分子生物学考试总结

PART Ⅰ基因

（略）

PART Ⅱ原核基因表达体系

第五章细菌转录

1、简介：转录产生的RNA链代表了DNA双链的一条链。新合成的RNA链为5’-3’，而模板链为3’-5’。转录出来的RNA 排列与编码链相同。RNA合成由RNA聚合酶催化。转录起始于RNA聚合酶与DNA上的特定区域的结合——启动子（promoter），这作为转录的开始。从启动子开始，RNA聚合酶沿着模板链移动合成RNA，直到到达终止子（terminator）序列。这一反应决定了转录单位的形成，即从启动子至终止子的序列均为转录单位，这一区域可能包含不止一个基因。序列优先从起始点（转录RNA的第一个碱基）。起始点以上的被称为上游，以下的被称为下游。转录的直接产物被称为初始转录本。它包含了从启动子至终止子的5’-3’的全部信息。然而，转录起始本通常被直接修饰。原核细胞中，它直接被降解（mRNA），或者切割成为成熟的tRNA或者rRNA。转录只是基因表达以及调控的第一阶段。调控蛋白决定了到底是哪一部分的基因能够被RNA聚合酶转录。这一步骤决定了基因的转录与否。本章需要谈论的问题主要有两个。1、RNA聚合酶究竟是怎样找到DNA上的启动子序列的？推广这一问题为：究竟蛋白质是怎样阅读DNA上的序列来找到特定的结合位点的？

2、调控蛋白是怎样与RNA聚合酶相互作用来启动或者抑制转录的起始、延长、或者终止过程的？

2、转录发生在转录泡中：在通常意义上的转录过程中，RNA一般合成于“转录泡”中，转录泡为解开双螺旋的DNA 双链。RNA链沿着5’-端向3’-端合成。游离核苷酸的3’-OH与DNA链上的核苷酸的5’-P相互作用，合成RNA链。RNA 聚合酶与启动子结合后就会解离DNA双链形成转录泡。当RNA聚合酶沿着DNA模板移动时，其沿着解旋点（unwinding point）解开DNA双螺旋，并且在重旋点（rewinding point）重旋DNA。转录泡的长度一般为12-14bp，但是RNA-DNA 杂交链区域的长度为8-9bp。

3、转录反应有三个阶段：转录可以被简单的分为三个阶段，起始阶段：启动子识别、转录泡的形成、以及RNA合成开始。延长阶段：转录泡沿着DNA移动。终止阶段：RNA转录本释放、转录泡关闭。

起始阶段开始于模板识别，RNA聚合酶与DNA双链上的启动子结合形成闭合复合体。之后，RNA聚合酶使DNA双链解旋形成开放复合体，使模板链能够进行接下来的核糖核苷酸合成。转录泡从启动子开始进行局部解旋形成，RNA 聚合酶催化这一过程。接下来是RNA核苷酸键的合成。RNA聚合酶保留在启动子区域同时合成最初的9bp的核苷酸键。RNA聚合酶释放最初合成的短的转录本，之后开始重新合成RNA。起始阶段的终止于聚合酶成功的延伸最初序列以及启动子序列的确定。

延长阶段：延长阶段中，聚合酶沿着模板DNA链从3’-5’合成5’-3’的RNA链。核苷酸加到3’-自由的羟基上。

终止阶段：聚合酶与终止子结合，此时，不需要额外的碱基加到链中。若要终止转录，磷酸二酯键的形成必须终止。转录复合体必须分离。酶以及RNA分离，DNA序列恢复双螺旋。

4、酶移动依赖于其晶体结构：1）RNA聚合酶包含一个小沟使得DNA在其中通过，细菌聚合酶的小沟可以容纳16bp，而真核聚合酶能够容纳25bp长度。聚合酶表面主要是负电荷覆盖，而小沟里面则为正电荷（主要是激活位点富集的Mg++），因此可以和DNA表面带负电荷的磷酸基团相互作用。2）RNA聚合酶主要由以下结构组成：钳子（clamp）、蛋白舵（Rudder）、蛋白墙（Wall）、蛋白桥（Bridge）以及蛋白颌（jaw）。3）DNA在蛋白颌的引导下进入小沟，在激活位点附近DNA双链解开，蛋白钳子将上面一条链夹住，蛋白桥通过自身构象的弯曲-直立，使得下面一条DNA

模板链的构象改变，使DNA碱基朝外，每配对一个核苷酸，就翻过来一个，以此来来控制核苷酸进入激活位点。在蛋白墙的作用下模板链形成DNA-RNA杂交链，RNA在蛋白舵的作用下以单链的形式脱离聚合酶，同时DNA恢复双螺旋。

5、噬菌体T7 RNA聚合酶是一种很重要的模式系统：T3以及T7噬菌体RNA聚合酶有单个亚基，能够以最低限度的活性识别很小数量的噬菌体启动子。T7 RNA聚合酶有一种特定的环（β折叠丝带）能够和启动子的-7~-11结合，同时-1~-4进入激活位点。

6、细菌RNA聚合酶有多个亚基组成：1）E.coli中有一种单独类型的RNA聚合酶表现出了几乎所有的mRNA、rRNA、tRNA合成活性。2）RNA聚合酶全酶由四种亚基组成，2个α亚基（每个40kD），功能为酶的组装、启动子的识别、与一些激活因子结合；β、β’亚基（160kD）催化中心，模板链以及编码链都与β、β’亚基作用，位点主要位于转录泡以及下游序列；σ亚基（32-90kD）与启动子的识别有关。

7、启动子识别依赖于一致性的序列：细菌启动子主要由四种保守元件（或者五种）组成。1）起始点（startpoint）：

通常>90%情况下为一个嘌呤（起始位点为5-9bp长）。2）-10区序列：起始点上游有6bp的序列在几乎所有的启动子中都能够找到，这六个序列中间一个到起始点相隔10bp，因此称为-10区，其六个一致性序列为TATAAT。3）-35区序列，六序列：TTGACA。4）-35区与-10区之间为分隔区，占到了启动子序列的90%，从15bp到20bp不等。这段距离对于RNA聚合酶的几何学距离有很大作用。5）有一些启动子在上游远一些的距离还有一段A-T富集序列。这被称为UP元件。它与RNA聚合酶的α亚基作用，在编码rRNA的基因中较多。

8、突变能引起启动子效率的上调或者下降：1）-35区的突变通常影响RNA聚合酶与DNA的最初识别。因此我们可以将-35区视为识别结合域。2）-10区域的突变通常影响DNA的解链，会将开放复合体闭合。因此我们可以将-10区视为解链区。因为-10区A-T富集，使其打开需要的能量较少。3）RNA聚合酶结合过程：首先与-35区的RNA聚合酶最初接触，其次闭合包围启动子区域，最后在-10区解链DNA形成开放复合体。

9、替换σ因子可能控制转录起始：1）E.coli有很多σ因子，每一种都会使得RNA聚合酶与不同的启动子结合。2）σ70被用于一般性的转录调控。其他的σ因子只在特殊条件下被激活。3）σS用于逆境胁迫、σ32用于热击作用、σE同样用于热击作用、σ54用于氮素缺乏、σ28用于鞭毛合成。4）σ因子调控启动子的识别：σ70全酶识别一种启

动子，当替换σ因子之后则导致聚合酶识别另一种启动子。

10、σ因子直接与DNA互作：1）E.coli 的σ70因子由一些保守序列组成，2.1，2.2区与核心酶互作，2.3作用于DNA 解链，2.4,4.2与-10区、-35区的启动子元件相作用。1.1,1.2区的N-端序列阻止没有核心酶的情况下2.4,4.2区与DNA 的结合。其中，2.4区组成α-螺旋与-10区编码链的特定碱基作用。Thr、Gln→T，Trp、Tyr→A。2）σ因子的N端序列与DNA结合域结合其与DNA的结合。当开放复合体形成之后，N-端序列绕过20A的距离，与DNA结合域分离。

10、σ因子可能有组织的进行级联反应：1）在噬菌体SPO1感染枯草芽孢杆菌的过程里面，涉及到基因表达的三个阶段，早期基因、中期基因、晚期基因，他们之间的换转是通过σ因子来调控的。2）早期基因表达时，σ43引导细菌全酶识别噬菌体的启动子。之后，基因28表达新的σ因子替换细菌σ43因子。中期时，gp28-核心酶转录噬菌体中期基因，中期基因33和34编码新的σ因子替换gp28σ因子。晚期时，gp33-gp34核心酶转录噬菌体晚期基因。但是这其中的机理目前还不得而知。

11、转录的终止——细菌RNA聚合酶在分离的位点终止：1）对于终止子我们并没有一个准确的定义，转录通常表现为3’-末端的初始转录本被切割，之后并不特别表现为在某一位点RNA转录停止。因此，我们只是找到了两类转录终止子的特征。1、细菌以及噬菌体中终止子的序列与最后加到RNA上的序列不同，终止依赖于模板或者产物的校正机制。2、许多终止子需要一种发夹结构来停止RNA转录。这意味着转录终止并不仅仅依赖于DNA序列的校正机制，还依赖于RNA产物自身的结构。2）一些终止子的终止作用会被抗终止而导致酶继续转录终止子之后的序列。这一过程被称为通读。

12、E.coli中两种类型的终止子：1）第一类为内在终止子（intrinsic terminator），这类终止子可以在核心酶缺乏其他因子的情况下终止转录；第二类为Rho-依赖型的终止子，这类终止子需要外源的Rho（ρ）因子来协助终止。2）内在终止子的终止机制：内在终止子有7-20bp的回文序列区来帮助形成发夹结构，发夹结构环中主要为G-C富集区，发夹结构之后为一系列的U残基。这两段通常距离很短，一般大约为7-9bp。点突变的研究结果表明，发夹结构减慢了RNA聚合酶的合成速度，之后下游的U-富集区域使DNA-RNA杂交链不稳定化，通常情况下，rU-dA键碱基配对结构不稳定，容易解链，因此我们可以看到RNA上U-富集区域与DNA链上A-T对相对应，这说明A-T对在转录起始以及终止过程均起到重要作用。3）入噬菌体的终止因子：Nus因子在转录终止中起作用。内在转录终止子需要NusA，NusB-S10蛋白参与Rho-依赖型的转录终止。NusB-S10蛋白与nus的boxA序列结合，NusA与nus的boxB序列结合。NusA增加了RNA聚合酶在转录终止子附近暂停的趋势（其对其他二级结构也起到同样的作用）。NusB以及S10组成的二聚体与包含boxA的RNA结合。NusG可能起到降所有的Nus因子组装成复合体从而与RNA聚合酶结合的作用。4）内在终止子与Rho-依赖型的终止子需要不同的Nus因子，内在终止子需要NusA因子，这个终止作用被pN蛋白阻断。Rho-依赖型的终止需要所有四种Nus因子，同样pN可以阻断这种终止作用。通常认为pN蛋白与NusA因子结合从而起到抗终止的作用。

13、Rho因子究竟是怎样起作用的？1）Rho依赖型的终止子占到大肠杆菌终止子的一半左右，Rho因子需要与车辙序列（rut sequence）结合来发挥作用。车辙序列为一段C富集G缺乏序列，位于转录终止子上游。2）Rho因子分为两部分，N-端RNA结合结构域以及C-端ATP酶结构域。组成一个六聚体结构，其5’-端与RNA结合形成二级结构，RNA绕其一圈，从5’-端出去。3）作用过程：1、RNA聚合酶转录DNA。2、Rho与RNA上的车辙序列结合。3、Rho 沿RNA运动。4、RNA聚合酶在发夹结构处停止，之后Rho因子追上。5、Rho因子解旋DNA-RNA杂交链。6、终止

作用：所有的组分释放。4）Rho因子可能将转录以及翻译产生联系，在野生型中，核糖体与mRNA结合会抑制Rho 因子的结合或者运动，当翻译完成之后，核糖体脱落，Rho因子追上RNA聚合酶，转录终止，所有组分脱落。

14、抗终止作用是一种调控：1）抗终止是一种转录控制机制，其阻止转录终止于终止子，使RNA聚合酶越过终止子继续转录。2）通读：转录以及翻译中的通读现象发生于RNA聚合酶或者核糖体由于模板或者是辅助因子作用而忽视终止信号的现象。3）抗终止蛋白允许RNA聚合酶转录终止子之后的序列。4）最佳的研究例子为入噬菌体。宿主RNA 聚合酶转录入基因并且在t位点终止。N基因控制噬菌体早早期基因以及晚早期基因的转录，pN允许其通读到终止子之后的L以及R1单位，这样晚早期基因就会转录。Q基因控制噬菌体晚期基因的表达，pQ允许其通读到R’终止子。pN作用于nut位点，pQ作用于qut位点，这些位点都位于转录单位的不同位置。nut L位于起始位点附近，nut R位于终止子之前。Qut位于启动子之间。5）抗终止蛋白的作用位点：抗终止子蛋白与转录终止子上游的序列结合。抗终止子的结合位点可以是启动子部分也可以是转录单位内序列。6）pN以及pQ的终止机理：pN蛋白与RNA链上的boxB 序列结合，再与Nus因子复合体中的NusA、RNA聚合酶结合，这样就形成了一种环状结构，pN蛋白与NusA的结合降低了RNA聚合酶在发夹结构处暂停的时间，这样就使其越过终止子，继续下面基因的转录。pQ蛋白与pN蛋白的机理不同，qut位点位于晚期基因转录单位的起始，qut位点上游为启动子，下游为转录区，这意味着pQ与DNA链上的区域以及RNA聚合酶相作用，pQ与聚合酶的结合大大降低了其在发夹结构处暂停的时间，从而使其快速越过终止子，转录下面的基因。

