分子标记在水稻育种中的应用

水稻是我国最主要的粮食作物，水稻生产在未来几十年内要保持稳定的增长，这一增长是在更少的土地和水资源的条件下完成的，培育高产、优质、抗病虫性及抗逆性强的品种是水稻生产可持续发展的最佳途径。传统育种主要是在不甚明了基因背景的条件下，通过杂交和各种育种技术，根据植株在田间的表现进行评价与选择。表型性状不仅取决于遗传组成也受控于环境条件，而环境效应较易掩盖基因效应，因此，仅从表型进行选择显然是不理想的，特别是对受多个基因控制的数量性状选择，更难做到准确。

随着近二十年来现代分子生物学技术的应用与发展，特别是遗传标记的出现与应用，为作物育种提供了强有力的工具。在遗传学实验中，通常将可识别的等位基因差异或遗传多态性称为遗传标记。在遗传学的发展过程中，先后出现了以下四种

遗传标记：形态标记、细胞标记、生理生化标记、分子标记。其中以分子标记最为理想，因为ＤＮＡ水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，甚至是单个核苷酸的变异，因而其数量几乎是无限的。与以往的遗传标记相比，ＤＮＡ标记还有许多特殊的优点，如无表型效应、不受环境限制和影响等。

１ＤＮＡ分子标记的分类

自１９７４年Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ创立了限制性片段长

度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒ－

ｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）标记技术以来，分子标记得到最广泛

的应用。ＤＮＡ分子标记是ＤＮＡ水平的直接反映。依据对ＤＮＡ检测手段，ＤＮＡ分子标记可以分为四类（方宣钧，２００１）：第一类为基于ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交的ＤＮＡ分子标记，该技术通过限制性酶切、凝胶分离、探针杂交、显色技术来揭示ＤＮＡ的多态

性。其中最具代表性的是发现最早、应用广泛的

分子标记在水稻育种中的应用

李春光，刘华招

（黑龙江省农垦科学院水稻研究所，黑龙江

佳木斯

１５４０２５）

摘要：分子标记技术的应用日趋广泛，对水稻育种研究有重要的价值。通过重点介绍近年来分子标记在水稻分子遗传图

谱的构建、遗传资源保存和遗传多样性分析、基因的标记及克隆、分子标记辅助育种等方面研究的应用情况，探讨了分子标记的应用在水稻育种上的优势。关键词：分子标记；水稻；育种收稿日期：２００７－０３－０９

作者简介：李春光（１９７８－），男，研究实习员。

综述

２００７年第５

期中图分类号：Ｓ５１１．０３５．３

文献标志码：Ａ

文章编号：１６７３－６７３７（２００７）０５－００１９－０６

ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｋｅｒｓｔｏＲｉｃｅＢｒｅｅｄｉｎｇ

ＬＩＣｈｕｎ－ｇｕａｎｇ，ＬＩＵＨｕａ－ｚｈａｏ

（ＲｉｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＪｉａｍｕｓｉＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５４０２５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｗｉｄｅｕｓｅｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｈａｓｐｌａｙｅｄａｖｅｒｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｓｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｉｎｖｏｌｖｉｎｇｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃｇｅｒｍｐｌａｓｍｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎａｌｙｓｉｓ，ｇｅｎｅｔａｇｇｉｎｇａｎｄｃｌｏｎｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄａｎｄａｄｖａｎ－ｔａｇｅｓｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｏｎｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇｗｅｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ；ｒｉｃｅ；ｂｒｅｅｄｉｎｇ

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ＲＦＬＰ标记。第二类为基于ＰＣＲ技术的分子标记。ＰＣＲ技术以其简便、快速、高效的特点迅速成为分子生物学的有力工具，尤其是在分子标记技术的发展中更是起到了巨大作用。这类标记中随机引物ＰＣＲ标记包括ＲＡＰＤ、ＩＳＳＲ等，特异引物ＰＣＲ标记包括ＳＳＲ、ＳＴＳ、ＳＣＡＲ等。第三类为基于ＰＣＲ与限制性酶切技术结合的ＤＮＡ分子标记，包括ＡＦＬＰ、ＣＡＰＳ等。第四类为基于单核苷酸多态性的ＤＮＡ分子标记，如ＳＮＰ等。

