DNA提取方法
一、移液器使用
移液器（也称作“枪”）是所有分子实验操作不可或缺的工具，其正确使用是顺利开展各项实验的先决条件。为保证实验结果的准确性和稳定性，同时延长移液器的使用寿命，请大家细心操作并遵守以下使用规则和注意事项：
1.从未使用移液器或刚进入实验室的研究生，只有完全准确掌握移液器使用
规则后方可独立使用移液器。
2.按需要选用合适量程的移液器，调整刻度时，注意看移液器刻度表，不要
超过最大刻度。
3.装配吸头时，用力不要过猛，以免吸头难以脱卸，同时损坏移液器。
4.吸取液体时，注意要慢慢向上释放控制按钮以免吸入速度过快导致液体进
入移液器内。
5.切忌平放带有残液的吸头的移液器，更不能倒放。
6.使用移液器清洗或溶解固体物质等需反复吸打时，请装配多个叠加的吸
头，且调整刻度不超过移液器最大量程的一半。
7.移液器使用完毕，务必调到最大刻度，并稳妥地放回对应的移液器架上。
8.细心操作，如不小心使移液器表面沾到液体，请及时清洗干净；如不小心
将液体吸入移液器内，应及时清洗。
9.严禁用沾有放射性或腐蚀性物质的手套触摸移液器表面；严禁不熟悉移液
器构造者私自校对移液器刻度。
第一节叶片总DNA的提取
一、取样须知
1. 取样之前一般要先编号（牌子和离心管的编号）和挂牌，务必保证离心管中
的叶片是来自于同一编号单株，编号切勿混淆；
2. 为保证质量，所取样品尽量为幼嫩叶片组织，并尽量保证全程低温（使用冰
袋或碎冰）；
3. 取样时间最好在晴天或阴天上午叶面露水干后进行，尽量使样品不沾水及泥
土。
4. 如使用塑料袋装样品，切记将袋内空气排尽，以免在–70℃保存时塑料袋破裂导致样品混合。
二、试剂的配制
1. Tris-HCl ( 1.0 M/L, pH8.0 )
121.16g Tris-HCl 和43ml HCl 加dd H2O 定容至1 L.
2. EDTA ( 0.5M/L, pH8.0 )
186g EDTA和25g NaOH加dd H2O 定容至1 L.
3. 2％CTAB
81.9g NaCl
100ml 1.0 M/L Tris-HCl ( pH8.0 )
40ml 0.5M/L EDTA ( pH8.0 )
20g CTAB
加dd H2O 定容至1 L, 灭菌后即可用于DNA的提取。
4.5M/L NH4AC
385.4g NH4AC加dd H2O 定容至1 L
5.76％Ethanol( 含10mM NH4AC )
760ml无水乙醇和2ml 5M/L NH4AC，加dd H2O 定容至1 L.
6. 3M/L NaAc ( pH5.2 )
40.81g NaAc加dd H2O 定容至100ml, 并用HAC调pH值至5.2
7. 24 : 1
吸取22ml 异戊醇加到500ml 三氯甲烷中
8. RNAase
用dd H2O将RNAase的浓度调节为10mg/ml, 然后在沸水中煮10min，冷却，存于－20℃
三、提取方法
1.大量法
1)取10g左右的叶片放在－70℃冰箱冷冻备用，写好编号；
2)取5g叶片用液氮研磨成粉末状后装入50ml离心管中（最好为离心管体积的
1/3左右），盖好后马上放在冰上或是4℃冰箱内；
3)将离心管用泡沫架（实验室自制）支住放入55～60℃的水浴锅中水浴60分
钟，加入预热好的CTAB溶液20～25 ml（大约至离心管的1/2），用筷子搅拌每10分钟1次（要小心，防止污染）；
4)水浴完后盖紧盖子，轻轻放置于通风厨中室温冷却（大约30～60分钟）；
5)加入等体积的24：1溶液于管中，轻轻混匀数分钟，在3000～3200rpm离心
15分钟；
6)取上清夜转入另一编号相同的50ml离心管中，再加入等体积24：1溶液，轻
轻混匀数分钟，在3000～3200rpm离心15分钟；
7)将上清夜转至另一编号相同的50ml离心管中，加入冰冻的异丙醇2/3体积（－
20℃冰箱过夜），轻轻混匀，于－20℃冰箱放置，大约20～30分钟，用干净枪头将析出DNA挑出，置于10ml编号相同的离心管内；
8)加入76%酒精（10mM NH4AC）洗涤沉淀（可过夜），偶尔转动，重复2～3
次，直到沉淀物相当白为止；
9)倒出酒精，将DNA放置于管壁，室温下吹干，加入TE溶解，放入－20℃冰
箱备用。
注意：
1)混匀时，只有在第三步才能用力混合，其他步骤只能轻轻混匀，防止DNA
断裂或是不能成团；
2)加入24：1的过程中，注意更换枪头；吸取上清液时，动作要轻，不要将杂
质吸入，也不要用力导致液体回吸入枪中，造成污染；
3)离心机使用时要注意用天平平衡，卡子要卡好，防止发生事故；
4)50ml及10ml离心管使用前应清洗干净、灭菌、烘干后使用。
2.小量法
5)用写好编号的1.5ml或2ml离心管取1片叶片（大约1～2cm2）放在－70℃
冰箱冷冻备用；
6)取出离心管后臵于冰上，将叶片挑出臵于研钵中，加入600μl～1mlCTAB研
磨后，将液体倒回原离心管中；
7)将离心管放臵于离心盒板上，在55～60℃的水浴锅中水浴50～60min，轻轻
摇晃数次。放臵于通风厨中室温冷却（大约30～60 min）；
8)加入等体积的24：1溶液于管中，轻轻混匀数分钟，12000rpm离心15min；
9)将上清夜转至与原编号相同的1.5ml离心管中（离心管中事先加入1/10上清
液体积的NaAc），加入冰冻的无水乙醇（－20℃冰箱过夜），轻轻混匀，于－20℃冰箱放臵，大约20～30min，10000rpm离心2分钟，倒出乙醇（如果DNA量比较多的话，建议直接倒出乙醇或用枪头挑出DNA，再倒出乙醇）。
随后加入76%乙醇（10mM NH4AC）洗涤沉淀（可过夜），偶尔转动，重复1～2次；
10)轻轻倒出乙醇，将DNA放臵于管底，室温下吹干，加入TE溶解，放入－
20℃冰箱备用。
注意：
A.如果需要DNA质量高一些，可重复4步骤一次；
B.离心机要严格平衡，防止发生事故。
C.DNA溶解时需加入RNAase 除去其中的RNA，每个样加2μl.