第六章操纵元（The operon）

1、简介：1）基因的表达需要很多阶段的调控，这些过程大体上分为转录、修饰以及翻译。第一个阶段就是转录的调控，通常这一过程发生于终止时RNA聚合酶是否越过终止子来转录下面的基因。在真核细胞中，RNA的操作通常为修饰、剪切、转运或者稳定。细菌中mRNA一旦被合成就可以开始翻译，但是这一时间段并不包含修饰操作。翻译也是可以调控的，发生在翻译起始以及终止过程（类似于转录）。2）两种DNA序列，一种为编码反式作用产物的序列，另一种为顺式作用序列，在DNA内部发挥作用。基因活性通过反式作用产物与顺式作用序列之间的特定作用的调控。3）一段DNA序列编码能够分散出去的产物，这一产物可能为蛋白或者为RNA。其具有一种重要的特性：产物自从其合成位点被合成之后，能够分散并且寻找特定的作用位点起作用，这种作用被称为反式作用（trans-acting）。4）以DNA位点的形式起作用，并且只与与其有物理上联系的DNA起作用（在有些情况下顺式作用序列以RNA的形式而起作用）

2、负调控以及正调控：1）一个典型的细菌负调控为：阻遏蛋白阻止基因表达。反式作用的阻遏子与顺式作用的操纵基因结合关闭了转录。操纵基因紧挨启动子，当阻遏蛋白（repressor protein，即阻遏蛋白）与操纵基因结合之后，RNA聚合酶就从转录最开始被阻断，基因表达之后被关闭。2）另一个模型为正调控，缺省状态下某种基因是关闭状态的，RNA聚合酶自身不能直接启动转录。一些反式作用因子在启动子附近有作用位点，与这些因子的结合可以协助RNA聚合酶开启这段基因转录。3）调控因子识别的序列长度小于10bp。4）基因组织的形式上，细菌的结构基因是成簇的，真核则是分散的。簇状的结构基因受到单个启动子调控。单个启动子决定这些结构基因的转录与否。

3、原核细胞的结构基因是协同调控的：典型的例子为细菌的三个lac结构基因——lacZYA。Lac操作元由6000bpDNA 组成，最左侧的lacⅠ基因有自己的启动子以及终止子。lacⅠ之后为lacZYA结构基因的启动子PO，后面依次排列lacZ、lacY、lacA结构基因。lacA后面为终止子。三个结构基因有各自的功能。lacZ编码β-半乳糖苷酶，lacY编码通透酶，lacA编码转乙酰酶。lacⅠ则编码阻遏蛋白。操纵元：细菌基因表达以及调控的单位，包括结构基因以及识别DNA的调控元件。

4、lac基因由阻遏蛋白调控（负调控）：1）阻遏蛋白为lacⅠ基因表达的四聚体蛋白。2）阻遏蛋白与lacZYA基因的启动子结合（转录起始点-5~+21），结合区域与RNA聚合酶结合区以及操作元区域重叠。3）当阻遏蛋白与启动子结合的时候，lacZYA就不能被转录。

5、lac操纵元可以被诱导（induced）：向细菌中加入β-半乳糖，则会与阻遏蛋白相连，使其脱落，进而激活lac操纵元，促使lac mRNA短时间内大量表达，β-半乳糖苷酶的合成则与mRNA合成有一定的间隔。诱导物：通过与调控蛋白相连而激活基因表达的小分子。诱导：对外界特定底物相应而表达相应酶的过程。

6、阻遏蛋白受到小分子诱导物的调控：1）阻遏蛋白有两个结合位点，一个为操纵基因结合位点，另一个为诱导物结合位点。2）诱导物与阻遏蛋白结合后会导致阻遏蛋白构象上发生改变，使其不能再与操纵基因结合。这种调控称为变构调控（allosteric regulation）。3）有一些诱导物能够与lac操纵元作用，但是不能被酶催化，这种诱导物被称

为安慰诱导物（gratuitous inducers），例如IPTG（慧能大师实验中用到的东东）。4）然而，我们注意到操纵元的调节中有一个潜在的矛盾（paradox），乳糖操纵元包含结构基因lacZ编码β-半乳糖苷酶，其同样包含lacY基因，编码将诱导物运进细胞的通透酶。如果操纵元处于抑制状态，那么，lacY就不会表达通透酶，因此，诱导物就不会进入细胞，那么诱导过程就根本不可能发生。有两个事实确保了上述矛盾不会发生，一是细胞中存在着极少数的通透酶使得诱导物足以进入细胞激活诱导过程，二是操纵元即使被抑制也能在低水平下表达一部分通透酶，即使不被诱导，况且一些诱导物有着其他的运输途径。

7、组成型顺式作用突变可以鉴别操纵基因：1）操纵基因（oprator）的突变为组成型的，因为操纵基因不能再与阻遏蛋白相连，使得操纵基因不受诱导物的影响并且RNA聚合酶能够没有限制的与启动子结合。O c突变为顺式作用，因为它影响与自己直接相连的结构基因。2）操纵基因是典型的顺式作用，能否起作用受到反式作用因子的调控。操纵基因控制与其相邻的基因，与其等位基因无关。因此，操纵基因位点上的突变为顺-显性（cis-dorminant）。

8、反式作用突变可以鉴别调节因子：1）lacⅠ基因的突变为反式作用而且会影响所用lacZYA基因的表达。2）突变导致lacⅠ功能消失导致组成型表达，这一突变是隐性的。3）阻遏蛋白DNA结合位点的突变导致组成型表达。4）阻遏蛋白诱导物结合位点的突变阻止其被诱导物变构，这导致了去诱导化（uninducibility）。5）启动子的突变时去诱导化的以及顺式作用的。

9、阻遏蛋白与操纵基因结合：1）阻遏蛋白与DNA双链上的操纵基因结合。2）操纵基因由26bp的回文序列组成。3）每一个颠倒的重复与一个阻遏蛋白的DNA结合位点结合。

10、阻遏蛋白单体由许多结构域组成：1）阻遏蛋白亚基可以被分为N-端DNA结合结构域，铰链区，以及蛋白的核心区。2）DNA结合结构域由两个短的α-螺旋区组成，与DNA的大沟结合。3）诱导物结合位点以及多聚化位点则位于核心区域。

11、阻遏蛋白是两个二聚体组成的四聚体：阻遏蛋白四聚体由两个二聚体组成，每个二聚体由核心区域2以及寡聚化的螺旋组成。

12、DNA结合由异构化调控：1）激活的阻遏蛋白二聚体的DNA结合结构域相继插入双螺旋的大沟中。2）诱导物的结合改变了阻遏蛋白的构象，使其几何学构象发生改变，不能再与DNA双螺旋结合。

13、阻遏蛋白与三个操纵基因结合并与RNA聚合酶相互作用：1）实际上，lac操纵元有三个操纵基因位点，lacZ基因起始的O1操纵基因位点。它有着最强的阻遏蛋白亲和力。O2操纵基因位于起始位点下游410bp处，O3在O2上游83bp处。2）每一个阻遏蛋白二聚体都可以与一个操纵基因结合，因此四聚体可以同时与两个操纵基因结合，完全的抑制需要阻遏蛋白与lacZ启动子的操纵基因以及另外一个上游或者下游的操纵基因结合，这样会使DNA双链形成一个环。3）阻遏蛋白与操纵基因的结合同时会与RNA聚合酶结合，但是这会妨碍到转录。

14、阻遏蛋白总是与DNA结合：1）蛋白与特定的DNA序列具有高度亲和力，对于其他DNA序列有低亲和力。2）阻遏蛋白与诱导物结合构象改变之后并不是游离到溶胶中，而是低亲和力地与其他DNA序列结合。

第七章转录后及翻译水平调控：（说明：这部分内容在基因Ⅸ中被拆分成了两章，分别为12章操纵元的12.20-12.25，以及13章调控RNA）

1、RNA以及蛋白均可以起到调控的作用：1）蛋白调节子：蛋白调控以变构的形式进行。上一章以及讨论过调控蛋白有两个结合位点，一个为核苷酸结合位点，另一个为小分子结合位点。与小分子的结合改变了蛋白的构象使其与核苷酸位点的亲和力改变。2）RNA调节子：RNA调控以两种方式进行，1、分子内的改变为RNA自身形成二级结构，对于mRNA来说这可能意味着转录的终止。

2、分子间的相互作用为RNA调节子识别与其符合碱基互补配对的序列，典型的例子为单链目标RNA与调控RNA结合。这样的结合有两种结果，一种是原先能够与单链目标RNA结合的蛋白，在其形成互补双链之后不能再与其识别。更多的情况下，这种双螺旋会被核酸酶识别而降解，从而阻止目标RNA的表达。

2、大肠杆菌的葡萄糖/乳糖调控模型：1）大肠杆菌表面的PTs系统用于运输Glucose。一旦葡萄糖被运入，那么运输乳糖的通道就被关闭，ⅡA Glc蛋白去磷酸化，无法激活腺苷酸环化酶，从而无法产生cAMP，于是CRP蛋白处于失活状态，lac genes不表达。2）一旦没有glucose，而加入乳糖，那么ⅡA Glc蛋白磷酸化，进而激活腺苷酸环化酶，产生cAMP，cAMP激活CRP使其形成二聚体，之后CRP与DNA上的两个CRP结合位点结合（lac系统中位于promoter上游），使得DNA弯曲90°，方便RNA聚合酶与DNA结合，从而使lac相关基因转录。（注：CRP有两个结构域，一个为DNA结合域，另一个为转录激活域，可以与lac操纵元结合）

3、r-protein合成的自我调控：当rRNA存在的时候，r-protein与rRNA结合，mRNA的翻译继续；一旦没有rRNA的话，r-protein积累，一个r-protein与mRNA结合并且阻止翻译。

4、T4噬菌体p32蛋白的自调控循环：p32作为一种单链结合蛋白(SSB)与DNA中的单链结合，使自己继续转录并且翻译，一旦缺乏单链DNA，p32就会与mRNA上起始密码子AUG附近的A-T富集区域结合，阻止核糖体的识别、翻译。

5、严谨反应（stringent response）：1）当细菌发现环境中的营养物质不能使其合成足够的蛋白时会大幅度的减弱一系列活性，这种反应称为严谨反应。2）严谨反应会减弱rRNA以及tRNA的合成，并且会使得两种不寻常的核苷酸积累ppGpp、pppGpp，这些核苷酸是典型的小分子效应因子，其通过与靶蛋白结合来改变蛋白活性。3）ppGpp由核糖体产生：当没有相应的氨酰-tRNA与相应的密码子结合的话，那么空载的tRNA就可以进入A位，这样就阻断了核糖体的移动，并且会激活无效反应（idling reaction），进入A位的空载tRNA还可以与严谨因子（stringent factor）RelA 结合，进而合成ppGPP。4）ppGpp的功能：其一为通过抑制操纵元中的启动子来抑制编码rRNA的转录，其二为减少噬菌体转录的延长阶段（提前终止转录）。

6、枯草芽孢杆菌的色氨酸调控：1）trp存在时，trp与TRAP结合形成四聚体，从而与mRNA上的UAG或者GAG结合，使mRNA形成hairpin结构，转录终止，trp不再合成。2）trp缺失时，空载的tRNA trp与mRNA结合，从而使其不能形成hairpin结构，RNA聚合酶向前推进，转录anti-TRAP gene。之后，空载的tRNA trp促进mRNA的翻译，翻译出的anti-TRAP将TRAP包裹起来，阻止其继续发挥功能。

7、大肠杆菌的色氨酸调控模型：1）trp不存在时，核糖体在翻译leader peptide时由于缺乏trp，因此核糖体停在trp 处，从而使衰减子区域的part1与2配对，part3与part4配对，阻止part2与3形成hairpin结构，RNA聚合酶顺利转录。2）trp存在时，核糖体翻译出leader peptide，继续前进翻译衰减子区域的part1，从而使part2与3形成hairpin 结构，RNA聚合酶脱落，核糖体解聚。

8、反义RNA用于抑制基因表达：反义基因转录反义mRNA，反义mRNA与mRNA配对阻止其发挥功能。

9、3种小RNA的调控模型：1）与RNA上的蛋白结合位点互补，阻止蛋白与目标RNA的结合。2）与目标RNA互补成双链，之后被内切酶识别，将目标RNA降解。3）与目标RNA互补，阻止其形成二级结构。例子：Lin4编码microRNA 与lin14的mRNA互补，使其不能发挥功能。

10、RNA interference（RNAi）与基因沉默相关：RNAi为双链RNA导入细胞之后终止或者减弱目标基因的活性技术。DsRNA被切割成siRNA，siRNA与mRNA配对，之后核酸酶mRNA降解。

第八章、噬菌体策略

1、裂解由一系列的反应来控制：裂解的三个阶段：1）早期，噬菌体基因由宿主的RNA聚合酶编码合成，中期需要的RNA聚合酶、σ因子以及抗终止子。2）中期，由早期产物中的RNA聚合酶转录中期基因，包括σ因子、结构基因，复制酶等。中期的基因调控分为两种，第一种在起始调控，那么早期基因的转录就与中期无关。若是以一种抗终止子的形式来调控，那么早期与中期的基因就会一起转录。3）晚期，晚期基因由中期基因产物来编码，编码结构基因以及噬菌体组分。

2、T4以及T7噬菌体的基因组表现为功能上的簇状：T4噬菌体中期的promoter缺乏-30区序列，但是有motA结合位点，通过与motA的结合来帮助RNA聚合酶与其识别。

