第四章、基因的分离与鉴定

微生物基因工程

授课内容

●（2学时）

●（3学时）

●（3学时）●（3学时）

●第五章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达●第六章转基因植物

●第七章转基因动物

●第八章基因治疗

●第九章蛋白质工程

第四章基因的分离与鉴定

1?1. DNA 克隆片段的产生与分离

?2. 重组体DNA 分子的构建及导入受体细胞?3. 基因克隆的实验方案

cDNA 互补作用基因克隆、基因克隆、

基因组DNA 克隆

4应用核酸探针、差别杂交或扣除杂交、?4. 克隆基因的分离

mRNA 差别显示技术酵母双杂交体系别显示技术、酵母双杂交体系

?5. 重组体分子的选择与鉴定

参考书目

z《基因工程原理》吴乃虎编著科学z

目的基因的分离与鉴定

四个基本的步骤：

构建基因文库（gene library）或叫DNA 文库

应用大肠杆菌作寄主进行DNA 克隆的综合实验方案DNA 片段核酸内切限

制酶消化机械切割双链cDNA 的

合成直接的化学合成粘性末端同载体

连接同聚物加尾连接平末端连接衔接物分子寄主

体外包装进噬菌体

导入寄主细胞噬菌体转染质粒转化外壳，噬菌体或

柯斯质粒转导

选择遗传免疫化学核酸杂交重组

4.1 DNA克隆片段的产生与分离

4.1DNA

4.1.1 基因组DNA的片段化

■产生片段群体要求：

产生片段群体方法

■产生片段群体方法：

?限制性内切酶（单酶、双酶）

4.1.2 DNA片段的大小分布

412DNA

■构建完全基因文库：

■编码目的基因的克隆片段的富集：?

?蔗糖梯度离心

123456789123456789

4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞4.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组

■考虑因素：

片段定向插入载体分子

■外源DNA片段定向插入载体分子：

非互补或平末端

■DNA分子的连接：

GGCC GGCC CCGG CCGG CCTGCAGG

Pst I 衔接物CCGG CCGG Hae III

GGACGTCC

T4多核苷酸激酶

ATP p CC GG GG CC p p CCTGCAGG GGACGTCC p

T4DNA p CCTGCAGG CC GG CCTGCAGG

GG CC T4 DNA 连接酶GGACGTCC GG CC GGACGTCC p Pst I

p GG CC GG CCTGCA

ACGTCC GG CC GG p

附加衔接物

HO p OH HO p

HO OH HO p HO

HO OH HO p HO OH

T4 DNA 连接酶ATP HO OH

p OH

多核苷酸激酶ATP

HO p

同聚物加尾

4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞4.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组

佳连接应

■最佳连接反应：

低浓度的DNA(20μg/ml)，自连

自连

高浓度的DNA(300~400μg/ml)，多连体分子

4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞4.2.2 重组体分子导入受体细胞的途径

■转化：

■体外包装的噬菌体的转导：

4.3 基因克隆的实验方案

从生物有机体中克隆某一特定DNA片段(或基因)的实验程序Clarke-Carbon公式：

例子：从人类基因组DNA(3 ×106)，克隆β-珠蛋白基因(1.5 kb)

= 9.2 ×10

不同生物的全基因组文库应具有的理论克隆数和实际克隆数克隆片段

的平均大

小(bp)基因组的大小（bp

）2 ×106 (细菌) 2 ×107(真菌) 3 ×109(动物)(p)理论实际理论实际理论实际5×103

400 1831 4000 18418 600000 276311010×103

200 919 2000 9208 300000 138155020×103

100 458 1000 4603 150000 69077440×103 50 278 500 2300 75000 345386注：理论克隆数：供体生物的基因组DNA 总量/克隆片段的平均大小

实际克隆数：按照Clarke-Carbon 公式计算的

4.3.1 互补作用基因克隆

431

如果被克隆的DNA片段，同重组体DNA分子的寄主细胞的染色体DNA是同源的，那么使用互补作用进行基因克隆，将是种十分有效的方法。

一种十分有效的方法。

最简单的方式：将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，即一组含有大杆菌基组全部分的组含有大肠杆菌基因组全部DNA序列结构的重组体DNA分子的异源群体，导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞。然后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需的底物的基本培养基上。因此，只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞才能会长成转化子菌落。

