：1）灵敏度极高；2）放射性核素对各种酶促反应无任何影响,也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质；3）极高的特异性。缺点：1）半衰期短, 随用随标；2）放射性污染。

非放射性标记物：优点：1）无放射性污染；2）稳定性好,可较长时间存放。缺点：1）灵敏度不太高；2）特异性不太高。非放射性标记物：1）生物素；2）地高辛；3）荧光素：FITC，罗丹明。

27.核酸探针的标记方法:(1)DNA的切口平移标记法;(2)随机引物标记法;(3)RNA探针的标记;(4)DNA的末端标

记;(5)cDNA探针的标记：在反转录过程中选用反转录酶, 加入标记的核苷酸, 引物可以特定的,也可以是随机六核苷酸, 或oligo dT;(6)寡核苷酸探针的标记：在DNA合成时加入特定标记的核苷酸进行标记。

28.DNA的缺口平移标记法，随机引物标记法，DNA的3′末端标记等均为延长核苷酸的反应，而且要让32P进入链中，故应选择[α-32P]-dNTP，

50μci/反应，无特殊原因首选[α-32P]-dCTP。

29.DNA的5′末端标记，为加磷酸反应，而且要让p/32P进入5′末端，故应选择[γ-32P]-ATP， 150μci/反应。

30.生物素化核苷酸的制备:酶法(U)与化学法(C)

生物素标记方法:参入标记法(随机引物法或缺口翻译法)与光敏生物素标记法。

生物素探针的检测体系：①生物素探针+抗生物素蛋白+带ALP或HRP的生物素+底物；②生物素探针+抗生物素抗体+ 抗生物素抗体的抗体+ABC 10

试剂(底物:BCIP+NBT)。

31.探针DNA标记:Dig+dUTP→ Dig-dUTP

Dig-dUTP标记DNA方法: 切口平移法与随机引物标记法

检测方法: Dig-DNA探针+抗Dig抗体-ALP或HRP+底物（BCIP+NBT）。

32.目前常用的印迹转移的方法：1）毛细管转移；2）电转移法；3）真空转移法。

七、DNA的P C R

1.PCR原理：类似于DNA的天然复制过程，是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5`末端和3`末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成，反复重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。PCR反应的特异性依赖于2个与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，取决于2个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，退火温度。

2.PCR的过程：(1)．DNA模板变性 (denature)：95℃左右高温使模板DNA完全变性;(2)．单链DNA模板与引物退火(annealing)：引物与模板形成复合物的几率>>DNA分子自身的复性;(3)．引物的延伸 (extension)：DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。5 '端是人工合成的引物，是特定的，3 '端没有固定的终止点。

3.PCR技术的特点：1）高度的敏感性：是最主要的特点，25个循环可扩增106倍，它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本进行分析；2）高度的特异性：取决于2个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的正确性，退火温度；3）操作简便、快捷；4）适用样品的广泛性。

4.PCR的反应体系：1）寡核苷酸引物。引物的常用浓度范围：PCR反应中引物的浓度是0.1～1μmol/L，在100μl中引物的量为25～100 pmol,

假如用25μmol/L浓度的引物贮备液只需加1～ 4μl。配制时注意:①由于引物呈很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失, 故打开管子前要先离心, 再慢慢打开,溶解时加足量水后盖盖,充分上下振荡5～10min②溶解后分装, 冻存于-20℃；

2） PCR反应缓冲液：Tris-Cl（pH 8.3～8.8)； KCl或(NH4)2SO4:促使引物退火； MgCl2:影响酶活与精确度,产物的特异性；明胶或BSA或Tween-20:稳定酶活性；甲酰胺:使引物与模板特异性配对；

3）耐热DNA聚合酶；

4）dNTP：常用浓度是20～200μmol/L；避免反复冻融, 分装冻存于-20℃；

5）模板DNA：抽提方法：简单的水煮沸法，去垢剂裂解细胞→蛋白酶消化蛋白→有机溶剂抽提→乙醇沉淀核酸。

5.PCR引物的设计原则：1）引物长度在15～30个碱基；2）引物的碱基的分布是随机的, 避免5个以上的嘌啶和嘧啶的连续排列, 尤其3 '不应有连续3个G或C；3）避免两引物间的互补,特别是3 '端；4）引物自身不应有连续超过3个

bp的互补序列；5）引物的3 '端不能有任何修饰, 3 '决定产物的特异性；6）引物的5 '端限定PCR产物的长度, 5 '端可进行修饰；7）引物与非扩增序列同源性应<70%或<连续8个互补；8）扩增编码区中,引物3 '端不要终止于密码子的第3位。

6.PCR反应“平台效应”出现的早晚取决于：1。Taq聚合酶的性能；2。模板DNA的拷贝数；3。底物dNTP浓度；4。其他多种因素

7. PCR的条件优化：1）PCR循环数；2）使用增强剂（DMSO，PEG-6000，甲酰胺，甘油，Tween-20）；3）热启动PCR。

8.PCR技术的应用：1）基因分析：（一）基因缺失的检测；（二）基因突变的检测；（三）基因易位的检测；（四）外源致病基因的检测；2）定位克隆；3）序列分析。

八、外源基因的表达

1.目前常用的真核表达宿主可分为：酵母、昆虫（果蝇与非果蝇类）、哺乳动物。

2.外源基因导入真核细胞的基本方法:1)病毒感染; 2)转染:（一）化学法:磷酸钙共沉淀法, DEAE-葡聚糖转染法, 脂质体介导法, 醋酸锂法. （二）物理法:电穿孔技术, 显微注射技术.