3、λ噬菌体早期基因以及晚期基因与溶原性以及裂解循环相关：1）早早起基因包括N和cro，N编码抗终止子，其与nut序列结合并进行抗终止作用。Cro有双重功能，一方面阻止合成阻遏蛋白（repressor，阻遏蛋白是溶源性循环所必需的）。另一方面关闭早早起基因的表达。2）晚早期基因包括2个复制基因，7个重组基因以及3个调节子。C Ⅱ-CⅢ-pair与RNA polymerase结合，使cⅠ转录合成阻遏蛋白，调控溶原性。Q基因编码一个抗终止子，其可以使宿主RNA聚合酶转录晚期基因。

4、裂解循环依赖于抗终止子作用：1）pN为一个抗终止因子，其允许RNA聚合酶继续转录两个早早期基因（N以及cro）后面的晚早期基因。2）pQ为晚早期基因Q的产物，也是一个抗终止子，其允许RNA聚合酶转录晚期基因。3）λ噬菌体的表达顺序：λ噬菌体一旦进入宿主细胞，其基因组就会形成环状，早早期基因N向左表达，早早期基因cro向右表达。刚开始宿主的RNA聚合酶分别从P L以及P R promoter表达N以及cro，N转录mRNA进而翻译产生pN 蛋白。pN为抗终止子，作用位于N基因左侧的nut L以及位于cro基因右侧的nut R识别位点，使其继续向后表达晚早期基因。N基因后面的基因为晚早期基因cⅢ、Rec基因，cro后面的为晚早期基因cⅡ、O、P、Q，pQ为抗终止子，作用于终止子tR3，是晚期基因表达，晚期基因位于晚早期基因Q之后，包括S、R、A、W以及Head & tail基因。

5、溶原性由阻遏蛋白（repressor）保持：1）cⅠ基因的突变不能保持溶原性。2）cⅠ基因编码一种阻遏蛋白蛋白，其作用于O L以及O R操纵基因（operators）来阻断早早期基因的转录。3）早早期基因启动一个调控流程，其阻止裂解循环的进行。

6、阻遏蛋白以及其操纵基因决定了免疫区（immunity Region）：1）一些λ噬菌体有着不同的免疫区。2）阻遏蛋白以及其旁边的操纵基因，组成免疫区，防止其余λ噬菌体基因转录裂解期基因。（通过阻遏蛋白与O L以及O R的操纵基因相结合。之后其余的λ噬菌体会被限制在溶源期。）

7、阻遏蛋白的DNA结合形式为二聚体：1）一个阻遏蛋白单体有两个独特的区域。2）N-端为DNA结合位点。3）阻遏蛋白的C端为二聚化位点。4）与操纵基因的结合需要阻遏蛋白二聚化，因此两个DNA结合结构域可以同时与操纵基因结合。5）阻遏蛋白的N端与C端之间的切割可以导致与操纵基因的亲和力下降，进而进入裂解循环。

8、阻遏蛋白使用Helix-turn-Helix motif来与DNA结合：1）每一个阻遏蛋白都与DNA上操纵基因中的半位点（half-site）结合（类似于CRP）。2）阻遏蛋白的DNA结合位点包括两个短的α-螺旋区，他们相继和DNA的大沟结合。3）DNA 结合位点为部分的回文序列。4）总结：操纵基因沿中间形成2个对称的回文结构，每个阻遏蛋白的N端识别一半回文序列。阻遏蛋白的N端由5段α-helix组成，2、3段结合DNA，3与DNA同面而2则穿过DNA的大沟。

9、识别螺旋决定DNA的特异性：1）识别螺旋上的氨基酸序列决定其与操纵基因上的特定序列结合。2）Helix-3主要靠氨基酸与暴露的碱基部分形成的氢键来与DNA结合。3）Helix-2除了靠氨基酸与磷酸骨架部分形成的氢键外，还靠氨基酸与磷酸骨架之间形成的离子间相互作用。4）从Helix-3 determines DNA-binding specificity这幅图中可以分析得到，Repressor-O R1的repressor只有helix-3与DNA结合，Helix-2不结合。而Cro-O R3中，Helix-2有一个Thr与DNA 结合，O R2的结合情况目前还不知道。

10、阻遏蛋白二聚体与DNA结合的协同作用：1）一个阻遏蛋白与DNA结合之后会增加第二个阻遏蛋白与DNA的亲和力。2）O L1以及O R1的亲和力是其它操纵基因的10倍以上。3）每个操纵基因都有三个阻遏蛋白结合位点

（O L1-O L3;O R1-O R3）每个结合位点之间为一小段A-T富集区，位点1对阻遏蛋白的亲和力远远大于位点2以及位点3。阻遏蛋白首先与位点1结合，之后由于二聚体效应会协助位点2与阻遏蛋白结合。位点1与部分promoter序列重叠，这使得阻遏蛋白一旦与位点1结合就会阻止RNA聚合酶与promoter的结合。

11、与O R2结合的阻遏蛋白可以与RNA聚合酶在P RM promoter处相互作用：1）与O R2结合的阻遏蛋白的DNA-结合区与RNA聚合酶相互作用，并且将其稳定在P RM Promoter处。这是阻遏蛋白自调控的基础。2）Helix-2外部位于Helix-2和Helix-3之间的部分为负电荷，其可以与RNA聚合酶的σ70亚基相结合，σ70正好也与DNA的promoter的-35区相结合，这样就使很少量的repressor也可以很高效的调节cⅠrepressor的转录。

12、协同作用增加了调控的敏感性：1）与O R1和O R2结合的repressor与O L1和O L2结合的repressor结合形成四聚体，使得O L3与O R3之间的cⅠ基因弯曲形成环状，从而方便cⅠ基因的表达翻译。2）一旦O L3以及O R3与repressor结合，因为O R3与cⅠpromoter有重叠部分，因此，cⅠ基因的RNA聚合酶不能再与O R3以及O R2上的repressor结合导致c Ⅰ基因合成终止。

13、cⅡ以及cⅢ基因与建立溶原性相关：1）晚早期基因产物cⅡ以及cⅢ是RNA聚合酶在P RE promoter处启动转录所必需的。2）cⅡ直接与promoter作用，而cⅢ保护cⅡ不被降解。3）从P RE开始的转录导致repressor的合成并且阻断了cro的转录。4）事实上，在λ噬菌体进入宿主细胞后，宿主细胞中并没有repressor。因此，RNA聚合酶均可以与P L以及P R promoter结合，从而转录早早期N基因以及cro基因。N基因翻译出pN抗终止子蛋白，从而与nut L、nut R序列结合，开始转录晚早期基因cⅢ以及cro后面的cⅡ。CⅡ蛋白与RNA聚合酶结合，从而使其与cro以及cⅡ基因之间的P RE promoter结合，向反方向转录cro的反义链，一直转录到cⅠ基因。其中，cro基因的反义mRNA与cro的正义mRNA链杂交，使其不能发挥功能，阻止λ噬菌体进入裂解期。而cⅠ基因的mRNA则翻译出repressor

开始进入溶源性的自我调控循环。由于cⅡ蛋白极不稳定，会被宿主的HflA蛋白降解。因此cⅢ蛋白与cⅡ蛋白结合，稳定其结构，防止其被HflA蛋白降解。

14、一个弱启动子需要cⅡ蛋白：1）P RE有着不寻常的-10、-35区序列。2）RNA聚合酶只有在cⅡ蛋白存在的情况下才会与P RE promoter结合。3）cⅡ蛋白与-35区附近的序列结合。4）总结：P RE promoter天生有缺陷，其-10区的一致性很差而且-35区没有一致性序列，这就使得P RE promoter自身无法直接与RNA聚合酶结合。CⅡ蛋白可以与P RE promoter上的-25~-45区相结合，覆盖了promoter的-35区，因此在cⅡ蛋白的帮助下，P RE promoter可以与RNA聚合酶形结合。By the way，RNA聚合酶同样覆盖了promoter的-10区。

15、溶源性需要一些列的事件来完成：1）cⅡ以及cⅢ导致repressor的合成以及激活了对晚期基因的抑制作用。2）

阻遏蛋白与O L1以及O R1结合进而关闭了早早期以及晚早期基因的表达。3）阻遏蛋白开启了自身合成循环。4）λDNA 在建立溶源性的最后一步中整合到细菌染色体上。5）总体过程：λ噬菌体开始侵入→N，cro表达→cⅡ、cⅢ表达→λ噬菌体位点特异性重组插入到细菌染色体中→启动repressor自主性调控。6）cⅡ蛋白维持溶源性的措施：1、cⅡ蛋白启动P anti-Q’ promoter的转录。P anti-Q’promoter位于Q基因内部。其转录出Q基因的反义mRNA，与正义mRNA

形成杂交双链，阻止Q基因发挥功能。2、cⅡ蛋白启动P RE到cro反义mRNA的表达，阻止cro基因发挥功能。3、补充：cⅡ蛋白除了可以与P RE promoter作用维持溶源性之外还可以与int 基因的启动子P I’相作用，原理同P RE一样。CⅢ-cⅡ与RNA聚合酶结合从而使int基因转录，噬菌体进入插入环节。

16、什么决定了溶源性以及裂解循环之间的平衡？λ噬菌体是否进入裂解期取决于cro还是repressor占领操纵基因。若是细菌在营养丰富的培养基上生长，那么细菌中的蛋白酶活性高，另一方面cⅢ对cⅡ蛋白具有双重性，其虽然可以帮助cⅡ抵抗宿主细胞中蛋白酶的进攻，但其并不能完全保证cⅡ不被降解。综合上面两方面原因，宿主细胞中的蛋白酶一旦降解cⅡ蛋白，那么对cro的抑制就解除了。那么cro就开始编码cro蛋白。Cro蛋白首先与O R3操纵基因结合，从而阻止repressor与其结合，间接抑制了RNA聚合酶与repressor的结合，终止了溶源性的自主循环。之后cro蛋白与O R1、O R2以及O L1、O L2操纵基因结合，关闭了早期基因的表达。之后进入裂解期基因的表达。

PART Ⅲ真核基因表达体系

第九章真核细胞的启动子以及增强子（Promoters and Enhancers）

1、原核生物和真核生物转录起始的区别：原核转录以及真核转录的主要区别是RNA聚合酶以及辅助因子。细菌中，RNA聚合酶直接识别promoter中邻近起始位点的短的一致性序列。在某些情况下，辅助因子可以帮助或者稳定RNA 聚合酶与promoter的结合。而在真核中，promoter中的短一致性序列位于起始位点的上游，与原核不同，其promoter 由转录因子识别而不是RNA聚合酶。转录因子仅参与转录的开始阶段。RNA聚合酶通过与转录因子的结合而与起始位点结合。

2、真核生物的RNA聚合酶包括：三种类型，每一种都转录不同的RNA聚合酶。RNA聚合酶Ⅰ转录rRNA，RNA聚合酶Ⅱ转录mRNA，RNA聚合酶Ⅲ转录tRNA以及其他小RNA。每一种RNA聚合酶都与其相应的转录因子相互作用，RNA 聚合酶Ⅰ以及Ⅲ的转录因子相对简单，而RNA聚合酶Ⅱ的转录因子比较复杂，其组成的复合体称为basal apparatus。

3、RNA聚合酶Ⅱ的启动子特征：所有的RNA聚合酶Ⅱpromoters都有着靠近起始位点的序列元件，并且与转录因子结合形成basal apparatus，之后启动转录。在上游远一些的序列决定promoter是否在特定细胞类型中表达。管家基因的上游序列元件被无处不在的activators识别。

4、增强子：增强子是起始过程中另一种类型。它是一段可以激活起始的序列，但是其分布在距离起始位点较远的地方。增强子元件经常作为组织特异性或者是时序调控的位点。

5、真核的RNA聚合酶由很多亚基组成：1）RNA聚合酶Ⅰ在核仁处合成rRNA。2）RNA聚合酶Ⅱ在核质中合成mRNA。3）RNA聚合酶Ⅲ在核膜上合成小RNA。4）所有的真核RNA聚合酶有12个亚基并且能够达到500kD。5）RNA聚合酶Ⅱ最大的亚基有一个CTD（carboxy-terminal domain）由多个七聚体组成。5）RNA聚合酶Ⅱ在核质区合成mRNA以及hnRNA，其包含CTD区（羧基-端结构域），其由7个氨基酸组成重复型一致性序列组成，可以被高度磷酸化ser/thr，从而参与起始反应。

6、RNA聚合酶Ⅰ有着两种promoter组成：1）RNA聚合酶Ⅰ的promoter由一个核心promoter以及一个上游控制元件组成（UPE）。2）UBF1因子将DNA旋转从而使得核心promoter以及UPE接近。3）SL1包括TBP因子，其可以参与到三种RNA聚合酶的起始转录过程中。4）RNA聚合酶在核心promoter与UBF1-SL1复合体结合。5）真核的RNA 聚合酶Ⅰ的promoter由核心启动子序列组成，核心启动子包围转录起始点，从-45区~+20区均为G-C富集序列，而靠近起始位点的位置有部分A-T富集序列，被称为Inr序列。其上游为UPE元件，为G-C富集序列，可以与UBF结合，UBF使得UPE弯曲，从而增加与核心promoter的亲和力。SL1因子与UBF相连，同时也与core promoter相连。TBP 与RNA聚合酶结合，但是不直接与core promoter相结合。