２分子标记技术在水稻育种上的应用

数十种以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交ＰＣＲ扩增为技术特征的ＤＮＡ分子标记技术已陆续建立和应用于生物遗传育种的研究工作中。分子标记技术广泛用于水稻育种工作各个方面，目前，分子标记主要应用于构建分子标记图谱、重要农艺性状的基因定位及克隆、种质资源的保存与利用、分子标记辅助选择等。

２．１水稻分子遗传图谱的构建

高密度分子标记遗传连锁图谱的构建，可为基因定位、物理图谱构建和以图谱为基础的目的基因克隆奠定基础，还可为分子标记辅助选择创造条件。遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。经典的遗传图谱是根据形态、生理和生化标记构建的，由于这些遗传标记在作图群体的两亲本上极为有限，发展很缓慢，且图谱分辨率、饱和度不高，所以应用价值有限。而将分子标记应用于遗传图谱的构建是遗传界的又一重大进展。１９８８年，ＭｃＣＯＵＣＨ等利用ＩＲ３４５８３（籼）／ＢｕｌｕＤａｌａｍ（爪哇）杂交产生的Ｆ２群体构建了第一张水稻ＲＦＬＰ分子连锁图谱，该图包括１３５个标记（包括同工酶标记），全长１３８９ｃｍ。日本和美国将构建的分子图谱整合后获得更致密、更精细的图谱。１９９４年，ＣＡＵＳＳＥ等构建了包含８１６个标记的连锁图。陈洪等构建的水稻分子标记图谱有５２个ＲＡＰＤ标记，覆盖基因组总长度为８９８．４ｃｍ，标记间的平均间距为１７．３ｃｍ。现在，在ＲＧＰ网站上，ＹＡＮＯ等构建的连锁图上有３２６７个标记，其中绝大多数为限制性片段长度多态性标记，并且几乎都被转换成了切割长度多态性标记（ｃｌｅａｖｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙ－ｍｏｒｐｈｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＡＰＳ）。水稻基因组测序计划已经完成，这将为水稻基因组研究提供更多的标记。目前的数据表明，水稻遗传图谱上的分子标记数已超过６０００个，平均间距为７５～１００ｋｂ，基本覆盖了水稻基因组的所有区域。另外，美国康乃尔大学构建了水稻微卫星标记连锁图，图上的微卫星标记已达２７４０多个。据估计，在水稻基因组中大约有５７００～１００００个微卫星。最近一个包括３１２个ＳＳＲ标记和１４５个ＲＦＬＰ标记的水稻分子连锁图已在康乃尔大学构建。这些图谱的构建大大加速了基因定位和基于图谱的基因克隆，同时也可对控制数量性状的基因位点进行遗传剖析，为构建完整的物理图谱提供了线性框架。

２．２基因定位及克隆

基因定位就是确定基因在染色体上的位置及与之相连锁的标记。由分子标记定位的控制水稻重要性状的基因已超过１００个，作物的许多重要经济性状属于微效多基因控制的数量性状。传统的数量遗传学研究方法对于鉴别单个数量基因及与之有关的染色体片段和确定ＱＴＬ在染色体上的位置等显得无能为力。ＤＮＡ分子标记的建立和发展，使作物ＱＴＬ作图及其定位方法的研究进展很快。从１９９４年以来有关水稻数量性状ＱＴＬ定位的研究不断被提出，而其中以产量及抽穗期有关的ＱＴＬ报道最多。在被定位的基因中以抗病虫的基因定位最多，特别是抗稻瘟病和白叶枯病的基因，这有利于将抗同一疾病的不同基因聚合到同一品种中，以增强该品种对这一疾病的抗谱，获得持续抗性。此外，已定位的主要基因还包括恢复基因、广亲和基因、高秆隐性基因、显性核不育基因和光敏雄性核不育基因等。