3.外源基因在真核细胞中表达的主要方式：1）瞬时表达（瞬时转染），特点：外源DNA未与宿主染色体整合，维持时间短(2-3天)； 2）稳定表达（稳定转染），特点：外源DNA已整合入宿主细胞染色体, 其转染的目的是获得稳定表达外源目的基因的单细胞克隆。

4.哺乳动物细胞表达载体两大类：1）质粒型载体，组成：启动子，增强子，多聚腺苷酸化信号：稳定mRNA，保证基因表达的效率，筛选标记(多为药物选择标记基因)，报告基因，表位标签； 2）病毒型载体：将外源基因导入哺乳动物细胞或替换哺乳动物细胞中的缺陷基因。

5.哺乳动物细胞表达载体的选择：1）研究目的: 研究启动子和调控元件所选的报告基因载体的组成不同，前者的载体不含启动子，后者则相反。2）. 附加物的选取: 附加物有表位标签{如(His)6、GST}、GFP等。3）. 筛选标记的选择；4）. 宿主选择: 依据启动子与宿主的相容性来选择。5 ）.外源基因的大小: 注意载体对外源基因的容量要求。

6.常用的哺乳动物细胞的种类：（一）稳定表达的细胞：1.鼠细胞株：L-细胞、Ltk细胞、NIH 3T3细胞、Sp2/0和NSO 细胞、CHO细胞等；2.人细胞株：HEK293、HeLa、HL-60、HT-1080等细胞；㈡瞬时表达的细胞：COS细胞和HEK 293细胞；㈢哺乳动物细胞的选择：细胞选择的依据主要决定于基因表达的目的。

7.常用的酵母穿梭载体可分为以下四种：①整合型质粒；②附加体质粒；③复制型质粒；④着丝粒质粒；⑤酵母人工染色体

8.外源基因在酵母细胞中的表达：（一）、酵母细胞表达载体；（二）、酵母细胞培养的基本技术：1）酵母细胞培养；细胞密度测定；酵11

母细胞株的保存；2）酵母质粒的提取；3）外源基因导入酵母细胞。

9.外源基因在昆虫细胞中的表达载体的分类。

主要有两大类：1）质粒载体；2）杆状病毒载体系统。

10.杆状病毒表达载体系统：杆状病毒表达载体系统(BEVS) 包括杆状病毒转移载体和杆状病毒(野生型或变异型)。但只有二者共转染昆虫细胞，才能得到重组的杆状病毒和在细胞中表达外源蛋白质。1）1. 杆状病毒转移载体结构：多数载体由pUC质粒改造而来，含ampr基因。大多含polyhedrin基因启动子和外源插入位点，在启动子上游（5 '旁侧）及外源插入基因下游（3'旁侧）均有病毒基因序列。 2）杆状病毒表达载体和杆状病毒共转染方法：A：用重组转移载体与野生型杆状病毒DNA共转染昆虫细胞而得到重组杆状病毒。B：采用线性化的、必需病毒序列缺陷的野生型杆状病毒（此病毒DNA不具备感染能力）共转染。C：选用BAC-To-BACR Baculovirus Expression System：先通过将目的基因克隆到供体质粒pFastBac1上并转化入含助手质粒和杆状病毒穿梭载体的感受态大肠杆菌中，获得重组病毒颗粒后感染入昆虫细胞。

11.真核生物的顺式作用元件：

1）启动子：Ⅱ类启动子常由TATA盒和部分上游启动子元件组成；是TF ⅡD识别部位。

2）上游启动子元件：一些位于TATA盒上游的可调节基因转录DNA序列。重要包括：CAAT盒和GC盒。

3）增强子：能增强启动子活性的DNA序列。特点：能远距离增强启制动子的活性；无方向性，在启动子的上游和下游均起作用；对启动子的影响无严格的专一性。作用机制：可能通过与某些调节蛋白的结合改变染色质的结构而发

挥作用。

4）反应元件：某些反式作用因子与特定刺激信号结合后，能与某些上游启动子元件和增强子所结合，调节基因表达，这类顺式作用元件即特称中反应元件

5）沉默子：能抑制启动子活性的DNA序列。

12.反式作用因子的主要特点：1）一般具有三个结构域：DNA识别结构域（锌指、碱性α-螺旋、碱性亮氨酸拉链、碱性螺旋-环-螺旋）、转录激活域（酸性激活域、谷氨酰胺富含域、脯氨酸富含域）和蛋白质-蛋白相互作用结构域（二聚化结构域）；2）能识别并结合调控区的顺式作用元件；3）对基因表达有正性调节（激活）和负性调节（抑制）二种方式。4）其调节机涉及顺式作用元件、RNA聚合酶和其它调节蛋白。

13.TFⅡ（转录因子）参与RNA-pol Ⅱ转录：1）TF ⅡD：辨认TATA盒； 2）TF ⅡA：稳定TF ⅡD结合； 3）TF ⅡB：促进pol Ⅱ结合； 4）TF ⅡF：解旋酶； 5）TF ⅡE：ATPase。