7、RNA聚合酶Ⅲ使用下游以及上游的promoter：1）RNA聚合酶Ⅲ有两种promoter。2）内部启动子由转录单位内的短的一致序列组成。并且使得起始发生在上游固定的位置。3）上游promoter在起始位点附近包含3个短的一致序列，而且其被转录因子包围。4）总结：RNA聚合酶Ⅲ转录5s 基因promoter位于内部，转录起始点下游。转录SnRNA 的位于起始点的上游。RNA聚合酶Ⅲ的promoter是分隔的，位于起始点下游的分别为boxA以及boxB。总共有三种类型的聚合酶Ⅲ启动子，类型1为起始点下游分隔boxA以及boxC。类型2为起始点下游分隔boxA以及boxB。类型

3为起始点上游分隔Oct 、PSE 以及TATA box 。

8、TF ⅢB 为聚合酶Ⅲ的定型（commitment ）因子：1）TF ⅢA 以及TF ⅢC 与一致性序列相结合并且使得TF ⅢB 能够与起

始位点结合。2）TF ⅢB 包括TBP 亚基，并且其与RNA 聚合酶相结合。3）聚合酶Ⅲ的类型2的promoter 中首先是TF

ⅢC 与起始位点下游的boxA 以及boxB 相结合。之后起始位点上游TF ⅢB 与TA

TA box 相结合。TF ⅢC 脱落，TF ⅢB 与TBP 组成的起始复合体与聚合酶Ⅲ相连。其中，TF ⅢA/C 为组装因子或被称为转录因子。4）类型1 promoter 使用TF ⅢA/C ，其中，TF ⅢA 首先与boxA 序列结合，之后招募TF ⅢC 与boxC 相结合，之后TF ⅢB 与起始点上游的TA TA box 结合，TF ⅢA/C 脱落，TF ⅢB 与TBP 组成的起始复合体与聚合酶Ⅲ相结合。

9、RNA 聚合酶Ⅱ的起始位点：1）RNA 聚合酶Ⅱ需要一般的转录因子（称为TF ⅡX ）来起始转录。2）RNA 聚合酶Ⅱ

的promoters 一般由一个短的保守序列Py2CAPY5（起始子InrR ）在起始位点。3）TATA box 为RNA 聚合酶Ⅱ启动子的常规组成成分，并且还包含一个A-T 富集的四聚体区域位于起始位点上游25bp 处。4）DPE 为RNA 聚合酶Ⅱ的常规组成成分，这种启动子其不含TATA box 。5）RNA 聚合酶Ⅱ的核心启动子一般包含Inr 以及TATA box 或者一个DPE 。

10、TBP 为一个广泛（Universal ）因子：1）TBP 是一个位点识别因子，每一种类型的RNA 聚合酶都需要其与promoter 相结合。2）RNA 聚合酶Ⅱ的TF ⅡD 包括TBP 以及11个TAFs 。3）聚合酶Ⅱ的promoter 中，TF ⅡD 单独与TATA box 结

合。TF ⅡD 包含TTATA-结合蛋白TBP 以及TBP-结合因子TAFs ，不含TATA box 的promoter 不需要其他蛋白组成的复合

体来与DNA 相连。

11、TBP 与DNA 以一种不寻常的方式结合：1）TBP 与DNA 小沟上的TA TA box 结合。2）TBP 将DNA 弯曲80°形成马蹄形。3）有一些TAFs 组装组氨酸可能形成组氨酸八聚体。具体来说为TAF Ⅱ42以及TAF Ⅱ62与H3以及H4组成复

合体，帮助TF ⅡD 与DNA 的结合。

12、Basal Apparatus 在启动子附近组装：1）TF ⅡD 与TA TA box 的结合是起始的第一步。2）其他转录因子以一定的顺

序与复合体结合，延长受保护的DNA 的长度。3）当RNA 聚合酶Ⅱ与复合体结合后，转录就开始。4）TATA-box promoter 的启动转录过程：TF ⅡD 与DNA 小沟结合，TF ⅡA 与TAF230结合，激活TBP 。之后TF ⅡB 与弯曲后的DNA 结合，包括

TATA 下游序列以及上游的BRE 序列。并且TF ⅡB 对RNA 聚合酶Ⅱ起到定位的作用。TF ⅡF 通过自身与TF ⅡD 复合体的

结合，从而知道RNA 聚合酶Ⅱ与复合体的结合。TBP 、TAFs 均可以与RNA 聚合酶Ⅱ的CTD 尾相互作用。5）TATA-box 缺失的promoter 中，TF ⅡD 中的TAFs 与Inr 以及下游的DPE 序列相结合，类似于聚合酶Ⅰ以及聚合酶Ⅲ的过程。

13、启动转录之后跟随的是启动子的清空：1）TF ⅡE 以及TF ⅡH 参与DNA 的解旋来允许聚合酶的移动。2）磷酸化CTD

可以启动延长过程。3）对于某些启动子来说，进一步磷酸化CTD 可以终止流产起始。4）CTD 可以调控RNA 转录的过程。5）总结：RNA 聚合酶Ⅱ想要进一步转录还需要3个转录因子，TF ⅡH 以及TF ⅡJ 和TF ⅡE 。TF ⅡE 与复合体的结合

使下游到+30的序列被保护起来，而TF ⅡH 及TF ⅡJ 的加入并不改变DNA 结合的模式。TF ⅡH 有多种酶的活性，包括ATPase 、

解旋酶、以及CTD 序列的激酶活性。TF ⅡH 还具有DNA 的修复功能。其中，TF ⅡH 的XPB 亚基涉及DNA 解旋。而TF ⅡE 的ATPase 及TF ⅡH 的解旋酶活性共同使DNA 解旋，并开始转录。TF ⅡH 是CTD 尾部磷酸化，但是如果没有其他因子

的帮助，聚合酶Ⅱ开始转录一小段就会从DNA 上脱落，那一小段RNA 也会被迅速的降解。但是这也与细菌中的流产序列不同。若要使RNA 聚合酶Ⅱ进入延长阶段，则需要P-TEFb 激酶进一步磷酸化CTD 尾部。一旦进入到延长阶段，那么起始复合体就会脱落，只剩下磷酸化CTD 尾的RNA 聚合酶Ⅱ在DNA 上移动。

CTD 尾部的磷酸化与许多过程相关联，磷酸化CTD 尾部可以与鸟苷酸转移酶相结合（capping enzyme ）。磷酸化的CTD 还可以与SCAFs 蛋白相结合SCAFs 蛋白再与剪切因子相结合。磷酸化的CTD 还可以与多聚腺嘌呤作用的酶结合从而介导加polyA 尾的反应。奇怪的是加polyA 尾的酶在一开始就与CTD 相结合，这说明RNA 聚合酶Ⅱ从一开始就已经具备了加A 尾的能力。

14、转录以及修复之间的联系：1）当转录过程中发生错配现象时，修复在RNA 聚合酶停止之前就已经完成了修复工作。2）TF ⅡH 参与修复过程。3）TF ⅡH 的XPD 亚基的突变会产生三种人类疾病。4）原核的转录修复系统：转录过程

中出现错误之后，RNA 聚合酶会在错配位点暂停转录，Mfd 蛋白与暂停的RNA 聚合酶结合。首先Mfd 蛋白替代RNA 聚合酶与DNA 结合，之后其与UvrABC 修复酶结合，进行剪切-修复。DNA 修复完成之后，下一个RNA 聚合酶与DNA 重新结合进行转录。5）真核的转录修复系统：真核中TF ⅡH 包含XPC 亚基，其可以识别受损伤的DNA 并在内切酶复

合体（XPG 、XPF 以及ERCC1）的帮助下在RNA 聚合酶停止转录之前将错误修复。

15、核心启动子上游调控元件及其结合的调控蛋白：RNA 聚合酶Ⅱ的启动子包含两种区域，起始位点自身包含在Inr 中以及有/无TATA box 。在起始位点上游较远的序列处包含一种能与激活子结合提高转录效率的序列被称为增强子。

16、短序列元件与激活子相结合：真核转录影响启动子转录效率的序列分布在3个区域，-30区的TATA box ，这个序

列影响效率最低。-75区的CAAT box，该区域决定启动子的效率但是不影响其特异性。还有-90区域的GC box。与这些区域结合的因子被称为激活子。

17、启动子序列短序列的分布是有弹性的但是内容最重要：1）没有那个上游元件对启动子来说是必需的，虽然多了会提高启动子的转录效率。2）有些元件受多个因子调控。一个激活子结合的序列通常小于10bp。

18、增强子由两个方向的元件组成：1）增强子激活离它最近的启动子，并且其可以在启动子上游以及下游的任意距离。2）酵母中的UAS（上游激活子序列）类似于增强子，但是其只在启动子上游的时候发挥作用。3）启动子与增强子有着相似的序列。4）增强子组成激活子的复合体，其直接或者间接的与启动子作用。5）从操作层面上，我们把DNA上位于起始位点固定的序列称为启动子。这样的话TATA box以及其他上游元件就都包含在内了，但是增强子不包含在内。

19、增强子与启动子有着相似的序列：1）增强子中一致序列的密度比启动子中要高，与启动子不同的是，增强子对于激活子有着更强的结合能力，其可以形成增强体（enhanceosome）。

20、增强作用通过增加启动子附近的激活子密度来实现：增强子通常以顺式构象对target 启动子起作用。增强子可以改变模板整体的结构，例如影响超螺旋的密度，他还可以将模板定位到核质中，同时增强子还可以为RNA聚合酶或其他蛋白提供一个在染色体上的初始结合位点。增强子最重要的功能可能是增加启动子附近激活子的密度，其功能可以被绝缘子阻断。

21、基因表达通常与去甲基化相连：基因5’末端的去甲基化通常是转录所必需的。

22、CpG岛为调控位点：1）CpG岛环绕着那些组成型表达的基因的启动子，当他们去甲基化后CpG岛屿会表达。2）CpG岛同样在那些组织-调控型基因中找到。3）人类基因组中有着29,000个CpG岛。4）CpG岛的甲基化阻止其包围的启动子的转录。5）抑制蛋白与甲基化的CpG岛结合同样会起到抑制转录的作用。

第十章转录激活

1、简介：2个问题，1、转录因子如何鉴别目标基因？

2、转录因子活性的激活是内部还是外部信号？

2、转录因子的几种类型：1）basal apparatus决定转录的起始。2）激活子决定转录的效率。3）激活子通过protein-protein 接触来与basal factor作用。4）激活子可能通过辅助激活子（coactivators）来起作用。5）有一些转录组分通过改变染色体结构来起作用，例如氨酰化。6）basal factor：基础因子，与起始位点以及TATA box结合，并且与RNA聚合酶组成起始复合体。7）activators：激活因子，通过与启动子或者是增强子上的特定短致性序列结合来增加basal apparatus 与RNA聚合酶之间结合的效率。并且有的有组织-特异性。与激活子相结合的序列被称为相应元件（response element）。8）与细菌相比，真核系统只有basal factor直接与RNA聚合酶相互作用，而细菌中所用的转录因子都必须直接与RNA 聚合酶起作用。

3、激活子有着独立的DNA结合域以及转录激活域：1）DNA结合活性以及转录激活活性由激活子独立的区域承担。2）激活子的DNA-结合域使得转录激活结构域接近启动子。3）总结：激活子由DNA-结合结构域以及转录激活结构域组成。DNA-结合结构域与启动子、增强子以及其他调控序列中的一致序列结合，为激活结构域提供一种“栓系”功能，从而确保激活结构域能够接近起始复合体。2个结构域之间具有独立性，可以分开。激活子中DNA-结合结构域以及转录激活结构域之间是通过共价连接的。而激活子与辅助激活子之间是非共价连接的。4）实验证明：GAL4 DNA-结合结构域以及LexA DNA-结合结构域的互换实验。HIV中的tar蛋白只与RNA中的tar序列结合从而激活转录。

4、激活子与basal apparatus相互作用：1）所有的激活子都是DNA-结合结构域决定target 启动子或者增强子的特异性。2）没有激活结构域的激活子通过与辅助激活因子结合来启动转录激活。3）激活子与basal apparatus中的TF

D

Ⅱ

D与TATA box 中的TAFs相互作用，这也是TAFs的主要功能。不同的TAFs与不同的激活子作用。这一反应不仅帮助TF

Ⅱ

结合，同时也帮助形成TF

D-TATA box周围的复合体。4）酵母中对应GAL4以及Gcn4启动子的为酸性激活子（因为

Ⅱ

B直接相互作用。5）激活子到底是怎样激活转录的？1、model 1表明激活子单其带负电）。VP16激活子可以与TF

Ⅱ

独的作用是增加RNA聚合酶在启动子附近的有效浓度。2、model 2表明激活子还可以一步一步的聚集辅助激活子。Basal factor进而组成一个复合体-mediator，其可以与RNA聚合酶的C-端的CTD结构域相互作用，这样可以将激活/抑制信号从聚合酶上游组分传至RNA聚合酶之后。Mediator在延长阶段可能脱落。还有一些转录因子可以操纵染色质的结构。

5、一些启动子-结合蛋白为阻遏蛋白：抑制作用通常是影响染色体结构，确实有阻遏蛋白通过与特定的启动子结合。之后全是例子：1、球状阻遏蛋白NC2/Dr1/DRAP1为异源二聚体，其与TBP蛋白结合从而阻止其他basal apparatus相

互作用。2、海胆的H2B 启动子中，在胚胎期，其CAAT box序列与CAAT-displacement protein（CDP）结合，从而阻止basal factor（Oct1/CTF）与之结合，阻止promoter下游基因的表达。

6、激活子识别响应元件：1）响应元件位于启动子以及增强子中。2）每一个响应元件都与特定的激活子结合。3）响应元件包括HSE：heat shock response。GRE：肾上腺皮质激素。SRE：血清应答元件。