432cDNA

4.3.2 cDNA基因克隆

?为什么要进行cDNA基因克隆：

100倍

15%左右

15 000种

?cDNA克隆的基本过程：

DNA克隆的基本过程

通过一系列的酶催化作用，使总poly(A) mRNA转变成双链

cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化到大肠群体并插入到适当的载体分上然后再转化到大肠

杆菌寄主菌株的细胞内

ˊ AAAAAA 3

ˊ AAAAAA 3Oligo(dT)NaOH 降解DNA

GGG

GG SI 末端转移酶CCC

末端转移酶，

以质粒为载体构建cDNA 文库

?cDNA文库构建的步骤

(i)分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的部分

纯化的原理及步骤：

mRNA分子占细胞总RNA的1%-2%

(ⅱ) 合成第一条cDNA链

g()引导的合成法

A.oligo(dT)cDNA

B. 随机引物引导的cDNA合成法

原理：

(完整版)质粒DNA的提取、纯化与鉴定

分子生物学实验报告题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定姓名：学号：班级：时间：一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化：电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可

荧光定量PCR、基因克隆和基因测序

临床分子生物学 1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。（1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。（2）方法： 1、引物设计遵守的原则 2、探针设计遵守的原则 3、RNA提取 4、逆转录逆转录成cDNA 5、常规PCR扩增（1）反应体系（2）混匀，瞬时离心。（3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。（5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。 6、实时荧光定量PCR扩增目的基因用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μl，分别加入30μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。 7、基因相对拷贝数的检测与计算 8、统计学分析

2019_2020高中生物专题1基因工程2第2课时目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定检测含解析人教版选修3

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( ) 答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D 正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是( ) A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA 上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是( ) A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A 解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是( ) A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定濮阳市疾病预防控制中心许银怀第一节概述志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容：细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据；缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍；志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大；洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化；目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。第二节病原学一、抗原分类志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

人教版高中生物选修3检测目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定

第2课时将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定一、选择题题型一目的基因导入受体细胞 1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是() 选项受体细胞导入方法 A 棉花细胞花粉管通道法 B 大肠杆菌农杆菌转化法 C 羊受精卵显微注射技术 D 小麦细胞基因枪法答案 B 解析花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的，A正确；将目的基因导入微生物细胞，常采用感受态细胞法(Ca2＋处理法)，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；双子叶植物和裸子植物常用农杆菌转化法导入目的基因，单子叶植物(如小麦)可用基因枪法导入目的基因，D正确。 2．农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后，目的基因插入的位置是() A．Ti质粒上 B．受体细胞染色体的DNA上 C．T-DNA D．农杆菌的拟核答案 B 解析在农杆菌转化法中利用农杆菌的T-DNA将目的基因整合到受体细胞染色体的DNA上。 3．目前将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是() A．显微注射法B．农杆菌转化法 C．基因枪法D．花粉管通道法答案 A

解析显微注射法是迄今为止将目的基因导入动物细胞中采用最多、最有效的一种方法。 4．在基因工程技术中，需要用氯化钙处理的环节是() A．目的基因的提取和导入 B．目的基因与载体结合 C．将目的基因导入受体细胞 D．目的基因的表达答案 C 解析如果载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，使其成为感受态细胞，使含有目的基因的重组DNA分子更容易进入受体细胞，目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的复制而复制。 5．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞的主要原因是() A．结构简单，操作方便 B．繁殖速度快 C．遗传物质含量少，易操作 D．性状稳定，变异少答案 B 解析微生物一般具有以下几个特点：①个体微小，结构简单；②繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代；③代谢类型多，活性强；④易变异，相对于高等生物而言，较容易发生变异。在基因工程中，主要是利用它快速繁殖的特点，可以提供更多的基因工程的产物。 6．目的基因整合到某作物DNA片段上后() A．改变了原DNA的碱基排列顺序 B．改变了原DNA上各基因的碱基排列顺序 C．改变了原DNA上各基因的复制过程 D．改变了原DNA上各基因的转录过程答案 A 解析目的基因整合到某作物的DNA片段上后，不能改变其他基因的碱基序列，也不能改变基因的复制和转录过程，B、C、D错误；只能改变原DNA的碱基排列顺序，A正确。 7．人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体加工合成。通过转基因技术，可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是() A．大肠杆菌B．酵母菌