14.模板理论：一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。转录因子之间不同方案组合，生成有活性、专一性的复合物，再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。按不同组合，人类约３.５万个基因，估计需转录因子３００余个即可。

15.转录起始调控模式：要通过调节反式作用因子的活性控制转录起始。

1）反式作用因子的活性调节：表达式调节: 需要时才合成, 随即被降解; 共价修饰: 作用时间较长，常见有磷酸化/去磷酸化、糖基化，都作用于Ser和Thr，有竞争排斥；配体结合：如激素受体类反式作用因子，只有当与激素结合才有活性；蛋白质-蛋白质相互作用：如碱性亮氨酸拉链的二异聚体化。

2）反式作用因子与顺式作用元件的结合：多数：先激活后结合; 少数：先结合后激活。

3）增强子与调基因可以很远，上游启动子亦相隔数十个碱基。反式作用因子的作用模式：扭曲、滑动、成环等

4）中介因子对转录起始的调控

5）多重增强子作用：金属硫蛋白基因；组合式基因调控。

16.mRNA加帽和加尾的调控意义：1）5′帽子结构的作用：防止mRNA被5′→ 3′核酸酶降解；能被帽结合蛋白识别，增强mRNA的可翻译性，没帽子结构，翻译效率降低；促进mRNA从核到胞浆的运输过程；增强mRNA的剪接效率, 帽对exon1的剪接尤为重要，需要2个帽结合蛋白参与（CBP80和CBP20）。 2）Poly(A)尾的作用：延长mRNA的半衰期限；促进翻译效率。

17.mRNA选择剪接的调控作用：选择剪接方式：1）外显子选择：也称外显跳跃，选择不同的外显子进行剪接，成熟mRNA 中外显子数目不同；2）内含子选择：在不同的成熟mRNA中，内含子可全无或保留某一个；3）相斥外显子：二个外显在不同成熟mRNA中只能出现其一，而不能共存；4）内部剪接点：剪接点异常，导致成熟mRNA出现的只是某个外显子或内含子的一部分。

18.对原核表达载体的要求：(1)有一个强启动子及其两侧的调控序列;(2)SD序列，且SD序列与AUG之间有合适距离（转译效率严格依赖于此）。(3)克隆基因与启动子之间有正确的读框;(4)外源基因下游应加入不依赖于ρ因子的转录终止区19.蛋白质在原核细胞中的表达特点:(1).原核细胞的RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，故需使用原核启动子。(2).原核表达载体的mRNA有SD序列，真核细胞无。(3).原核细胞缺乏RNA转录后加工的能力，所以真核目的基因为mRNA

逆转录合成的cDNA。(4).原核细胞缺乏蛋白质翻译后加工的能力；若要表达的蛋白质需要糖基化及高级结构，应采用真核表达系统。(5).外源基因在原核细胞的高效表达产物多为包含体。

20.哺乳动物细胞质粒表达载体的组成：启动子；增强子；拼接信号；终止信号和多聚腺苷酸化信号；筛选标记(多为药物选择标记基因)；12

报告基因；表位标签；真核病毒序列

21.哺乳动物细胞表达载体的选择原则： (1). 表达蛋白质的目的: 研究启动子和调控元件所选的报告基因载体的组成不同，前者的载体不含启动子，后者则相反。(2). 附加物的选取: 附加物有表位标签{如(His)6、GST、GFP等等。(3). 筛选标记的选择;(4). 表达细胞(宿主)的选择: 依据promoter与 host的相容性来选择。(5) .外源基因的大小(bp数): 注意某些病毒载体对外源基因的容量。

22.原核表达系统常用的载体：大肠杆菌（E.coli）；芽孢杆菌（Bacillus）；链霉菌（streptomyces）。

23.大肠杆菌表达系统：1）优点：遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短。缺点：缺少真核生物的蛋白质

翻译后修饰和加工系统;表达的蛋白质多以包含体形式存在;宿主本身杂蛋白多，不利于提取。2）大肠杆菌表达载体的构成：A.宿主菌：大肠杆菌； B.外源基因载体：大肠杆菌质粒。

24.理想的表达载体的要求：1）稳定的遗传和复制能力。2）显性的转化筛选标记。3）启动子具有可调控性，本底转录水平低。4）外源基因下游应加入不依赖于ρ因子的转录终止区。5）具备外源基因插入的酶切位点。克隆基因与启动子之间有正确的读框。6）SD序列，且SD序列与ATG之间有合适距离。

25.载体的结构成分：1）复制子； 2）筛选标记； 3）启动子和终止子； 4）核糖体结合位点。

26.大肠杆菌载体的表达方式：1）非融合表达载体：细胞因子的表达； 2）融合表达载体：分子量较小蛋白质表达；3）带纯化标签表达载体：便于目的蛋白纯化的标签；4）分泌型表达载体；5）表面展示表达载体；6）带分子伴侣的表达载体。