7、DNA-结合结构域的多种类型：1）激活子可以通过DNA-结合结构域来分类。2）分类：1、锌指结构（zinc finger）：这一结构最初是在TFⅢA中发现的是RNA聚合酶Ⅲ转录5s rRNA基因所必需的因子。2、类固醇受体（steroid receptor）：这类因子一直保持失活状态，直到与一个小的配体结合，才会启动其活性。3、helix-turn-helix motif：最初在噬菌体repressor的DNA-结合结构域发现。一个α-helix与DNA大沟结合，另一个穿过DNA的双链。4、helix-loop-helix motif （HLH）最初在一些发育调控因子中发现，刚开始合成2个亚基，处于inactive的状态，当改变一个亚基之后，其变成有活性状态。5、亮氨酸拉链（Leucine Zippers）：由一串氨基酸组成，每7个氨基酸有一个Leucine残基，2条Leucine Zipper多肽链组成一个二聚体。6、同源异形结构域（homeodomain）：属于一种组织特异性的因子，在特定细胞中激活，合成homeo-蛋白，之后，其启动特定基因的转录。3）激活子的调控机制：1、组织特异性合成homeo-蛋白。2、磷酸化激活：HSTF热激转录因子去磷酸化激活。3、加配体激活：steroid recepters（类固醇受体），加上配体后可以影响蛋白的定位，导致该蛋白从细胞质转运到核中。4、释放抑制因子（inhibitor）激活：NF-kB在细胞质中与inhibitor 结合保持其失活状态，其释放inhibitor之后进入激活状态，进入核中启动转录。5、改变配体激活：HLH 6、切割释放激活因子：sterol response失活的蛋白位于核膜/ER膜上，当缺乏固醇时，切除膜上蛋白，释放factor进入核内激活。

8、锌指结构包括DNA-结合结构域：1）锌指结构包括23个氨基酸的环状结构，锌指结合位点由His以及Cys氨基酸组成。2）锌指蛋白通常由多个锌指组成。3）每一个锌指c-端组成一个α-helix进而与DNA的大沟结合。4）有一些锌指蛋白与不仅会与DNA结合还会与RNA结合。5）有两种类型的DNA

-结合蛋白有这样的锌指结构，一种为经典的锌指结构，另一种为steroid receptors。锌指结构的中心为Zn2+，周围由His以及Cys组成四聚体结构。锌指结构通常几个连在一起，每两个锌指结构之间有7-8个氨基酸连接。锌指结构的C端形成α-helix，而N端形成β-sheet。每个α-helix与DNA序列有2个结合点。有的锌指结构不仅会和DNA结合，A不光与5s 基因结合，还与5s rRNA结合。转录起始因子elF2β，与起始密码子结合。还会与RNA结合，例如TF

Ⅲ

9、steroid receptors有锌指结构：1）steroid recepors的DNA-结合结构域有一种锌指结构，其只有Cys但是没有His 残基。2）肾上腺皮质激素以及雌激素受体由两个锌指结构组成，第一个锌指结构识别DNA中的回文序列，第二个锌指结构控制锌指二聚体与DNA之间的空间距离。

10、与配体结合激活与响应元件的结合：配体与激活子的C端结构域的结合增加了激活子DNA-结合结构域与DNA

之间的亲和力。

11、steroid recepors通过combinatoral code识别响应元件：1）受体识别的响应元件由2个短重复序列组成，或者是半位点（half-site），半位点可以是回文序列也可以是同向重复序列。2）第一个锌指结构识别半位点，第二个锌指结构用于二聚化，来决定亚基之间的距离。3）同源二聚体识别回文序列，异源二聚体识别同向重复序列。4）受体分为两种类型：1、GR（肾上腺皮质激素）、MR（盐皮质激素）、AR（雄性激素）、PR（孕酮）均组成同源二聚体，它们识别的响应元件的半位点有一致性序列TGTTCT，以回文序列形式排列。ER（雌激素）的模式与上述一样，但识别的序列为TGACCT。2、RXR（9-顺-视黄素）、T3R（甲状腺激素）、VDR（维生素D）、RAR（视黄素）。这些受体组成的二聚体识别的一致性序列为TGACCT，以同向重复形式存在。这些受体还可以组成同源二聚体来识别回文序列。（注：RXR为配体激活型受体。）

5）steroid receptors如何激活转录？它们不是直接与basal apparatus作用，而是通过与coactivators复合体作用间接启动转录。例子：steroid receptors、TR以及RAR在缺乏配体的情况下与SMRT corerepressor结合。一旦与配体结合，那么SMRT就会被coactivators复合体替换，从而与basal apparatus相结合而启动转录。

12、同源域（homeodomain）与DNA上的相关位点结合：1）同源域是一个由60个氨基酸组成的DNA-结合结构域，其中包含3个α-helix。2）α-helix 3的C端由17个氨基酸组成，并且插入DNA的大沟中。3）同源域的N端插入到DNA的小沟中。4）包含同源域的蛋白有可能是activator也有可能是转录阻遏蛋白。

13、helix-loop-helix蛋白与组合起来的附件（accessory）相互作用：1）helix-loop-helix蛋白由40-50个氨基酸组成2个两性的α-helix。中间被15-16个残基组成的环隔开。2）α-helix的主要功能是形成二聚体。3）bHLH蛋白有一个basic sequence，其邻近HLH motif，对DNA-结合起作用。4）bHLH蛋白分为两种，class A/B，class A普遍表达，classB bHLH蛋白为组织特异性。5）class B通常与class A蛋白组成异源二聚体。6）HLH一旦缺乏basic 区的话，那么就会

阻止HLH与DNA的结合。

14、亮氨酸拉链涉及二聚体的形成：1）亮氨酸拉链为一种两性helix。疏水的亮氨酸残基位于中间。带正电的basic region 与DNA结合，两个亮氨酸拉链组成一种Y形结构。2）二聚化模式为bZIP motif。

第十一章RNA剪切

1、简介：1）因转录出的最初的RNA十分不稳定，并且序列上的差异性也很大，这种RNA被称为核不均一RNA（hnRNA）。其包含前体mRNA以及其他转录本。hnRNA的物理形态通常与蛋白结合形成复合体。被称为核蛋白颗粒（hnRNP）。2）几个问题：1、怎样确保内含子序列被准确的切除？

2、内含子从前导序列上被切除是按照特定的顺序吗？

3、成熟的RNA产物是否参与RNA的剪切过程？

3）几种剪切的模型：1、蛋白、RNA等组成的剪切体（spliceosome）识别内含子以及外显子的交界处的短保守序列，从而切下内含子。2、两类RNA具有自调控能力，可以自己切割RNA。其区别在于二级/三级结构的不同。3、酵母中tRNA的成熟需要复合体的切割以及连接。

2、细胞核中的splice Junctions为短序列：内含子的切割位点位于交界处，且处于内含子中。总的模型为外显子

1-5’GU…….branch site..嘧啶富集区….AG3’-外显子2。被称为“GU-AG rule”。

3、splice junction成对读取：内含子剪切需要GU-AG成对存在。但内含子的剪切并不一定按照其基因转录顺序。

4、Pre-mRNA splicing proceeds through a lariat（前体mRNA的剪切通过形成套索结构进行）：1）剪切过程：先切5’位点，之后5’内含子的末端G会弯曲过来（向3’方向），与3’端上游的branch site（分支序列）的2’-OH结合（第一次转酯反应），形成5’-2’键。外形上酷似套索。（G与分支位点上的A结合）最后，切割3’端，两端的外显子接起来（第二次转酯反应）。内含子降解。2）branch site在酵母菌中是高度保守的，其包含一致性序列UACUAAC。而在高等真核生物中，branch site 并不是那么具有保守性。但是其中一定包含与5’端形成5’-2’键的A。

3）切割内含子过程中发生的化学反应（2次转酯反应）：1、branch site中的A的2位上的-OH进攻5’G与外显子1之间形成的磷酸二酯键，之后G与branch site上的A形成5’-2’键。之前与G形成磷酸二酯键的外显子1的3’端变为伸出的-OH。2、外显子1伸出的-OH进攻与内含子3’端相连的第二个外显子的磷酸二酯键。两个外显子之间形成磷酸二酯键，内含子以套索结构脱落。

5、剪切需要snRNAs：1）剪切体（spliceosome）包括小核蛋白颗粒（snRNPs）之外还包含剪切所需要的额外的蛋白因子。2）小核蛋白颗粒（snRNPs）包括U1、U2、U5、U4以及U6。3）除了U6之外，这些snRNPs均包含一组由8个蛋白组成的核心（core）。这一核心可以与Sm蛋白结合。而Sm又可以被自身免疫抗血清的anti-Sm结合。被排除的U6则与Sm-Like 蛋白结合。

6、U1 snRNP起动剪切：1）U1 snRNA的5’端有一段伸出的单链区，其可以与内含子配对。配对区一旦突变，那么

U1 snRNA就不能再与内含子结合。2）E complex包括与5’剪切位点结合的U1 snRNP。U2AF蛋白与嘧啶富集区相结合。SR蛋白将U1 snRNP以及U2AF结合起来。3）初始复合体（E complex）的形成：1、U1 snRNP以及ASF/SF2结合在5’剪切位点。2、U2AF蛋白结合在嘧啶富集区以及3’剪切位点处。3、SF1/BBP将U1 snRNP和U2AF连接在一起。

7、E复合体可以分为内含子决定型以及外显子决定型：1）E 复合体的形成有两种形式：①内含子决定型：即直接形成E复合体。U1 snRNP与剪切位点结合，之后与上面初始复合体的形成一致。最后，U2 snRNP与branch site结合，形成A 复合体。②外显子决定型：内含子较长或者剪切位点较弱时，3’剪切复合体跨越外显子，与下游的外显子5’剪切位点的U1 snRNP结合。主要通过SR蛋白将U2AF与下游的U1 snRNP结合起来。2）剪切增强子：位于3’剪切位点的下游，SR蛋白与剪切增强子序列相结合。

8、5种snRNPs组成剪切复合体（spliceosome）：1）完整的复合体形成及剪切全过程：①②为形成E复合体以及A 复合体，过程前面已经论及所以这边就不再扯了。③形成A复合体之后，U5，U4/U6 snRNP三聚体与A复合体结合形成B1 复合体，此时的复合体中已经包含所有的剪切成分，因此可以称作剪切复合体（spliceosome）。④U1释放，B1复合体转变为B2复合体，U5 snRNP从5’剪切位点移动到内含子序列附近。U6 snRNP则与5’剪切位点结合。⑤U4释放，这会触发U6/U2 pair转酯反应，5’切割，套索结构形成。U5与3’剪切位点的外显子结合。⑥U2/U5/U6与套索结构结合，3’位点切割，外显子重连接。⑦被剪切的RNA释放，套索结构降解。2）U4与U6 snRNA有一段互补序列。其相互结合时，U4会抑制U6的活性，一旦U4释放，那么U6就会与U2配对，并且形成自身的U6发卡结构。U2

与branch site 配对。这样就会形成Group Ⅱ类的自我剪切催化中心，催化3’剪切。3）蛋白与RNA的相互作用：PRP 蛋白中PRP16为水解ATP的RNA解旋酶，能够与剪切复合体短暂结合并参与第二次转酯反应。PRP22参与成熟的mRNA

从剪切体中的释放。

9、有些生物使用其他的splicing apparatus：GU-AG rule占到大约98%，而AU-AC占0.1%。

10、剪切后紧接着的是运出mRNA：剪切后的转运过程：REF蛋白与剪切体连接，在剪切完成之后其仍然保留在exon-exon junction处。之后，REF募集一系列蛋白组成外显子连接复合体（EJC）。之后，转运因子TAP/Mex与REF结合，带着它穿过核孔后，TAP/Mex释放。

11、Group Ⅱ类的内含子可以以套索结构进行自我剪切：1）编码蛋白的基因中的内含子可以分为三类：①核前体mRNA内含子，这种内含子的模式为5’GU……branch site…嘧啶富集区…AG3’。②GroupⅠ以及GroupⅡ类内含子。这类内含子主要分布在细胞器中或者是细菌中。其均可以通过折叠形成三级结构。Ⅰ/Ⅱ具有自我剪切能力，不依赖其他蛋白的帮助。2）GroupⅠ/Ⅱ的内含子自身折叠形成许多二级结构。催化branch site与G形成套索结构，之后再进行第二次转酯反应。进化上，高等生物使用剪切复合体替代了自我剪切的内含子序列，这可能是为了遗传密码的简洁性。

12、可变剪切涉及到使用不同的splice junction：1）特定的外显子可以包含或者被排除在RNA产物中。2）果蝇的性别决定涉及到一系列的可变剪切。3）果蝇的P 元件也展示了germline-specific的可变剪切。4）RNA剪切过程中，除了单独剪掉内含子之外，还可以剪掉外显子，这样就产生了mRNA水平上的多样性，这种剪切被称为可变剪切。13、小RNAs参与反式剪切反应：1）剪切一般是顺式方向的（cis-），但是在锥虫以及蠕虫中，一种短序列（SL RNA）沿前体mRNA的5’方向进行剪切。2）SL RNA有一种可以类似于Sm-结合位点结合的U snRNAs。3）反式剪切的两种类型：①操作过程中产生的2条包含互补的内含子序列的RNA分子相互靠近，乃汉字配对组成H-型分子。在剪切内含子的过程中进行反式剪切，之后，一部分第一条RNA上的外显子序列与第二条RNA上的外显子序列连接，组成新的RNA。②转录之后，一条mRNA分子的3’端含有一半的内含子序列以及35bp的leader sequences。另一条mRNA

分子则含有一半的内含子序列。剪切时，3’端一半的内含子与5’一半的内含子形成G与A之间的5’-2’键，由于没有形成套索结构，因此形似Y形。（注：提供5’外显子用于反式剪切的RNA为SL RNA（spliced leader RNA））