首批稻瘟病抗性基因被ＧＯＴＯ、ＹＡＭＡＳＡＫＩ和ＫＩＹＯＳＡＷＡ等定位。它们是Ｐｉａ、Ｐｉｉ、Ｐｉｋ、Ｐｉｋｓ、Ｐｉｋｈ、Ｐｉｋｍ、Ｐｉｋｐ、Ｐｉｚ、Ｐｉｚｔ、Ｐｉｔａ、Ｐｉｔａ２、Ｐｉｂ、Ｐｉｔ和Ｐｉｓｈ。到目前为止，已鉴定出３０个抗稻瘟病位点，其中约２０个为主效基因，其余为数量性状位点。有些位点上已经鉴定出不止一个等位基因如Ｐｉ２ｋ位点有５个，Ｐｉ２ｚ有２个，有些则属于非等位性的。近年来，应用ＰＣＲ技术对其中一些抗瘟性基因也找到了ＲＡＰＤ或ＰＣＲ衍生标记，包括Ｐｉ２ｈ２１（ｔ）、Ｐｉ２ｔａ、Ｐｉ２ｂ、Ｐｉ２１、Ｐｉ２２（ｔ）、Ｐｉ２６（ｔ）、Ｐｉ２１１（ｔ）、Ｐｉ２１０（ｔ）和Ｐｉ２１２（ｔ）。到目前为止，在水稻中克隆到的５个抗性基因包括３个抗白叶枯病基因（Ｘａ－１、Ｘａ－２１和Ｘａ－２１Ｄ）和２个抗稻瘟病基因（Ｐｉ－ｂ和Ｐｉ－ｔａ）。Ｐｉ－ｂ基因是首个

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在水稻中被克隆的抗稻瘟病基因，它是ＷＡＮＧ等利用图位策略克隆出来的。其表达产物含有一个核苷酸结合位点（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ，ＮＢＳ）和亮氨酸重复序（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔ，ＬＲＲ）。Ｐｉ－ｔａ基因位于水稻第１２染色体靠近着丝点附近的区域，编码是由９２８个氨基酸残基组成的富含亮氨酸重复序列的细胞质膜受体蛋白。

截至２００５年６月，经国际注册确认和期刊报道的水稻白叶枯病抗性基因共３０个，其中Ｘａ２２（ｔ）、Ｘａ２６（ｔ）、ｘａ２６（ｔ）、Ｘａ２７（ｔ）、ｘａ２８（ｔ）、Ｘａ２９（ｔ）和３个Ｘａ２５（ｔ）为暂定名基因。已被定位的抗性基因有１７个，即第１１染色体上有７个，Ｘａ３、Ｘａ４、Ｘａ１０、Ｘａ２１、Ｘａ２２（ｔ）、Ｘａ２３和Ｘａ２６；第４染色体上有４个，Ｘａ１、Ｘａ２、Ｘａ１２和Ｘａ１４；第５染色体上有２个，ｘａ５和ｘａ１３；第６染色体上有Ｘａ７和Ｘａ２７；第１２染色体上有Ｘａ２５（ｔ）；第１染色体上有Ｘａ２９（ｔ）。从水稻品种资源中发现了至少２６个抗白叶枯病基因。迄今为止，利用这些标记在水稻中已克隆了３个抗白叶枯病基因即Ｘａ－２１、Ｘａ－１和Ｘａ－５。

科学家们发现了水稻对白背飞虱的抗性基因主要有６对，分别定名Ｗｂｐｈ２１、２、３、４、５、６。利用分子标记进一步定位发现Ｗｂｐｈ２１与ＲＦＬＰ标记ＲＧ１４６、ＲＧ４４５共分离，但ＲＧ１４６、ＲＧ４４５在水稻基因组内为多拷贝标记，故未能进行染色体定位。水稻对褐飞虱的抗性基因至少有９个位点，其中４个为显性抗性基因（Ｂｐｈ－２１、３、４、７），５个为隐性基因。通过分子标记分析已经将来自野生稻Ｏｒｙｚａａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ的Ｂｐｈ抗性基因定位在第１２染色体；将汕桂占的Ｂｐｈ抗性基因定位于第９染色体，位于ＲＺ４０４与ＵＣＨ１７０之间；发现来源野生稻Ｏ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ的Ｂｐｈ抗性基因与位于第４染色体上的ＲＧ２１４相关；发现Ｂｐｈ－２１位于第１２染色体上的分子标记Ｃ１８５与ＸＮｐｈ２４８之间。此外，我国学者王布哪等发现了两个抗褐飞虱基因新位点，并将它们定位于第３染色体的Ｇ１３１８和Ｒ１９２５及第４染色体的Ｃ８２０和Ｓ１１１８２之间。２．３种质资源的保存和利用

中国稻作历史悠久，稻区分布辽阔，经过长期自然与人工选择形成丰富的稻种资源。这些遗传资源长期保存的费用昂贵，随着搜集材料的增加，鉴定和淘汰重复的资源，筛选尽可能少的数目，保存尽可能多的遗传变异成为当务之急。