27.外源基因表达条件的优化：1）表达载体的优化设计与选择：A）选择适当的强启动子；B）引入原核增强子样序列；C）.设计合理的SD序列；D）.外源基因中稀有密码子的影响，解决办法：碱基突变和共表达稀有密码子的tRNA基因。2）增加mRNA的稳定性。3）提高外源蛋白的稳定性：A）.利用蛋白质转运系统把目的蛋白积累在间周质或分泌到胞外。B）.利用某些蛋白水解酶基因的缺陷株为宿主菌。C）.共表达某些辅助因子提高目的蛋白稳定性。D）.采用融合表达或串联表达。E）.对蛋白质序列中酶敏感区域改造。4）工程化宿主菌的选择

九、差异表达基因

1.研究差异表达基因的目的：筛选与疾病发生相关的功能基因：可深入研究基因组所有基因的功能

研究意义：从基因水平揭示疾病的发生机制，探索治疗疾病的有效方法。

2.研究的主要方法：(1).基因芯片技术：A.用已知序列的探针与样品cDNAs杂交，杂交信号阳性的探针序列即为细胞中表达的DNA序列。B.应用：寻找差异表达的基因。C.优点：灵敏度高，不需测序，操作时间短。D.缺点：杂交和洗涤条件难把握，会导致一定的假阳性率或假阴性率，分析图象和数据耗时。

(2).基因表达的系统分析：A.可同时分析成千上万个基因；B.优点：所需实验设备少；一次可测得多个基因片段(3'部分序列)；可能获得新的基因片段。C.缺点：需要大量测序；过程复杂；步骤多；可能丢失短的基因片段；提供信息有限；

(3).差异显示PCR法：A.可大规模地筛选差异基因；B.优点：快速、所需RNA量少；C.缺点：假阳性率高；对高拷贝基因有偏向性；所获得的片段太短。

(4)消减杂交技术。

3.消减杂交法(subtractive hybridization,SH )：将实验组mRNA(或cDNA)与对照组cDNA(或mRNA）杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成分（cDNA或mRNA），得到的为实验组独有的mRNA或cDNA，这些基因即是差异表达基因。

4.代表性差异分析技术的基本原理：使用PCR以指数形式扩增双分子自链模板，以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。代表性差异分析技术的缺点：低丰度的身杂交的几率很低；酶切连接步骤多，损失大；得不到全长cDNA。

5.抑制消减杂交法（SSH）：1）具体过程：第一阶段：与RDA法类似，用识别4碱基的限制酶(如Hae Ⅲ等)消化实验组(Tester)与驱动组(Driver)cDNA ,得到平末端cDNA短片段；第二阶段：实验组cDNA均分为两份,分别加接头1和接头2，各自与过量的驱动组cDNA酶切片段杂交，杂交产物混合后再与驱动组新的cDNA酶切片段进行第二轮杂交，产物补平后作为模板，加引物作2次PCR扩增。 2）基本原理：第一步用限制性内切酶（Rsa I或Hea III）对双链cDNA

消化；第二步把Tester cDNA均分为两份,分别连接接头；第三步两轮消减杂交；第四步加入引物作2次PCR扩增。

6.基于PCR的消减杂交技术：1）分别将实验组和扣除组的mRNA反转录，实验组利用mRNA的3'poly A尾和5'-GGG帽结构分别在cDNA两端加上序列相同的锚定引物；2）扣除组cDNA随机引物PCR扩增制备扣除探针，同时掺入生物素；3）实验组cDNA与扣除探针杂交，除去杂交体及未杂交上的扣除探针，得到实验组独有的cDNA，然后用锚定引物扩增并克隆。

十、基因诊断、基因治疗

1.基因诊断方法的特点：1）特异性强； 2）灵敏度高； 3）早期诊断； 4）检测样品局限性小；5）应用范围广。

2.DNA 芯片技术或称DNA微阵列技术：1）为一项高密度集成探针的杂交技术。2）杂交方式：固-液相杂交。

3）特点：探针量>>靶基因片段(量) 。3）检测手段: 非常规的显色或放射自显影。4）应用：用于单核苷酸多态性(SNP)

分析、基因表达谱的研究等。

3.原位PCR(IS-PCR )技术：1）A.利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前

提下,利用一些特定13

的检测手段(例如，分子杂交)来检测细胞内的扩增产物。B.直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣ

Ｒ扩增。可进行细胞内定位。C.适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。2）用途: IS-PCR把PCR+原位杂交（ISH）技术这两者结合起来,成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以

及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。3）操作步骤：A.细胞

或组织固定；B.PCR扩增细胞内目的片段；C.原位杂交检测扩增产物。

4.单链构象多态性(single strand comformation polymorphism, SSCP)：1）分析原理：单个或多个碱基不同、但序列

长度相等的双链核酸分子，经变性成单链后可具有不同的构象，在中性PAGE中的电泳迁移率不同，与正常的电泳图型

对照，新生条带出现即可判定存在碱基变异。2）应用：广泛用于大批样品基因突变的检测(初筛)。3）优点：方法简便,

灵敏度较高。缺点：准确性不如DNA测序。一般只限于检测300bp以下的片段。影响结果的因素颇多。

5.已知点突变的检测方法：PCR-ASOH探针杂交法：根据突变位点的上下游序列，设计合成寡核苷酸引物。经PCR扩增

出突变区的CAN片段，然后直接点在膜上，与相应的寡核苷酸探针杂交，即可检测出DNA样品是否有突变，以及诊断受

检者是突变纯合子还是杂合子。1）作ASOH时，针对每种突变位点，分别合成2个寡核苷酸探针；其中一个能与正常序

列完全互补，另一个则与具有突变的碱基序列完全互补；2）预杂交、杂交、洗膜、放射自显影或显色；使只有与探针

序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，有错配的探针则被洗脱，不显示杂交信号；3）分析正常探针及突变探