Extraction of DNA from Leaf Tissue
1.Cut 20 mg of tissue into a 2 mL centrifuge tube containing 1 bead.
2.Add 1.0 mL of CTAB extraction buffer (add 2 μL/mL
mercaptoethanol CTAB prior to use).
3.Run samples on bead-beater for 1-2 minutes.
4.Incubate for at least 30 minutes at 60C.
5.Add 700 μL of chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
6.V ortex at maximum speed.
7.Centrifuge at least 10 minutes at 12,000 rpm.
8.Transfer 600 μL of the upper aqueous phase to a new tube.
9.Add 500 μL of cold isopropyl alcohol (stored in freezer).
10.Incubate at –20 C for at least 2 hours to overnight.
11.Centrifuge for 10 minutes at 12,000 rpm.
12.Dump supernatant slowly and ensure pellet does not come out.
13.Wash pellet with 500 μL 76% ethanol + 10mM sodium acetate.
14.Centrifuge for 10 minutes at 12,000 rpm.
15.Dump supernatant slowly.
16.Dry pellet in Vacuum Dryer for about 15 minutes.
17.Hydrate pellet with 100μL sterile distilled water.
Here is the procedure for 2% CTAB buffer from Mr. Mike Irey at US Sugar Corp.
Per 100 mL, add 2 g of CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 28 mL 5M NaCl, 4 mL 0.5M EDTA, 6.67 mL 1.5M Tris-HCl. Dissolve CTAB in 50 mL H2O at 60°C. Add remaining solutions and bring to volume with H2O. Adjust pH to 8.0. Add mercaptoethanol (2μL/mL) just prior to use.
本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。
一材料、试剂和仪器
1 材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
2 试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）
EDTA 50mmol/L （pH8.0）
NaCl 500 mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/L KAc
(4) RNaseA 10mg/ml
(5) 异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3. 仪器: 离心机，恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置
二实验程序
1取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。
2 向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动。
3 加入150μL 5mol/L KAc，混匀，置冰上20-30 min。
4 4℃,1
5 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30 min 。
5 12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O 或TE溶解DNA。
6 加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。
7 CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。
8 用400μL 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。
9 电泳检测完整性。
微量DNA 提取方法
1、快速微量提取法
1. 取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min，丢去上清夜，收集菌体。
2. 加入400μl裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠，1mMEDTA，1%SDS，pH7.8）混匀，置于37℃水浴1h。
3. 然后加入200 μl 5 mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
4. 取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
5. 加2倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ，pH8.0)，-20℃保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50μlTE溶液中，置4℃保存备用。
2、加热去蛋白法提取基因组DNA
试剂：
裂解液：10.95g蔗糖5ml 0.1 mmol/L MgCl2，2ml 0.5mmol/LTris·HCl （pH7.5），1ml TritonX-100，加灭菌双蒸水至，100ml；提取液：10ml 0.5 mmol/L KCl， 2.5ml 0.1mol/L MgCl2，2ml 0.5mmol/LTris·HCl（pH8.3），0.45ml NP-40，0.45mlTween-20，加灭菌双蒸水至100ml；蛋白酶K20mg/ml（贮存液）；TE缓冲液（pH8.0），0.2ml 0.5mmol/L EDTA （pH8.0），加水至100ml。
基因组DNA的提取
抗凝全血0.5ml加等量的裂解液，颠倒混匀后，4℃放置30min，离心3000rpm，10min，弃上清；用0.2ml提取液悬浮沉淀，加入10μl蛋白酶K（20mg/ml），颠倒混匀后，55℃水浴60min，沸水浴中保温10min；离心12000rpm，20min后，小心吸取上清’上清中加入2.5倍体积的冷无水乙醇，颠倒混匀后，-20℃静置30min，离心12000rpm，20min，弃去水相；沉淀用75%冷乙醇洗涤2次，同上离心，10min，弃去上清；在超净工作台中空气干燥10min，溶于20μl缓冲液中-20℃保存。