ＤＮＡ标记所检测的是作物基因组ＤＮＡ水平的差异，因而它非常稳定、客观。在分子图谱的帮助下对品种之间的比较可覆盖整个基因组，大大提高了结果的可靠性。这种研究可用于品种资源的鉴定与保存等。利用ＤＮＡ分子标记的方法对物种间ＤＮＡ水平的多态性资料进行统计分析，可以了解它们在遗传上的同源程度，确定核心种质资源，以便以最少的种质资源最大限度的代表资源的遗传多样性。分子标记可用来建立ＤＮＡ指纹库，根据种质资源ＤＮＡ指纹的多态性，可以对育种材料的变异丰富度作出总体评价并有效地鉴别品种及品种纯度。

朱作峰等用３０对ＳＳＲ引物比较了５２份不同生态型的栽培稻和３４份不同省（区）的普通野生稻（简称ＣＷＲ）的遗传多样性，发现在２８４条多态性带中，栽培稻与普通野生稻的差异主要来自野生稻。此外，籼稻品种与粳稻品种之间的平均遗传距离也明显大于籼、粳亚种内品种间的遗传距离，表明籼粳分化是亚洲栽培稻遗传分化的主流。

赵勇等利用１６对水稻功能基因的ＳＳＲ引物，研究了２３份世界５个国家不同来源的水稻品质资源的遗传多样性，证明水稻功能基因的ＳＳＲ标记是研究水稻资源分类、地理分布、生态类型和系谱分析的有效工具。杨庆文等用ＳＳＲ方法对云南元江普通野生稻３个自然居群进行３０个位点的遗传多样性分析。结果表明，元江普通野生稻具有较高的遗传变异水平，且群体遗传分化系数较大。朱明宇等对云南１７个村落的８２份品种及代表籼粳不同类型的３份标准样的遗传背景进行了ＳＳＲ分析，结果表明，８５份品种存在显著的遗传变异。

樊叶杨等应用７０个微卫星标记分析了３个籼稻测验种和３个粳稻测验种的多态性，发现其中３６个标记可以区分籼粳测验种。再以１８个籼粳品种进一步筛选，找到了分布于１２条染色体的２１个籼粳特异性微卫星标记。在这２１个标记中，２０个在籼粳亚种间带型相异，其中７个在亚种内带型一致，１３个在亚种内带型不一致；１个标记在１２个籼稻品种和１个粳稻品种检测到相同的带型，其余１１个粳稻品种具有另一种带型。２．４分子标记辅助育种

在遗传育种工作中，应用分子标记进行辅助选择（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ＭＡＳ）可以提高选择的准确率和育种效率。但迄今为止，在

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水稻中成功用于育种的例子并不多，其原因与下列因素有关：首先，基因定位基础研究与育种应用脱节，需要应用时必须重新建立群体，研究群体与育种应用群体的目的基因与标记基因之间的遗传距离不一致。两个基因之间相距较近时，不同群体之间的差异较小，若两个基因之间相距较远时，不同群体之间差异就较大。现在报道的已经定位的ＤＮＡ分子标记与目的基因之间的遗传距离一般都超过５．０ｃｍ，达不到标记辅助选择育种应用的要求。其次，由于ＤＮＡ分子标记技术起步较晚，许多与控制重要农艺性状目的基因紧密连锁的分子标记还没有找到和定位。第三，目前的连锁图谱大多都是以ＲＦＬＰ标记绘制的，在育种上不易应用，必须转化成ＰＣＲ标记。第四，目前ＤＮＡ分子标记的分析鉴定技术要求还比较高，成本也相对较高。现在分子标记进行辅助选择主要应用在抗病性基因及数量性状的改良等方面。

在抗白叶枯病的育种研究方面，ＹＯＳＨＩＭＵ－ＲＡ等通过ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ标记将来自不同组合的５个白叶枯病抗性基因Ｘａ１、Ｘａ３、Ｘａ４、Ｘａ５和Ｘａ１０聚合在一起；ＨＵＡＮＧ等运用ＲＦＬＰ和ＰＣＲ标记也在一个分离群体中筛选出同时含有４个白叶枯病抗性基因Ｘａ４、Ｘａ５、Ｘａ１３和Ｘａ２１的单株。薛庆中、黄廷友、彭应财、童海军、曹立勇、罗彦长等分别通过杂交和回交，结合分子标记辅助选择，将该基因导入不同的水稻亲本中，选育出一批抗白叶枯病的新恢复系和不育系，并进一步配组育成了协优２１８、中优２１８、Ⅱ优８２２０、国稻１号等抗病杂交稻新组合。