针分别杂交得到的显影或显色图谱，即可作出基因诊断。

6.未知点突变的检测：初筛用PCR-SSCP分析法；确认用DNA 测序。

7.少数核苷酸缺失或插入的检测：1）PCR-RFLP分析；2）PCR-限制酶酶谱分析；3）AS-PCR；4）PCR-SSCP；5）DNA测

序等。

8.大片段核苷酸丢失或插入的检测：1）中等长度 (0.5-1.5kb)的DNA片段缺失或插入，可用一对引物的普通PCR检测,

根据结果作出判断。2）基因较大且多位点(位点间距离较远)存在插入或缺失，宜采用多重PCR法检测。

9.α地中海贫血：1）α-地中海贫血(α-thalassemia,简称α-地贫)。是由于α -珠蛋白基因的缺失或缺陷使α链的

合成受到抑制而引起的溶血性贫血。 2）α地贫的基因型：α - / αα (称α+ 地贫)； - - / αα (称αo 地贫). 3）α地贫的临床类型：（A）.Hb Bart's 胎儿水肿综合征：基因型 - - / - - ，称为α0 地贫纯合子。不能形成胎

儿HbF，但形成γ 4，称为Hb Bart ( γ 4) 。Hb Bart对氧的亲和力极高，造成组织严重缺氧, 导致胎儿水肿, 引起

死胎或新生儿死亡。

（B）.血红蛋白H病：基因型 : - a /- -或 a -/- - 亦可为 a aT/ - -，称为a0地贫和a+地贫的双重杂合子。患者

只能合成少量a链，

β链形成β四聚体(β 4)，易被氧化，解聚成游离的单链，并积聚成包涵体，附着于红细胞膜并使之受损，失去柔

韧性，易被脾脏破坏，导致中度或较严重的溶血性贫血，称为血红蛋白 H病 ( Hb H disease )。

（C）轻型(标准型) a 地中海贫血：基因型：a a/ - - (a0地贫杂合子)或 a -/ a - (a+地贫纯合子)。缺失2个 a 基因，间或有轻度贫血，我国主要是a 0地贫杂合子。轻型a地贫患者之间婚配，生育子女中患 Hb Bart's胎儿水肿综合

征的机率为1/4。

（D）.静止型 a地中海贫血：基因型：a -/ a a ( a + 地贫杂合子 )，仅缺失1个a 基因，无症状。静止型 a 地贫

与轻型 a 地贫个体婚配，可有1/4机会生育Hb H病患儿。

10.α地贫的基因诊断与产前诊断：1）Southern印迹杂交及限制性酶谱分析法：A）.α和ζ珠蛋白基因探针制备；B）

内切酶谱结果鉴定。

2）PCR方法：设计3条引物进行双重PCR扩增，A）若扩增出AB的314bp片段，而不能扩增出AC片段，则为正常；B）若扩增出AB的314bp片段,且能扩增出一条500-600bp的片段(缩短了的AC),则为a地1；C）若只能扩增一条500-600bp

的片段，但不能扩增出AB的314bp片段,则为Bart's水肿胎。

11.基因治疗的基本程序：目的基因的选择与制备?受体细胞的培养?载体的选择?目的基因导入靶细胞?转导细胞的筛选

和鉴定?基因治疗的安全性监测和疗效评价.