肌动蛋白的克隆与鉴定

β—肌动蛋白的克隆与验证李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。[2] 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR 1材料与方法 1.1 组织细胞DNA提取。[3] 1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。 1.1.2 方法取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以

BOP基因的克隆及鉴定

Bop基因克隆摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。关键词：基因克隆；PCR；BOP基因第一章 1.前言 1.1 基因工程狭义上仅指基因工程。是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；

下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。广义的基因工程是一个高度的统一体：上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。---基因工程产业化的基本原则。基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。[1] 1.2 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将

目的基因(COR)转入细菌细胞的方法及其检测

目的基因（COR）转入细菌细胞的方法及其检测 XXX （XXX农业与生物技术学院，XXX XXX，XXX）摘要：以PGEM-T-easy质粒为载体，将氨苄青霉素抗性基因导入大肠杆菌，通过含有氨苄青霉素的培养基筛选出具有氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌，对筛选出的大肠杆菌进行质粒DNA提取,并对质粒进行PCR扩增和酶切，将产物进行琼脂糖凝胶电泳图谱分析。结果表明：氨苄青霉素抗性基因被导入大肠杆菌中并在大肠杆菌中得到表达。关键字：PCR扩增氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌引言：随着生物科技的飞速发展，越来越多的生物技术被广泛的应用于各类应用领域。如PCR技术、基因重组、DNA连接等等已被人们广泛的应用于生物体内基因的扩增及新的生物性状的研究。然而，对于氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达尚未见研究。本研究借助于PCR、DNA连接转化、琼脂糖凝胶电泳对氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达进行了研究。旨在为氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌染色体上整合及表达提供一定的理论依据。 1 材料和方法 1.1 试剂与器材 1.1.1 材料试剂：大肠杆菌；PGEM-T-easy质粒；Taq酶；引物(正向、反向； 10umol/ml)；模板DNA；10×RCRbuffer；ddH 2O；dNTP（2.5mol/L）；T 4 DNAligase； Cacl 2 （0.1mol/L）；LB培养基；氨苄青霉素（50mg/ml）；溶液Ⅰ（葡萄糖，50mmol/L；Tris-HCl，25mmol/L；EDTA，10 mmol/L）；溶液Ⅱ（0.4mol/LNaOH和2%SDS用前等体积混合）；溶液Ⅲ（5mol/L乙酸钾，60ml；冰醋酸，11.5ml；水，28.5ml）；TE缓冲液（pH8.0）；0.5mol/LEDTA；70%乙醇；氯仿：异戊醇（V:V，24：1）；Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇（V:V：V，24：24：1）；琼脂糖。 1.1.2 器材：PCR扩增仪；移液枪；电泳仪；紫外检测仪；恒温摇床；恒温水浴器；恒温培养箱；低温离心机；超净工作台；冰箱；离心管；小指管；酒精灯；牙签；培养皿、试管若干。 1.2 方法 1.2.1 PCR基因扩增 1.2.1.1 加样：

基因分离克隆和功能鉴定.

动物遗传学读书报告之新基因的分离克隆及功能鉴定学院班级：动物科技学院动物科学10级2班新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展前言随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。 1. 基因的分离克隆基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。 1.1基因的分离克隆主要方法基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将

这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。 1.1.1功能性克隆通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly —A 序列指导合成poly —T 的3’端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。 1.1.2同源性序列克隆技术随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库

高中生物第4章基因工程第2节基因工程的操作程序第2课时目的基因的导入和检测同步备课教学案北师大版

第2课时目的基因的导入和检测 [目标导读] 1.结合教材P77～81图文，阐明目的基因的导入的四种方法。2.分析教材P81～83内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。 [重难点击] 1.目的基因的导入方法。2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。一、目的基因的导入 1．花粉管通道法(如图)