14、RNA编辑：转录后，RNA水平上的序列变化（apo-B基因的mRNA转录后将其CAA→UAA终止子）。RNA编辑可以在向导RNA的帮助下进行。例如对尿苷的编辑由20s的酶复合体组成。向导RNA指示U的位置，酶将其切除。15、酵母的tRNA的切割涉及到剪切以及联合：tRNA的剪切涉及连续的切割以及连接。①第一步的切割不需要ATP，其需要内切酶来切割磷酸键。②第二步需要ATP，并且涉及到键的形成，这一步需要RNA连接酶。

16、内切酶识别tRNA来进行剪切：1）内切酶同时切割tRNA内含子的两端。2）内切酶通过2个亚基sen34以及sen2来切割内含子的5’端以及3’端。Sen34通过“测量”tRNA上L-shaped结构的距离来确定切割位点。之后内切酶识别一种bulge-helix-bulge结构来指导切割。

（注：以下几节内容均略整理，有兴趣的参考基因Ⅸ相关章节）

17、tRNA切割以及连接时独立的反应：1）内含子的释放产生两个half-tRNA，它们之间的配对产生完整的tRNA。2）这些半位点有着不同寻常的5’-羟基末端以及2’-3’环状磷酸键。3）5’-OH末端被多聚核苷酸酶磷酸化。环状磷酸基团被磷酸二酯键酶打开，并且产生一个2’-磷酸末端以及3’-OH。外显子末端与RNA配体结合，2’-末端的磷酸基团被磷酸酶去除。

18、unfolded 蛋白与tRNA剪切相关：1）Ire1p 为一个核内膜蛋白。它的N-端区域在ER腔体（lumen）内，而它的C-端则位于细胞核中。2）1中的膜蛋白与unfolded蛋白在其N-端结构域结合会激活其细胞核内C-端的自身磷酸化反应。3）被激活的核酸酶（可能是C端的自身磷酸化激活了核内的磷酸酶）切割Hac1的mRNA，使其释放内含子，并且产生与tRNA配体相连接的成熟mRNA（没有与tRNA结合的mRNA都被降解掉了）。4）切割完成的Hac1 mRNA 编码转录因子，之后激活伴侣蛋白基因的转录，产生伴侣蛋白来帮助unfolded蛋白折叠。

19、mRNA的3’末端通过切割以及加PolyA尾来实现：1）AAUAAA序列为切割mRNA产生3’ polyA尾的信号。2）特异的因子以及内切酶切割RNA AAUAAA序列的下游。3）特异的因子以及polyA多聚酶加上大约200个A尾于2）步骤中刚刚处理好的3’末端。4）在蟾蜍的胚胎发育期中，3’尾部的A-U富集序列控制细胞质中加A尾以及去A尾的反应。

20、切割组蛋白（Histone）mRNA的3’末端需要小RNA的参与：1）组蛋白mRNA的末端是不加polyA尾的，其mRNA 的3’末端的产生依赖于对mRNA相应结构的切割反应。2）切割反应需要SLBP与mRNA上形成的茎-环结构结合（其实就是发夹结构），同时U7 snRNA也会与mRNA上的一致序列配对来帮助切割。

21、rRNA的产生需要切割反应：大小rRNA都需要从切割前体RNA来形成。

22、rRNA的形成过程需要小RNA的参与：1）小核RNA（sno RNA）的C/D基团修饰特定位点的核糖2’位甲基化。2）sno RNA的H/ACA group可以将尿嘧啶转变为假尿嘧啶。3）sno RNA与rRNA相应一致性序列配对使rRNA弯曲成适合修饰的构象。

23、蛋白剪切为自我催化：蛋白剪切是自我催化的过程，内蛋白（intein）从蛋白内部移除，外显肽（extein）则通过肽键重新连接。外显肽序列在进入蛋白剪切阶段之前一直保留在成熟的蛋白之中，内蛋白则通过蛋白剪切作用被剪出去。

PART Ⅳ蛋白翻译体系

第十二章信使RNA

1、简介：RNA在基因表达中承担了很重要的角色，包括mRNA、tRNA以及rRNA。mRNA携带编码序列，rRNA提供与密码子相对应的氨基酸，rRNA是核糖体的主要组成部分，为蛋白合成提供环境。

2、tRNA简介：tRNA在翻译中的功能有两项，一是将氨基酸运载到核糖体，二是通过其反密码子与mRNA上的密码子之间的相互作用对遗传密码进行解码，将其最终转化为多肽链上的氨基酸序列。tRNA的一级结构是在3’-端具有CCA序列，氨基酸通过酯键连接在末端腺苷酸的羟基上。tRNA含有大量的修饰碱基，包括二氢尿嘧啶（D）以及假尿苷，这些修饰的碱基在二级结构中的环里面特别的多。tRNA的二级结构是三叶草结构，由4个茎和3个环组成。三个环为D环、TφC环、以及反密码子环。三级结构为倒L形，D环中的一些核苷酸与TφC环中的一些核苷酸组成氢键，这促进了tRNA的折叠。

3、mRNA：反义链（模板链）：DNA中有意链的互补链，以其为模板合成mRNA。编码链（有义链）是DNA中与mRNA 序列相同的单链，以遗传信息的形式在蛋白序列中反映出来。

4、核糖体：核糖体是一些RNA和蛋白质的聚合体，以mRNA为模板合成蛋白质，原核核糖体为70s，真核核糖体为80s，核糖体由两个亚基组成。翻译时，许多核糖体同时结合到mRNA上，沿着5’→3’的方向移动。每个核糖体都有两种tRNA分子，一种携带初始蛋白，另一种携带接下来需要加入的氨基酸。30s亚基与mRNA分子相连接，50s亚基携带新合成的蛋白，tRNA贯穿这两种亚基。

5、原核mRNA：原核细胞的转录和翻译同时发生，核糖体在mRNA完全合成之前就开始翻译。因为细菌的mRNA分子十分不稳定，半衰期大概只有半分钟。这种没有完全合成的RNA称为初始RNA。单顺反子mRNA只编码一个蛋白质，多顺反子mRNA包括多个编码区域。细菌的mRNA包括非翻译区以及翻译区，每一个编码区域都有其自己的起始以及终止信号，因此一个典型的细菌mRNA有多个编码区域。

6、真核mRNA：真核的mRNA在转录完成之后会进入加工环节，加工包括5’的加帽子以及3’的加polyA尾，其中，polyA尾可能长达200bp。总的来看：动物细胞的mRNA表达至少需要以下环节：转录、修饰、加工、核-质运输以及翻译。

5’加帽子：转录开始于核苷酸的磷酸基团上（通常为嘌呤A或者G）。最初的转录序列通常表现为5’pppA/GpNpNpNp…..5’末端的磷酸基团在开始转录后就直接被修饰加G。这种反应被一种核酶催化——鸟苷酸转移酶，之后产生一种独特的由两个核苷酸组成的5’-5’三磷酸键结构。这种反应整体上表现为5’端磷酸基团附近的GTP 富集。5’端的加帽子防止了mRNA自5’端的降解，并且有可能对帽子上的G进行修饰，修饰位置的不同产生了不同种类的帽子。cap0：加帽子后在第一个G上甲基化。Cap1：前两个碱基都甲基化。Cap2：在前两个碱基甲基化后，第三个碱基也甲基化的结构。应用（RACE全长基因的克隆）方法1：oligo-capping method、方法2：5’-RACE

3’加poly（A）尾巴：几乎所有的真核mRNA都会在3’末端加上额外的A残基，这种额外的序列被称为poly（A）尾；mRNA也以polyA尾作为其特征。PolyA通过polyA聚合酶加入到3’-OH（自由的）末端，可以长达200bp。3’端的polyA尾并不会单独存在，一种名为polyA结合蛋白（PABP）会和polyA末端相连。一个PABP单体每70kD连接10-20bp的polyA。所以通常情况下，mRNA的3’末端由一长串polyA以及大量的蛋白组成。3’-端polyA的功能：尽管polyA的存在对3’-末端有着直接上的结构功能。然而，3’末端的polyA与5’帽子有着潜在的关系。PABP与5’帽子上的蛋白eIF4G相结合，这样作用的结果使得mRNA形成闭合环状结构。与polyA最普通的功能一样，这两种作用都可以稳定mRNA，防止其被降解。

应用：早期的胚胎发育有很多例子证明mRNA的多聚腺苷化被用于控制翻译。在某些情况下，mRNA以非腺苷化被储存起来，当其需要翻译时，polyA尾才会加到其3’末端。其他情况下，当翻译减弱时，PolyA尾mRNA的A会被去腺苷化。

7、mRNA的降解与稳定：

细菌mRNA的降解：细菌mRNA的降解需要两个过程，内切核苷酸酶在核糖体后沿着5’-3’的方向进行切割。被切下来的片段会被外切酶沿着3’-5’降解。

真核mRNA的稳定：真核mRNA的末端修饰防止了mRNA被外切酶降解。mRNA中特定位点上的序列则决定了mRNA 的稳定与否。一旦mRNA缺失了polyA，那么降解就有可能被激活，因为polyA可以抵御3’-5’的外切酶作用。一些不稳定的mRNA大多具有以下特征：3’尾端区域出现50bp左右的AU富集序列（被称为ARE）。ARE序列中存在多次重复的5聚体核苷酸：AUUUA。ARE激活降解过程：主要有两个过程，首先mRNA被去腺苷化，其次，它被外切酶以及内切酶降解。而3’-末端去腺苷化的同时会启动5’-末端的脱帽子反应。这一联系的基础是，PABP可以抑制5’-脱帽酶的活性。5’-脱帽会导致内切酶从5’-端开始降解mRNA。

2种降解的途径，一是3’-5’降解途径：1）去腺苷化。2）内切酶降解。3）3’-5’外切酶降解。二是无意义序列的检测系统：无意义突变（蛋白合成提前终止的突变）经常导致mRNA的降解。降解过程与终止事件相连，并且发生在细胞质中。这提供了一种mRNA翻译的质量控制系统。质量检测系统需要两种类型的组分。一种蛋白在核内和外显子-外显子连接结合来指示内含子剪切，另一种蛋白在核内或者细胞质内与mRNA结合，当蛋白翻译提前终止，核糖体脱落的时候，这种蛋白激活mRNA的降解过程。

真核RNA的转运：RNA以核糖核蛋白颗粒的形式运出核膜。所有在细胞质中起作用的真核的RNA都必须从核中被运出。tRNA以及核酶会被运到线粒体中。mRNA可以在植物细胞中运动很长距离。

mRNA的转运与定位：一些mRNA在特殊的地方翻译，最佳例子就是酵母细胞中的Ash1定位翻译。Ash1mRNA组成一个核糖-核蛋白复合体，其中包含马达蛋白将其沿微丝从母细胞运输到子细胞，因为Ash1只在出芽的子细胞中起作用。而另一些果蝇卵中的mRNA则组成核糖-核蛋白颗粒，通过与微管蛋白相连接使其定位到最终位置。

第十三章蛋白质合成

1、遗传密码：密码子与相应的氨基酸相对应。同义密码子（synonym codon）：遗传密码上有着相同的意义。同义tRNA 携带相同的氨基酸，相应相同的密码子。第三碱基简并性（third base degeneracy），大多数氨基酸同义密码子的差别在第三位核苷酸。摆动假说（The wobble hypothesis）：密码子在与反密码子相互识别时，前两对碱基严格遵守标准的碱基配对规则，最后一对碱基具有一定的自由度。这说明第三对碱基对密码子的意义影响最小。三联体密码子中61个代表氨基酸，还有3个代表终止信号。

密码子的通用性与例外：在部分原核细胞中（例如支原体），UGA并不是终止信号，反而是try的密码子。一些原生动物中UAA以及UAG是谷氨酸（Glu）的密码子。酵母菌（白假丝酵母）中，CUG是ser的密码子而不是Leu，而且UAG是有意义的密码子。因此，线粒体中的密码子的改变可以用系统发育树的方式来研究。

（细菌翻译起始）

2、细菌翻译的起始需要30s亚基以及其他因子：1）30s亚基携带起始因子与mRNA结合从而组成起始复合体。2）细菌翻译需要三个起始因子（IF）①IF-3首先与池（pool）中70s核糖体解离下来的30s亚基结合，并且阻止30s亚基与50s亚基结合组成完整的核糖体。之后IF-3与mRNA中位于起始密码子上游的核糖体结合位点结合（SD序列），使30s与mRNA结合。IF-3同时具有鉴别第一个氨酰-tRNA的准确性的能力。②IF-1与30s亚基结合，再占据核糖体的A位，阻止氨酰-tRNA的进入。③IF-2与起始tRNA结合，并与核糖体上的P位结合。IF-2具有核糖体依赖型的GTP酶活性，水解GTP后，50s与30s亚基结合，核糖体组装完成，起始因子脱落。

3、合成多肽链从一个特别的起始tRNA开始：1）蛋白合成的第一个氨基酸是甲硫氨酸，对应于起始密码子AUG。2）用于起始的甲硫氨酸-tRNA不同于延长阶段的甲硫氨酸-tRNA。3）用于起始识别的tRNA不同于延长阶段的tRNA。4）用于起始识别的甲硫氨酸的NH2基团会被甲酰化。5）两方面的原因决定了fMet-tRNA作为一个独特的起始tRNA：①Met的游离-NH2被甲酰化使得N-formyl-Met不能参与延长过程。②tRNA主茎上最后一对碱基为不配对的AC这是甲酰化所必须的。而在密码子环存在3对G-C对，这使得该tRNA可以进入P位。另外，如果延长过程中又需要Met的话，那么，细菌或线粒体中有专门的去甲酰化酶。