12.基因治疗时基因导入方式(方法)的选择：1）直接法(体内法) ( in vivo )：特点：直接向体内某组织(器官)转基因。

优点：操作简便；缺点：基因转移和表达的效率都较低。 2）间接法(回输法) ( ex vivo )或称离体法。特点：离体

培养细胞，转基因后回输至患者体内。优点：成功率相对较高；缺点：操作繁琐。目前此类方法常用。3）原位法 ( in situ )直接向患者的病变部位转基因。

13.基因导入的病毒学方法：1）目标基因导入靶细胞的方法分为两类：病毒学方法和非病毒学方法。2）病毒学方法：

是指以重组病毒为载体，通过感染将目的基因导入靶细胞的方法。

14.逆转录病毒载体：1）逆转录病毒科是RNA病毒。具有二倍体基因，RV可将其基因组整合到感染细胞的DNA上。基因

组分为3个区：第1个区为LTR(含增强子、启动子、转录起始和终止信号)；第2个区为ψ序列 (其编码产物能有效包

装病毒基因组进入病毒颗粒)；第3个区含3个结构基因(gag、pol、env)。能有效转录的真核DNA序列连锁时, 就能

获得有效表达, 从而产生新霉素磷酸转移酶使G418失活。显然, 当真核细胞转入neo基因后，就会在含G418的选择性

培养基中存活，而未转入neo基因的细胞则不能生存。

18.基因治疗的主要策略：1）基因置换(基因矫正)：有两种含义:其一,指将致病基因整个地以正常基因置换，使致病基

因永久性得到更正；其二，指对缺陷基因的异常序列进行精确的原位修复但不影响邻近的基因。基因定点突变、定点敲

除和定点修复均属于基因打靶(gene

targeting)技术。2）基因添加：在不去除异常基因的前提下，将目的基因导入病变细胞或其他细胞(非定点整合)，

以目的基因的表达产14

物来补偿缺陷基因的功能或使原来的功能得到加强。3）基因干预

19.基因干预是指采用特定的手段，抑制或阻断某个基因的表达。

基因干预的靶基因：过度表达的癌基因、病毒复制周期的关键基因。

技术方法：反义核酸技术；反义核酸-核酶技术；细胞内抗体( intrabody )技术等等。

20.核酶(ribozyme)技术：核酶催化部份和底物部份组成锤头结构。1）能进行分子内自我催化的RNA片段不很长，通常

为60个核苷酸左右。2）同一分子上包括有催化部份和底物部份。3）核酶催化作用的特点：A)都有一个活性中心，催

化时形成中间复合物，具有比蛋白质酶更高的底物特异性；B)核酶对底物的切点处序列普遍为含GU序列。

21.腺苷脱氨酶(ADA)缺陷病的基因治疗：1）ADA基因定位于染色体20q12-q13.11，基因全长32kb， mRNA长1 530bp。2）ADA缺陷导致SCID的分子机制：ADA或PNP缺失导致dATP或dGTP在细胞内积蓄，对早期T、B细胞发育有毒性作用，

使之停滞于pro-T/pro-B阶段，引起严重联合型免疫缺陷（SCID）.3）基因治疗研究：ADA-gene + vector （逆转录

病毒）?重组分子?导入生长、分裂的细胞?ADA gene表达?回输患儿体内? 1~2月治疗一次, 10.5个月后患儿体内ADA

水平达正常人的25%。

22.肿瘤基因治疗策略分为三大类:1）抑制和杀伤肿瘤细胞：A.自杀疗法；B.抑制癌基因的表达；C.恢复抑癌基因的功

能；D.抗肿瘤血管形成。2）肿瘤细胞的基因“修饰”。3）调节和增强机体的免疫功能。

十一、生物芯片

1.原位合成芯片的特点：1）易寻址，利用组合化学的原理安排各寡核苷酸的位点，芯片反应后易寻址；2）点位牢固，

用表面化学方法处理基片，使核苷酸固定在基片上；3）定点合成，光导向平板印刷技术，芯片表面可用屏蔽物屏蔽，

光照选择性脱保护，有利于定点合成寡核苷酸中的各个碱基；目前技术可达的集成度：10万-40万点阵/cm2，探针长度

8nt-20nt。4）受专利保护。

2.DNA微集阵列区别于原位合成芯片之处：(1).制作方式：(前者为别处合成和收集探针，后固化；后者是原位化学合成；(2).探针类型：(前者可用常规分子生物学方法合成的任一种探针,后者为化学合成寡核苷酸)；(3).探针长度：(前者为

后者的十倍到几十倍)；(4).探针集成度：(前者低，后者高)；(5).技术保密性(只有后者受专利保护)。

3.生物芯片的基本操作:(1)探针的设计与芯片的制作：设计，制备，玻片的多聚L-赖氨酸预处理，探针的打印与固化;(2)

待测样品核酸的提取、扩增与标记：探针不标记，而待测核酸(液相)标记。(3)．杂交反应与杂交后清洗:芯片杂交与常

规分子杂交相似;(4)扫描与图像分析，数据的标准化处理与分析; (5)结果与讨论

4.原位合成DNA芯片的制作：(一)显微光蚀刻技术：经化学处理,支持物表面活性羟基(OH) 连接光敏保护基(X) 选用光刻掩模(M1)保护非聚合部位?用激光点光源照射聚合部位,以去除光敏保护基(X),露活性羟基(OH)-?

加入单核苷酸(如dTMP)的亚磷酰胺活化端与活性羟基(OH)发生化学偶联 ,光敏保护非活化端-?更换另一掩模(M2)，激光点光源照射下一个位点-?脱保护，偶联第二个核苷酸(如dCMP)-?重复上述步骤，直至合成完所需探针. (二)压电打印法. (三)分子印章法: 寡核苷酸合成试剂-?分子印章(涂布)-? 压印获得芯片(特定位点)-? 合成反应.

5.DNA芯片的分子杂交反应:1）芯片的杂交类型：固-液相杂交(固相：探针；液相：靶分子核酸)。2）芯片杂交的特点：探针的数量>>靶基因的数量。3）杂交反应动力学：呈线性关系。4）杂交信号强度∝ (样品)靶基因的量。5）空间位阻效应：探针?< --靶分子；探针-?<---探针。6）杂交反应条件与反应条件的优化。

