荧光分析法

S2

S 1

S0

T1吸

收

发

射

荧

光

发

射

磷

光

系间跨越

内转换振动弛豫

能量

l l

l

3

外转换

l'

2

T2

内转换

振动弛豫

第一节荧光分析法的基本原理（2）

(二) 有机化合物分子结构(molecular structure)与荧光(fluorescence)的关系

1. 分子产生荧光必须具备的条件

（1）具有合适的结构：强的紫外-可见吸收；

（2）具有一定的荧光效率。

2. 有机化合物的结构与荧光

(1）跃迁类型：π→ π*跃迁的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；

(2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移(3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。

(4）取代基效应：芳环

上有供电基团，使荧光

增强。

综上所述：具有π→π*跃迁，

长的共轭结构，刚性平面以

及具有供电子基团的一类化

合物，有利于荧光的产生。

(三) 荧光试剂：为了提高测定的灵敏度和选择性，常使弱荧光物质与某些荧光试剂作用，以得到强荧光性产物，扩大荧光分析法的应用范围。常用的荧光试剂有：

1 荧光胺(fluorescamine)：能与脂肪族和芳香族伯胺形成高度荧光衍生物；

2 邻苯二甲醛(OPA)：

3 1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘(Dansyl-Cl，丹酰氯）：

4 测定无机离子的荧光试剂：

三影响荧光强度的外部因素：

1.溶剂的影响：一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强

而长移，荧光强度也增强。

2.温度的影响：荧光强度对温度变化很敏感，温度增加，外

转换去活的几率增加，使荧光效率和荧光强度降低。

3. 溶液pH：对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格

控制；

4. 荧光熄灭剂：又称荧光猝灭，是指荧光物质分子与溶剂分

子或其他溶质分子相互作用引起荧光强度降低的现象。

引起荧光熄灭的物质称为荧光熄灭剂(quenching medium)。

如果荧光熄灭强度与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系，

可以利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。

5. 散射光(scattering light)：当一束平行单色光照射在液体样

品上时，大部分光线透过溶液，小部分由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。有两种情况：

瑞利光(Reyleigh scattering light)：光子和物质分子发生弹性碰撞时，不发生能量的交换，仅使光子的运动方向发生改变，这种散射光称为瑞利光（非拉曼光）。

拉曼光(Raman scattering light)：光子和物质分子发生非弹性碰撞时，在光子运动方向发生改变的同时，光子与物质分子发生能量的交换，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种散射光称为拉曼光。

散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光更长的拉曼光，因其波长与荧光波长接近，对荧光测定的干扰更大，必须采取措施消除，一般选择适当的激发波长可消除拉曼光的干扰。

5种常用溶剂在不同波长激发光照射下拉曼光的波长：

以硫酸奎宁为例：

第二节荧光定量分析方法

要求：

1.掌握荧光强度与物质浓度的关系，定量分析方法；

2.了解荧光分光光度计与荧光分析技术新技术。

一荧光强度与物质浓度的关系：

由于荧光物质是在吸收光能而被激发之后才发射荧光的，因此溶液的荧光强度与该溶液中荧光物质吸收光能的程度以及荧光效率有关。

)激发后，可以在溶液的各溶液中荧光物质被入射光(I

个方向观察荧光强度(F)。但由于激发光的一部分被透过，因此，在激发光的方向观察荧光是不适宜的。一般是在与激发光源垂直的方向观测。

设溶液中荧光物质浓度为C，液层厚度为L。荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度，即：

F∝(I 0-I)

为常数，其值取决于荧光效率根据Beer 定律

ECl I I -=100（2）

将(2)待人(1)，得)1()10

1(3.20'0'ECl ECl e I K I K F ---=-=即()()()???????????? ?????+-+-+-+-=!33.2!23.2!13.211320'ECl ECl ECl I K F ()()???

????????-----=!33.2!23.23.2320'ECl ECl ECl I K （3）)

(0'I I K F -='K （1）

根据，在低浓度时，溶液的荧

光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；但当

ECl>0.05时，(3)式括号中第二项以后的数值就不能忽略，此时荧光强度与溶液浓度之间不呈线性关系。

KC ECl I K F ==0'3.2KC ECl I K F ==0'

3.2为荧光定量分析法的依据。若浓度C 很小，ECl 之值也很小，当ECl ≤0.05时，上

式第二项以后的各项可以忽略。所以

KC

ECl I K F ==0'3.2（4）

荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，是因为：

荧光分析法中与浓度相关的参数是荧光物质发射的荧光强度，测量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上检测所发射光(荧光)的强度信号，测定的灵敏度取决于检测器的灵

敏度，可以通过增大检测信号的放大倍数来提高灵敏度，使极微弱的荧光也能被检测到，可以测定很稀的溶液；而在分光光

/I)，是一个比值，如度法中与浓度相关的参数是吸光度(A=lgI

果增大检测器的放大倍数，检测到的入射光强度和透射光强度同时增大，比值仍然不变，对提高检测灵敏度不起作用，所以，荧光分析法的灵敏度比紫外分光光度法高，一般要高2~3数量级。

二、定量分析方法

1 依据：荧光强度与荧光物质浓度的关系，在低浓度时二者成线性关系：F=KC

2 荧光定量分析方法：

(1)校正曲线法：配制空白溶液以及一系列浓度梯度的待测物的标准溶液，试样经过相同的处理之后分别测定荧光强度：F 0、F s 、F x ，然后作（F s -F 0）—C 曲线，根据（F x –F 0)，从工作曲线上求得待测物的浓度（或含量）。

(2) 比例法：如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点，就可选择其线性范围，用直接比较法进行测定：

F s -F 0= KC s ，F x -F 0 = KC x s s x x C F F F F C ?--=00

例题：1g谷物的制品试样，用酸处理，分离出核黄素(V

B2

)

及少量无关杂质，加入少量KMnO

4

，将核黄素氧化，过量

的KMnO

4用H

2

O2除去。将此溶液移入50ml容量瓶中，稀释

至刻度。吸取25ml放入样品池中以测量荧光强度（核黄素

中常含有荧光的杂质叫光化黄）。事先将荧光计用硫酸奎宁调整至刻度100处。测定得到氧化液的读数为6.0格。加入少量的连二亚硫酸钠(Na

2

S2O4)，使氧化态核黄素（无荧光）重新转化为核黄素，这时荧光计读数为55格。在另一样品池中重新加入24ml被氧化的核黄素溶液，以及1ml核黄素标准溶液0.5μg/ml，这一溶液的读数为92格，计算每克样品中含

核黄素的μg数？(课本P

230

7题)

解：25ml 氧化液：荧光读数6.0格，相当于空白背景；

25ml 测定液：荧光读数55格，实际核黄素的荧光读数为55-6.0=49格；

24ml 氧化液+1ml 标准核黄素：荧光读数92格；标准核黄素0.5μg/ml ：荧光读数92-6=86格；样品溶液的浓度为：

)25/(2849.086495.0ml g μ=?1g 谷物配成50ml 溶液，取25ml 测定，故谷物中核黄素为：

)/(5698.025

502849.0g g μ=?

第三节荧光分光光度计和荧光分析新技术

一荧光分光光度计(fluorospectrophotometer):

1 主要部件：主要由四个部分组成即激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角

2 仪器的校正：

(1)灵敏度的校正：

(2)波长校正：

(3)激发光谱和荧光光谱的

校正：

二荧光分析新技术简介

1 激光荧光分析法

2 时间分辨荧光分析

3 同步荧光分析

4 胶束增敏荧光分析

作业：课本P

229