4、对fMet-tRNA的使用受到IF-2以及核糖体的调控：IF-2与fMet-tRNA结合进入核糖体P位，IF-3check。

5、起始涉及到mRNA以及rRNA之间的配对：核糖体的16s rRNA的3’端与mRNA上的SD序列互补配对。SD序列为多嘌呤序列，位于起始密码子的上游，大约为10bp长，保守性高。

（真核翻译起始）

6、真核中核糖体小亚基扫描mRNA来寻找起始位点：真核细胞的核糖体40s亚基在起始因子的帮助下，从5’加帽处开始向3’端扫描，遇到二级结构将其melting，找到的起始密码子必须为适当的结构NNNA/GNNAUGG，起始密码子AUG上游的第三个碱基为A或者G（均为嘌呤），AUG后面的一个碱基为G，这样的话翻译效率将提高10倍。此序列为10bp的复合体。

7、真核细胞使用许多起始因子：1）真核生物的起始tRNA不会甲酰化，其在64位碱基的核糖的2’位上磷酸化，被称为tRNAi Met。2）几种不同的起始复合体：43s复合体包括elF2、elF3、Met-tRNA。加帽复合体包括mRNA、elf4A、B、E、G。48s复合体包括elF2、eIF3、elF1、1A、elF4A、B、F。3）mRNA复合体的各因子功能：elF4E为帽-结合亚基，并且作为一个调节亚基、elF4A为解旋酶、elF4G为支架蛋白、elF4F为elF4E的激酶，将其磷酸化，使其活性上升。elF4A与elF4B一同将mRNA的前15bp序列的二级结构解开，这需要消耗ATP能量。而elF4G则与PABP末端蛋白相连形成mRNA的环状复合体。

elF2-GTP与tRNAi Met结合形成复合体。

4）真核翻译起始复合体形成的完整过程：①形成43s复合体：elF3与40s亚基结合使其保持解聚状态，之后elF2-tRNAi Met 与40s亚基结合形成43s复合体。②43s复合体与mRNA结合elF4G与elF3结合，40s亚基与elF4F结合。③48s复合体的形成：elF1、elF1A与40s亚基结合，他们水解ATP供48s复合体向前扫描。④60s亚基的加入，形成完整核糖体：一旦48s复合体扫描到AUG序列（10bp区域），tRNAi Met就会与AUG互补配对。elF5使elF2水解，elF1、elF1A、elF2、elF3均脱落，之后elF5B介导60s亚基与40s亚基组合成完整核糖体。⑤起始因子进入下一个循环：elF2B催化elF2-GDP 转化为elF2-GTP形式。同时elF2也是调控target。调控kinase作用于elF2的α亚基，阻止蛋白复合体的合成。

（延长阶段）

8、延长因子Tu将氨酰-tRNA带入A位点：1）EF-Tu是一个G蛋白单体，其GTP形态可以与氨酰-tRNA结合。2）EF-Tu-GTP-氨酰-tRNA复合体进入核糖体的A位。3）延长过程总结：Tu-GDP中的GDP部分被Ts替代，之后Ts又被GTP替代，Tu-GTP与tRNA AA结合形成三元复合体。EF-Tu-GTP携带tRNA AA进入核糖体的A位。密码子与反密码子之间的识别促使核糖体的构想改变，这导致EF-Tu的GTP水解，tRNA的CCA端进入A位，EF-Tu-GDP脱落，进入下一个循环。4）EF-Tu-GTP水解具有“质量控制”功能。当错误的氨酰-tRNA进入A位之后，GTP水解的同时也会使错误的氨酰-tRNA 脱落。5）真核中eEF1α负责将氨酰-tRNA带入核糖体，同样，反应涉及GTP的水解，其功能与EF-Tu类似。而真核中与EF-Ts类似的为eEF1βγ。

9、多肽链的转位：1）细菌中50s亚基具有多肽转移酶活性。2）多肽链的转位方向为P位至A位。

10、核糖体的移位运动：1）核糖体移位以3个碱基为单位。2）转位作用使得脱氨酰tRNA进入E位，而多肽-tRNA 从A位移到P位，A位空出。转位过程中，50s先相对30s亚基移动，之后30s亚基再沿mRNA移动。

11、延长因子交替的与核糖体相连：核糖体的转位需要EF-G的参与（原核）：EF-G/GTP进入A位，同时与30s与50s 的亚基结合。EF-G/GTP水解GTP使EF-G构象改变，核糖体发生转位。之后，EF-G脱落，EF-Tu进入。注：EF-G不能与EF-Tu同时进入A位点。

12、蛋白因子识别终止密码子：1）终止密码子由蛋白释放因子（RF）来识别，不是氨酰-tRNA。2）原核终止：class1 factor RF1及RF2分别识别终止密码子UAA/UAG，以及UGA/UAA，之后RF1/2水解多肽tRNA，释放多肽。之后class2 factor RF3通过EF-G得到GTP，水解GTP使得RF1/2自身脱落。但是tRNA以及核糖体、mRNA还连接在一起，RRF 通过与EF-G相连接，之后再与核糖体上的50s亚基相连，水解GTP释放50s以及30s亚基。IF-3与30s亚基相连，使其脱氨酰化并阻止其与50s亚基重聚。注：EF-G使得RRF由A位移动到P位，释放tRNA。3）真核中只有class1 factor eRF1。Domain 2水解多肽链，domain 1与反密码子结合。

13、核糖体RNA的重要性：16s rRNA识别SD序列，23s rRNA具有多肽转移酶活性。

PART ⅤDNA重组

第十四章同源重组以及位点特异性重组

前言：重组是自然选择的基础：提供了一种尽量少的基因操作频率的途径来筛选合适的基因，淘汰不合适的基因

以及与其相关的基因。重组分为同源重组以及位点特异性重组，同源重组发生在两个同源的DNA链之间，在链的任意位点产生交叉，进而发生重组，重组后DNA的总体排列不变。位点特异性重组仅仅发生在特定位点之间，一般发生在环状DNA分子以及线性DNA分子之间，（环状DNA可以插入线性DNA分子，也可以是环状分子自己发生重组）结果通常是DNA分子发生重排。

1、同源重组机制：包括Holliday模型、单链断裂模型、双链断裂模型、逆转座的拷贝选择模型等。

同源重组发生必须满足下列条件：1）在进行重组的交换区域含有完全相同或几乎相同的核苷酸序列。2）两个双链DNA分子之间需要互相靠近，并发生互补配对。3）需要特定的重组酶的催化，但重组酶对碱基序列没有特异性。4）形成异源双链。5）发生联会。

Holliday模型：1）2个同源的DNA分子相互靠近。2）2个DNA分子各有1条链在相同的位置被一种特异性的内切酶切开，被切开链的极性相同。3）被切开的链交叉并与同源的链连接，形成X状的Holliday连接。4）Holliday 连接的拆分：有两种拆分，一种是相同的链被第二次切开，结果产生于原来完全相同的两个非重组DNA；第二种是另一条链被切开，然后再重新连接，由此产生重组的DNA。

单链断裂模型：2个进行重组的同源DNA分子在同源区域相应的位点上只产生一个单链裂口。单链裂口可能是自发的，也可能是环境压力诱导而成。产生切口的那条链在被DNA聚合酶催化的新链合成取代后，侵入到另一条同源的DNA分子之中，Holliday连接的形成以及拆分与Holliday模型相同。

双链断裂模型：1个DNA分子上两条链的断裂才起动了链的交换。两个重组DNA分子中产生断裂的双链被称为受体双链，不产生断裂的被称为供体双链。随后发生的DNA修复合成以及切口连接导致形成Holliday连接，但有2个半交叉点。1）内切酶切开一个同源DNA分子的两条链，导致这个DNA分子双链发生断裂。2）受到外切酶的作用，双链切口扩大而产生具有3’-单链末端的空隙。3）一个自由的3’-端入侵供体双链DNA分子同源的区域，形成异源双链，供体双链的一条链被取代，产生取代环（D环）。4）由入侵的3’-端引发的DNA修复合成导致D环延伸。D环最终大到覆盖受体双链的整个空隙。新合成的DNA是由被入侵的DNA双链作为模板，于是新合成的DNA序列由被入侵的DNA决定。5）当供体双链被取代的链到达受体双链空隙的另外一侧，它将和空隙末端的另一个3’-单链末端退火。于是被取代的单链提供了序列，填补了受体双链一开始被切除的序列。由DNA聚合酶催化的修复合成将供体双链的D环转变为双链DNA。在以上两个步骤中，最初被入侵的双链充当供体双链，提供修复合成反应的遗传信息。6）DNA连接酶缝合缺口，形成两个Holliday连接。7）Holliday连接的拆分有两种可能的途径，一种是两个切口一个在内侧的链，另一个在外侧的链，那么分离得到的是交换产物，另一种途径两个切口要么都在内侧的链，要么都在外侧的链，得到的是非交换产物。

2、大肠杆菌的几种重要的同源重组途径

1）RecBCD途径：这是大肠杆菌最主要的重组途径。除了RecBCD蛋白以外，还需要RecA、SSB、

RuvA、RuvB、RuvC、DNA聚合酶Ⅰ、连接酶和旋转酶。此外还需要X序列。

过程：1）RecBCD识别X序列，在X序列切割位点上进行切割。2）RecA和SSB与单链区域结合。3）链侵入，形成D环。4）搜寻同源序列。5）剪切，链交换，SSB蛋白脱落。6）形成Holliday连接。7）RuvAB催化交叉点迁移。8）RuvC催化分离。

各种蛋白的作用：

RecBCD蛋白：RecBCD蛋白参与细胞内的RecBCD同源重组途径，其功能是产生3’-单链末端，

为链入侵做准备。RecBCD蛋白又称为RecBCD酶，由RecB、RecC、RecD三个亚基组成，具有5种酶活性，即外切核酸酶v、解旋酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶。这些酶活性能够自动发生转换，用于重组的不同阶段。

RecBCD作用模型：RecBCD首先与双链DNA分子自由末端结合，依靠ATP的水解为动力，

沿着双链移动，解开双链，但它在上面一条链比下面一条链的移动速度快，于是一个单链的环就形成了，这种环随着它沿DNA双链的移动而增大，显示依靠它的3’-外切酶活性降解3’-链。然后，一旦遇到X序列，释放RecD亚基，3’-外切酶活性减弱，而5’-外切酶活性被激活，于是5’-链的单链部分被迅速降解水解，留下上面一条链的单链部分。产生的单链DNA，为RecA作用的底物，由此起动了链交换和重组反应。说明：X序列是一段特殊的碱基序列，其一致序列是5’-GCTGGTGG-3’，它的存在能显著提高重组的频率。在重组中的作用是调节RecBCD的酶活性，作为其从3’-外切酶切换为5’-外切酶的信号，刺激RecBCD重组途径。

2）大肠杆菌中参与重组的蛋白：

RecA蛋白（单链积累作用）：参与E.coli的所有的同源重组途径。在重组中的主要作用是促

进同源序列配对和链交换。RecA蛋白有单体和多聚体两种形式，含有两个DNA结合位点，能分别结合单链DNA和双链DNA。多聚体是由单体在单链DNA上从5’→3’方向组装而成的丝状结构。多聚体的RecA环绕在单链DNA上形成一种有规则的螺旋。主要功能包括：1、促进2个DNA分子之间的链交换；2、参与SOS反应——作为共蛋白酶促进LexA蛋白和UmuD的自水解。

具体作用分为3步：1、联会前阶段：RecA通过它的第一个DNA结合位点与单链DNA结合，

包被DNA，形成蛋白质-DNA丝状复合物。2、联会阶段：RecA的第二个DNA结合位点与1个双链DNA分子结合，形成三链DNA中间体，随后单链DNA侵入双链DNA，寻找同源序列。3、链交换阶段：由被RecA包被的单链DNA 从5’→3’方向取代双链DNA分子中的同源老链，形成异源双链，并发生分叉迁移。

Ruv复合体：解开Holliday连接。RuvA蛋白：识别Holliday连接，协助RuvB蛋白催化分叉

的迁移。因为RuvA蛋白是四聚体结构，能够与Holliday连接中的4个DNA双链结合，从而促进分叉迁移过程中链的分离。RuvB蛋白：本质上是一种解旋酶，功能是催化重组中分叉的迁移。包被双链DNA，单独结合DNA需要RuvA 的帮助。与DNA结合后为6聚体，2个RuvB六聚体与RuvA结合。RuvC蛋白：核酸内切酶，在重组中的作用是促进Holliday连接的分离，又被称为拆分酶。RuvC以对称的同源二聚体形式发挥作用，与Holliday连接对称结合，在Holliday 连接的中央部位切开4条链中的2条，而导致Holliday连接的拆分。RuvC的作用具有序列特异性。

3、真核生物的同源重组：真核生物的同源重组主要发生在细胞减数分裂前期1的两个配对的同源染色体之间，在粗

线期进行交换。有时，同源重组也会发生在DNA损伤修复之中，主要用以修复DNA双链断裂、单链断裂和链间交联等损伤。真核生物的同源重组机制是保守的。

过程：1）双链特异性断裂。2）5’-端进行修剪，由RAD复合体结合到3’-端，沿3’-方向水解5’-末端链。3）蛋白复合体与DNA链结合，形成DNA-蛋白丝复合物。4）进行同源区搜索，链侵入。5）DNA聚合酶进行DNA修复合成。6）DNA连接酶进行缺口连接。