同不对或员成个某的族家因基对：性异特度高2)；言而区守保的列序靶对：性补互全完1)：则原计设针探酸苷核寡6.探针：探针的丰度：针对靶基因序列设计多个生物种属的同一基因而言；3)(3个以上)设计单碱基错配即MM(mis-match)寡核苷酸探针；4) )(衡量探针的特异性。作内参照，以为绿色,标记处理组；Cy5,标记对照组)为红色反转录荧光标记法：注意事项：7.1）不同来源的样品分别用不同颜色的荧光素标记(Cy3 dCTP)，并调整两者的比例，使杂交信号最强。如）对同一种便比较分析；） 2dNTP，既要加入荧光标记的，也要加入非标记的(Cy3-dCTP与降解模终止反应后续步骤：dNTP的浓度。 -?种，则应相应调整其余种样品或讨论：若用Cy3-dCTPCy5-dCTP(分别标记2)3 (mRNA ) ?RNA板(总或过柱滤去游离的荧光核苷酸)?洗脱、浓缩、真空干燥溶解样品。? ）杂交液的组成。）靶核酸长度、碱基组成及其浓度；4）探针碱基组成及其浓度；温度；）影响芯片杂交的因素：8.1 23 19.蛋白质芯片应用：）疾病诊断所依据的标志性蛋白质分子；3）对药物的疗效、毒副作用作出评价；）寻找药物作用的靶蛋白。2 十二、细胞内信号转导通路：互.A通过相邻细胞直接接触（直接通讯）细胞信息传递方式：①1. ：）间隙连由连接蛋白形成.）细胞表面分子 B,允许小分子和离子通过； )；神经系统介导的通讯突触连接.）相识别、粘附介导的通讯；C ( 通过细胞分泌各种化学物质调节其他细胞的代谢和功能（间接通讯 )：内分泌信号；旁分泌信号；自分泌信号。②受体对信号进行转换并启动?扩散或血循环到达靶细胞与靶细胞的受体特异性结合??跨膜信号转导的一般步骤：特定的细胞释放信息物质2. 细胞内信使系统靶细胞产生生物学效应。? A(protein (adpenylate 蛋白，腺苷酸环化酶G- cAMP 3. 蛋白激酶Ａ途径：组成：胞外信息分子，受体，，AC)，cyclase，蛋白激酶 cAMP 15

kinase A，PKA)

4. PKA：1）由四个亚基组成：R2C2 （R-调节亚基，C-催化亚基）；2）被cAMP激活： 3）催化多种蛋白质丝/苏氨酸磷酸化。

5.PKG：1）由两个相同亚基组成；2）被cGMP激活；信号通路：3）ANP,NO,细菌内毒素等→作用于具有GC活性的受体→GC激活→cGMP↑→PKG活性↑→蛋白磷酸化→生理效应

6.PKB：1）与病毒癌基因 v-akt编码的蛋白Akt同源，又称为Akt；2）为单链结构，有三种亚型；3）可与PIP3结合而间接被激活；4）与细胞代谢、凋亡、癌变有关。

7.PKC：1）受Ca2+ 和二酰基甘油（DAG）激活；2）参与细胞多项生理活动。

8.丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）：1）MAPK是蛋白激酶家族,包括ERK,JNK和p-38-MAPK三个亚家族；2）激活级联反应：MAPKKK(Raf) →MAPKK(MEK)

→MAPK(ERK) →生理作用。3）MAPK是多条信号通路的交汇点,与调节细胞生长、分化、凋亡有关。

9.蛋白酪氨酸激酶（PTK or TPK）：1）此类激酶促进蛋白质中酪氨酸的磷酸化。2）分为两大类:受体型PTK—许多生长因子受体；非受体型PTK,如src,abl,FAK。3）PTK与细胞生长、增殖、癌变有关。4）PTK抑制剂中可筛选抗癌药。10.GTP结合蛋白：1）G蛋白是多种膜受体传入信号的“开关”。2）异三聚体G protein由三个亚基α,β,γ组成。巳知17种α亚基,5种β亚基,7种γ亚基,故G蛋白是一个大家族。3）α亚基可结合GTP或GDP,并有GTP酶活性,α-GTP 可活化下游信号分子,βγ亚基是调节亚基。

11.小分子G蛋白：1）分子量2万-3万的单链结构，功能类似异三聚体G protein的α亚基，可结合GTP或GDP,并有GTP酶活性；2）最重要的是癌基因Ras和 Rho亚家族；3）Ras-GTP代表“开”,Ras-GDP代表“关”.控制信号转导。

12.蛋白磷酸酶：1）是一个大家族,分为两大类：蛋白丝/苏氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶。2）其作用与蛋白激酶相反，催化蛋白质去磷酸化.3）抑癌基因产物PTEN是一种磷酸酶，可使PIP3脱磷酸化为PIP2，也可催化蛋白质中磷酸酪氨酸或丝/苏氨酸脱磷酸

13.磷脂酶C(PLC) ：PIP2＋H2O－→IP3＋ DAG

14.磷脂酰肌醇激酶(PIK) ：不同的kinase 利用ATP催化PI逐级磷酸化 PI→PI-4P→PI(4,5)P2 → PI(3,4,5)P3。

15.PI-3 Kinase：1）被许多GF及Oncogene激活；2）催化：PI ——>PI-3P; PI-4P———>PI（3、4）P2; PI（4、5）P2———>PI（3、4、5）P3 。3）PI（3、4、5）P3似与细胞生长、分裂、癌变、运动有关