李仕贵等应用与稻瘟病抗性基因Ｐｉ－ｄ（ｔ）紧密连锁的微卫星标记ＲＭ２６２对含有该抗病基因的品种地谷与感病品种江南香糯和８９８７的Ｆ２群体进行ＭＡＳ选择，结果发现应用该标记的抗性纯合和杂合带型选择抗性植株的准确率达９８％以上。陈志伟等将稻瘟病抗性基因Ｐｉ－１导入受体亲本珍汕９７Ｂ、金山Ｂ－１、金山Ｓ－１等保持系中，用与Ｐｉ－１基因紧密连锁的分子标记ＲＭ２２４和ＭＲＧ４７６６同时对杂种后代Ｐｉ－１基因进行ＭＡＳ选择的准确率高达１００％，中选单株抗病性明显提高。

作物的许多重要的经济性状属于数量性状，受多位点数量性状基因（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，ＱＴＬ）控制。建立完整的、高密度的分子连锁图谱是研究ＱＴＬ的前提。虽然采用分子标记辅助选择对数量性状改良仍存在一些不足，但是通过分子标记辅助选择可以大大提高选择的效率已得到实践的证实。据邓启云、杨益善等报道，国家杂交水稻工程技术研究中心在马来西亚普通野生稻中鉴定出两个高产ＱＴＬｙｌｄ１．１和ｙｌｄ２．１均为具有显著增产效应的主效ＱＴＬ，并找到与其紧密连锁的分子标记（ｙｌｄ１．１位于ＲＭ９和ＲＭ３０６之间，ｙｌｄ２．１位于ＲＭ１６６和ＲＭ２０８之间），并成功地将其转入优良晚稻恢复系测６４－７及中稻恢复系９３１１和明恢６３中，育成了Ｑ６１１等携带野生稻高产ＱＴＬ的强优恢复系，进而选配出一批具有超高产潜力的杂交水稻新组合。

ＭＡＳ还用于水稻抗虫基因，抗逆性基因、野败型雄性不育恢复基因等方面的应用研究。

３结语

分子标记的出现已为多种作物育种提供了新方法和新途径，它以其分子遗传学的发展及分子标记技术的建立，使作物遗传育种进入了一个新阶段。虽然ＤＮＡ分子标记技术目前尚不完善成熟，因其效率低和成本高而不能单独使用，但是，随着分子生物学技术的不断完善，它会逐步趋近程序化而变得易于实施。分子标记技术在水稻育种上的优势会越来越明显，因此，将分子标记技术应用于水稻基因的研究，获得更多与目的基因紧密连锁的分子标记，用于目的基因的定位与克隆，实现分子标记辅助选择育种，加快性状的遗传改良进程，从而实现水稻育种突破性的进展。

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过选择创制具有特异性状的中间材料，并将其应用于常规育种的亲本选配当中，可提高育种材料水平，产生优异的后代个体。

一些研究表明，籼粳交后代的多数植株和多数性状均偏向籼稻。徐云碧等应用ＲＦＬＰ标计对窄叶青８号／京系１７的Ｆ２群体进行分析，发现籼型个体数明显多于粳型个体数。张再君等通过比较０２４２８／培矮６４和台中６５／特青两个不同的籼粳交组合Ｆ２程氏指数，其分布表现出正态分布，偏籼、偏粳的中间型占绝大多数。徐正进等应用程氏指数法研究籼粳稻杂交后代表明，籼粳交的Ｆ２接近正态分布。本研究中的粳／籼组合Ｆ２程氏指数分类结果也呈现正态分布，以偏籼类型居多。籼型、粳型的程氏指数性状以典型性状居多，偏籼、偏粳型的程氏指数性状多以交错状态存在。同时，粳／籼组合Ｆ２不同类型产量性状也有明显区别，籼型有较多的穗数、较少的总粒数、较高的千粒重、结实率和谷重。粳型有较少的穗数、较低的千粒重和谷重、较多的总粒数、较高的结实率。偏籼、偏粳中间型结实率变异幅度大，其它性状值介于籼型、粳型之间。这表明，在特定环境的条件下，籼粳亚种间杂交可通过选择不同的形态类型，创造具有不同的产量结构模式的育种材料及育成品种。

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研究报告赵一洲等

水稻不同类型杂种Ｆ２产量性状变异及籼粳分类研究

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