(1)概念：是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。 (2)实验：利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序 ①原理：授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。 ②操作过程 a．提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01%的溶液。 b．用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。 c．第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。 d．0.5～1 h后用一定浓度的DNA溶液涂抹柱头。 e．收获种子，种植，进行抗虫性检测。 (3)特点 ①优点：简单经济、快捷实用，且不受植物基因型的限制，理论上适用于任何开花植物。 ②缺点：工作效率较低，且后代的遗传情况较复杂。 2．氯化钙法 (1)适用条件：运载体是质粒，受体细胞是大肠杆菌。 (2)作用原理：氯化钙使大肠杆菌细胞成为感受态细胞，细胞膜的通透性发生变化，允许含有目的基因的运载体分子进入。 (3)过程

2017-2018学年高中生物第一章基因工程第一节基因工程概述-导入检测和鉴定目的基因同步备课教学案

第3课时导入、检测和鉴定目的基因 [学习导航] 1.理解目的基因导入受体细胞的方法。2.掌握检测与鉴定目的基因的方法。[重难点击] 1.目的基因导入受体细胞的方法。2.检测和鉴定目的基因的方法。方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取及基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测和鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。一、导入目的基因将目的基因导入受体细胞的方法和过程 1．农杆菌转化法的分析

(1)将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？答案基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。 (2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上？答案农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。 2．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？答案植物体细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程形成完整植物体，因此受体细胞可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。 3．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？答案微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。 1．农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是____________，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T－DNA片段，它具有可转移至受体细胞并整合到受体细胞________上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_______(部位)即可。

人类疾病基因的鉴定与分离

人类疾病基因的鉴定与分离医学遗传学研究的一项重要任务就是建立基因型与表现型之间的关系，也就是寻找疾病的致病基因。通过本课程的学习，将让学生明确分离单基因病致病基因及复杂疾病易感基因的基本思路与常用方法，本课程主要内容包括：基因的基本结构，突变与多态，常用的突变检测方法，不同多态的分型技术，连锁分析的原理，Lod score的计算，Hardy-Weinberg 平衡定律，关联分析的原理及应用，样本量估计，以及复杂疾病分析中的常用统计方法，分子病理。 This course is designed to give students a practical knowledge of the principles and practice of Medical Genetics which will allow them to evaluate, choose and interpret appropriate genetic investigations for individuals, families and populations with genetic disease. Also，we aim to ensure students develop the skills to know how to make the connection between genotypes and phenotypes by using of linkage analysis, mutation analysis, association studies. The major fields of this course involve: gene structure, mutation and polymorphism (RFLP, STR, SNP), linkage analysis, Lod score, Hardy-Weinberg equilibrium, association study, genotyping techniques, sample size calculation, common used statistical analysis，molecular pathology.

转基因植物的检测与鉴定

收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #

4.2.2 目的基因的导入和检测学案(含答案)

4.2.2 目的基因的导入和检测学案（含答案）第第2课时课时目的基因的导入和检测目的基因的导入和检测目标导读 1.结合教材P7781图文，阐明目的基因的导入的四种方法。 2.分析教材P8183内容，掌握目的基因的检测与表达产物的测定。重难点击 1.目的基因的导入方法。 2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。方式一通过前面的学习，我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA 分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆cloning。方式二目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外

源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。一.目的基因的导入 1.花粉管通道法如图1概念是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞，借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。 2实验利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序原理授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞.合子或早期胚胎细胞。操作过程a.提取含目的基因的总DNA或者质粒DNA，配成质量分数为0.01的溶液。b.用棉线捆住将要在第二天开花的花朵，不让花朵自动开放。c.第二天清晨给花朵进行人工授粉，授粉后套袋，作好标记。d.0.51h后用一定浓度的DNA溶液涂抹柱头。e.收获种子，种植，进行抗虫性检测。 3特点优点简单.经济.快捷实用，且不受植物基因型的限制，理论上适用于任何开花植物。缺点工作效率较低，且后代的遗传情况较复杂。

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

姓名宿智新学院生命科学学院班级 11级生工2班科目分子生物学实验学号 201100140155 第 8 组质粒DNA的提取、纯化与鉴定摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5α（E.coli DH5α）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。关键词：碱变法质粒电泳实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。