16.一氧化氮合酶(NOS) ：L-精氨酸＋2NADPH＋2O2→L-瓜氨酸＋NO+2H2O

17.受体的分类：1）膜受体：存在于细胞质膜上的受体，绝大部分是镶嵌糖蛋白。根据其结构和转换信号的方式又分为

三大类：离子通道受体，G蛋白偶联受体和单跨膜受体。2）胞内受体：位于细胞浆和细胞核中的受体，全部为DNA结合

蛋白。受体的结构：高度可变区，DNA结合区，激素结合区，铰链区。

18.受体作用的特点：1）高度专一性；2）高度亲和力；3）可饱和性；4）可逆性；5）特定的作用模式。

19.受体活性的调节：1）磷酸化与脱磷酸化作用；2）膜磷脂的代谢的影响；3）酶促水解作用；4）Ｇ蛋白的调节。

20.cAMP - 蛋白激酶Ａ途径：1）组成: 胞外信息分子，受体，G蛋白，腺苷酸环化酶AC)， cAMP，蛋白激酶 A(PKA)。2）信息传递：激素?受体?Ｇ蛋白?酶?第二信使?蛋白激酶?酶或其他功能蛋白?生物学效应. 3）生理意义：通过对效应

蛋白的磷酸化作用，实现其调节功能，如促进蛋白质合成、改变膜对水及离子通道的通透性、影响细胞分泌、加强心肌

收缩。

21.Ca2+－依赖性蛋白激酶途径：1）Ca2+－磷脂依赖性蛋白激酶途径组成:胞外信息分子，G蛋白，磷脂酶C (PLC)，

甘油二酯 (DAG)，三磷酸肌醇(IP3 )，蛋白激酶C (PKC)。 2）Ca2+－ CaM激酶途径组成:受体、G蛋白、PLC、IP3、Ca2+、钙调蛋白、CaM激酶。 3）PKC的生理功能：①调节代谢活化的PKC引起一系列靶蛋白的丝、苏氨酸残基磷酸化。②调节基因表达。对膜离子转运功能、机体代谢、基因表达、细胞分化和增殖等的调节起作用。

22.cGMP-蛋白激酶G途径：1）组成:受体，鸟苷酸环化酶(GC)，cGMP, 蛋白激酶G (PKG)。2）生理效应：PKG使有关蛋

白或酶类的丝、苏氨酸残基磷酸化，如心钠素、NO舒张血管平滑肌。利尿和舒张血管的作用。

23.酪氨酸蛋白激酶途径：1）受体型TPK-Ras-MAPK途径组成：催化性受体，GRB2, SOS, Ras蛋白, Raf蛋白，MAPK系统。2）JAKs-STAT途径(多种细胞因子的信号转导通路)组成:非催化性受体，JAKs (janus kinases)，信号转导子和转

录激动子 (STAT)。3）TPK在细胞的生长、增殖、分化等过程起重要的调节作用，并与肿瘤的发生有密切的关系。

24.核因子kB途径：1) TNF――――― Cer 等激酶系统――――――激活NF- kB

病毒感染、脂多糖、活性氧中间体、佛波酯、双链RNA等

2)生理意义：主要涉及机体防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡，以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。

25.TGF-β途径:1) SMAD最早被证实的TβR-Ⅰ激酶的底物,可将其归结成三大类：受体调节的SMADs (R- SMADs), 共同

的偶配体SMADs

(Co-SMADs), 抑制性SMADs (I-SMADs)； 2）调节增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞反应。

26.PI-3K-Akt/PKB途径:1)组成：信息分子, 受体, G蛋白, PI-3K, PIP3, 肌醇磷脂依赖性激酶（PDK）, Akt/PKB, PKB 底物。2）PKB使其底物磷酸化，常导致细胞生长、分裂、癌变。调节基因表达，并与细胞凋亡和细胞周期调节有关。16

27.PKG的信号通路：ANP,NO,细菌内毒素等→作用于具有GC活性的受体→GC激活→cGMP↑→PKG活性↑→蛋白磷酸化→

生理效应.

28. 受体-第二信使学说：信号分子与受体结合，再通过激发细胞内相应酶，生成第二信使物质，第二信使将信号分子

携带的信息放大并向后传递最终引起一系列反应，而实现调节效应。

1.蛋白质组与基因组学的特点：1）基因组作为遗传信息的载体，其最主要的特征就是同一性。知到了个体内某一细胞

内的基因组就等于知道了该个体所有细胞的基因组。对于蛋白质而言，不同类型的细胞或同一细胞在不同的活动状态下，蛋白质组的构成是不一样的。2）基因组核苷酸的数量是明确的。蛋白质组，细胞内的大部分蛋白质通常都被进行过翻

译后修饰。从这种意义上说，对基因组核苷酸序列的测定是一种“有限”的工作，而对蛋白质组的蛋白质种类的确定则

是一种“无限”的工作。3）基因组自个体诞生到死亡，始终保持不变。而蛋白质组却是不停变动的。蛋白质的稳定性

白质在细胞里常常通过在不同的亚细胞环境里的运动发挥作用。5）基因组的基因表达的各种mRNA是彼此孤立的，互不

干扰。但蛋白质彼此间有着广泛的相互作用。可以说，不存在不与其它蛋白质发生作用的“孤立蛋白质”。蛋白质的功

能的实现离不开蛋白质与蛋白质或蛋白质与其它生物大分子之间的相互作用。

2.蛋白质组学研究技术：1）双向电泳技术；2）质谱技术；3）计算机图象分析与数据处理技术。

1）双向电泳技术原理：根据蛋白质的两个一级属性：等电点和分子量的特异性，将蛋白质在电荷和分子量两个水平