4、位点特异性重组：指发生在DNA特异性位点上的重组。参与重组的特异性位点需要专门的蛋白质识别和结合。

位点特异性重组的功能包括：1）调节噬菌体DNA与宿主染色体DNA的整合。2）调节特定基因的

表达。3）调节胚胎发育期间程序性的DNA重排。

入噬菌体的位点特异性重组：

参与反应的元件：1、attB（附着位点）：E.coli染色体上供入噬菌体DNA特异性整合的位点，它位于gal操纵子和bio操纵子之间。其序列只有30bp长，中央含有15bp的保守区域，重组就发生在该区域，简称为BOB’。2、attP（噬菌体上的重组位点），其中央含有与attB一样长的同源保守序列，以POP’表示。attP的两翼序列非常重要，因为他们含有重组蛋白质的结合位点。3、整合酶（Int）、整合宿主因子（IHF）均由噬菌体编码，两种蛋白质结合到P臂和P’臂上，促使attP和attB的15bp保守序列能正确的排列。其中Int催化了重组过程的所有反应，包括一段7bp长的分叉迁移。不需要RecA蛋白的作用。4、酶（酪氨酸重组酶家族），包括Int、XerD蛋白、P1噬菌体的Cre蛋白和酵母的FLP蛋白。链切割和重连接反应与Ⅰ型的拓扑异构酶相似，没有磷酸二酯键的水解，也没有新的DNA的合成不需要ATP。

位点特异性重组包括整合以及剪切两个部分。整合（attB×attP）需要噬菌体基因int编码整合酶Int，以及细菌编码的IHF。剪切（attL×attR）需要噬菌体基因xis编码剪切酶Xis，以及Int、IHF，并且Xis可以抑制整合过程。

整合反应过程：1）两个整合酶4个亚基分别结合到每一个双螺旋DNA分子上。2）每一个双螺旋DNA有一条链被整合酶的Tyr-OH活性中心切割产生一个3’-P-Tyr酯键以及一个5’-OH末端。3）每个5’-OH进攻另一个双螺旋DNA 上的Tyr-P酯键，重新形成3’,5’-磷酸二酯键，从而形成Holliday连接。4）另一条链反应相同。

剪切反应过程：需要Int和IHF以外，还需要Xis和Fis蛋白。Xis是一种切除酶，由噬菌体编码。Fis由细菌编码。这四种蛋白质都是与attL和attR上P臂和P’臂结合，促进attL和attR的15bp保守序列的正确排列，从而有助于原噬菌体的释放。

入噬菌体的整合和切除受到严格的调控。当其入侵到E.coli之后，整合能否发生主要取决于Int的合成。Int基因的转录调控和cⅠ基因的调控是一致的。

5、位点特异性重组的应用：1）细菌噬菌体P1的Cre/Lox系统应用到真核生物的特异性位点重组。2）酵母菌使用

特异性的位点重组机制来开启交配型。3）GATEWAY克隆技术的应用。

6、转座重组：是指DNA分子上的核苷酸序列从一个位置转移到另一个位置的现象。发生转位的DNA片段称为转座

子，或跳跃基因。与前两种重组不同的是，转座子的靶位点与转座子之间不需要序列的同源性。接受转座子的靶

位点大多数是随机的，但也可能位于热点附近，具体则与转座子本身的性质有关。转座重组可以导致突变，也可能改变基因组DNA的量。转座子的插入可以改变附近基因的活性。插入到基因内部会导致基因失活，插入到基因上游又会导致基因激活。而且转座可以导致基因组内核苷酸序列发生转移、缺失、倒位或者重复。此外，转座子本身还有可能充当同源重组系统的底物，因为双拷贝的同一种转座子提供了同源重组所必需的同源序列。

原核生物的转座子：1、插入序列（IS）:一段小的细菌转座元件，只携带用于其自身转座的基因。IS序列末端有短的末端反向重复。具体特征：1）长度较小，位于700bp-1800bp之间。2）两端含有10-40bp长的IR序列，IRR和IRL非常相似，但是不一定相同。3）内部一般只有一个基因，其表达产物只与插入事件有关，是专门催化转位反应的转座酶（tnpA），缺乏抗生素或其他毒性抗性基因。转座酶的量受到严格的调控，它是决定转座频率的主要因素。4）通过剪切和插入的方式进行转座，转座结束之后可能导致靶位点重复。5）有少数没有IR序列，通过滚环复制和插入的方式进行转座。

2、复杂型转座子特征：1）长度在2.5kb-20kb之间。2）两侧含有35bp-40bp长的IR序列。3）内部通常含有不止一个结构基因。常见的结构基因包括：tnpA-编码转座酶，tnpB——编码解离酶，一个或几个特定的抗生素抗性基因。4）转座以后导致约5kb长的靶位点序列发生重复，结果导致在转座子两侧产生直接重复序列。

3、复合型转座子：由2个IS和一段带有抗生素抗性的间插序列组成，其中2个IS位于转座子的两侧，具有相同或相反的方向。

真核生物的转座子：真核转座子与原核转座子的差异主要在转座的机制上，体现在两个方面：1）真核转座子在转座过程中的剪切和插入是分开进行的。2）真核转座子的复制很多需要经过逆转录即RNA中间物来进行。DNA 转座子可以分为复制型DNA转座子和保留型DNA转座子，其中，前者在转位前后，原位置上的拷贝并没有消失，只是将转座子序列复制一份，并转移到新的位点；而后者在转座中，原有的拷贝被原封不动的转移保留到新的位点。

1）复制型DNA转座子：这一类转座子统称为Helitron，它们以滚环复制的方式进行复制，然

后再插入到新的位点。Helitron的两端没有IR序列，在转座之后，也不会使靶位点序列发生重复，从5’-TC开始，到3’-CTRR结束。在CTRR上游有一段16nt-20nt长的无保守性的回文序列，可以形成发夹结构。Helitron 内部的基因可能有1-3个，基因编码的蛋白质一般含有5’→3’解旋酶和核酸酶或连接酶的结构域。

2）保留型DNA转座子：真核生物的绝大多数DNA转座子属于此类。如玉米的AC-DS系统、

果蝇的P元件、广泛存在于一系列生物体内的“水手”元件，以及在水稻和线虫体内的微型反向重复转座元件。

玉米的AC-DS系统：Ac和Ds分别属于自主型和非自主型DNA转座子，Ac表示激活子元件，它带有全功能的转座酶基因；Ds表示解离元件，中间只有缺失的、无功能的转座酶基因，它实际上也是Ac经由不同的缺失突变而来的。由于Ds不能合成转座酶，所以单独不能移位，只有Ac存在时，Ds才会移位。玉米种子的颜色由紫色色素基因C决定。如果Ac或者Ds插入到C基因内部，则紫色色素基因失活，于是玉米籽粒不能产生紫色色素，成为黄色。如果Ds从C跳开，C基因能够正常表达，玉米籽粒又变成紫色。而如果Ds远离Ac 或者Ac本身跳开，Ds则不再受Ac的控制，它又可以发挥对结构基因（SG）的抑制作用，使玉米籽粒成为黄色。Ac和Ds在染色体上的跳动十分活跃，使得受他们控制的颜色基因时开时关，于是玉米籽粒就出现了斑斑点点。

果蝇的P元件：长度约为2.9bp，两端含有31bp的IR序列，内部含有4个开放的阅读框。P元件的转座可以引起染色体的断裂和基因突变，由此可以导致细胞的死亡。P元件的转座只能在生殖细胞内发生，因为只有在生殖细胞内转座酶的RNA才能正确拼接，翻译出具有活性的转座酶，而在体细胞内，一个内含子不能被除掉，由这种RNA翻译出来的产物是转座的阻遏物。上述阻遏物也存在于含有P元件的卵细胞的细胞质，因此含有P元件的雌果蝇与缺乏P元件的雄果蝇交配不会产生不育后代，而含有P元件的雄果蝇与缺乏P元件的雌果蝇交配，则产生许多不育后代。

“水手”元件：长1.3kb，两端为一段短的IR序列，内部只有1个转座酶基因。水手元件具有水平传播的能力，能够在不同的物种之间水平转移。

逆转座子：真核生物的基因组中所占的比例较大，根据两端的结构可以将其分为LTR逆转座子和非LTR逆转座子：LTR逆转座子的两端含有与逆转录病毒基因组mRNA经逆转录产生的类似的LTR序列；非LTR逆转座子没有LTR序列，但有一端含有一小段重复序列（通常是PolyA）。不管是哪一类，都有自主和非自主型之分。

自主型内部含有gag基因和pol基因，pol基因编码蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H和整合酶。但是缺乏编

码逆转录病毒外壳蛋白的env基因。如果是非自主型的，则内部序列大小变化很大，已丧失大多数或者全部编码功能。属于LTR逆转座子的有果蝇基因组上的Copia元件和酵母基因组上的Ty元件，属于非LTR逆转座子的有LINE和SINE。

酵母的Ty元件：Ty元件可分为六大家族，但并不是都具有转录的活性。具有转录活性的Ty元件属于自主型逆转座子，内部含有活性的tyA基因（类似于gag）和tyB基因（类似于pol）。tyA编码一种DNA结合蛋白，tyB编码逆转录酶。但由于缺乏编码逆转录病毒外壳蛋白的env基因，因此，它们在细胞内并不能装配成感染性的病毒颗粒，但可以形成类似于病毒的颗粒。

果蝇的Copia元件：长度为5.1kb，每一个果蝇基因组大概有20-60个拷贝，其LTR长度约为276bp。每一个copia的内部含有单一的长阅读框，编码由整合酶、逆转录酶和一种DNA结合蛋白组成的多聚蛋白质。Copia 转座的效率略高于Ty元件，它的转座可以导致靶位点上5bp左右的序列发生重复。

LINE和SINE：它们都缺乏L TR序列，LINE由长散步序列组成、SINE由短散步序列组成。人的LINE主要由LINE-1和LINE-2组成，主要为LINE-1，含有2个开放的阅读框，一个相当于gag基因，编码一种DNA结合蛋白，另一个编码逆转录酶。由于L1-DNA的转录终止并不总是精确地，有时通读，有时提前结束，结果导致一些转录产物被加长或者截短，这就是L1序列不均一的原因，被截短的L1很可能就丧失了某些功能。有时，L1-RNA翻译出来的逆转录酶活性偶尔将细胞内其他基因的mRNA逆转录成cDNA，并将它整合到基因组DNA 上，从而产生假基因。通过这种手段产生的假基因既少掉正常基因所具有的内含子，也少了真基因转录所必需的启动子和其他调控序列，因此没有转录活性。人类基因组中含有大量SINE，在靠近5’-端含有RNA pol Ⅲ所识别的内部启动子序列。绝大多数SINE属于Alu家族或Alu序列。

7、转座机制：转座机制一般分为两种类型：一种是简单转座，需要先将原来的转座元件剪切，然后再插入到新的位

置。另外一种是复制型转座，只是将原来的转座元件复制一份，再插入到新的位置。无论是哪一种机制，起主导作用的都是转座酶。

转座酶种类：1）DDE-转座酶：含有高度保守的三联体氨基酸残基，即Asp（D）、Asp（D）和Glu（E），这三个氨基酸残基是参与催化的2价金属离子（Mg2+）与酶分子的配位结合所必需的。2）Y2-转座酶：活性中心有2个Tyr残基参与催化；3）Y-转座酶：活性中心的1个Tyr残基参与催化；4）S-转座酶：活性中心的Ser残基参与催化；5）RT/En转座酶：由逆转录酶和内切酶组成而成。

简单转座机制：这种机制只是将起始位点上的转座子剪切下来，然后再插入到新的靶位点上去。显然，在转座完成之后，起始位点上的转座子序列已经消失。因此转座子的拷贝数维持不变。参与此种转座的酶主要是DDE-转座酶，也有某些转座子使用Y-转座酶或者S-转座酶。利用此转座机制的转座子有：IS10、IS50、P元件、Ac/Ds 元件和水手元件等。机理：由DDE-转座酶催化的转座子的剪切有三种方式：1、转座子的3’-端被切开，形成3’-OH 和5’-P。随后，3’-OH亲核进攻另一条链上转座子5’-端的磷酸二酯键，导致形成两端带有发夹结构的游离转座子。

当发夹结构被切开之后，就被转移到靶位点上；2、转座子的5’-端被切开，形成3’-OH和5’-P。随后，3’-OH亲核进攻另一条链上转座子3’-端的磷酸二酯键，使转座子直接游离出来，但转座子两侧的DNA则形成发夹结构；3、先是转座子的5’-端和3’-端被先后切开，没有发夹结构的形成。

复制型转座：这种机制需要将起始位点上的转座子复制一份，然后再插入到新的位点上。显然，每转座一次，拷贝数就增加一个。有的转座子的复制不需要RNA中间物，有的需要RNA中间物，分别讨论。不需要RNA中间物的转座子复制：不使用RNA中间物的复制一般使用滚环复制，由Y2-转座酶催化，使用此机制复制的转座子有IS91和Helitron。有两种模型解释这种转座子的复制，模型1认为复制和插入分开进行：1）转座酶切开转座子起点的一条链，产生5’-P-酪氨酸酯键连接和3’-OH；2）以3’-OH作为引物，开始链取代合成；3）转座酶在转座子的终点以同样的方式切开同一条链，从而游离出单链的转座子；4）新合成的DNA链的3’-OH亲核进攻位于转座子终点的5’-P-酪氨酸酯键，形成磷酸二酯键，并释放出转座酶；5）转座酶在靶位点上切开DNA的一条链，同样产生5’-P-酪氨酸酯键连接和3’-OH；6）前面被游离出来的单链转座子通过其3’-OH亲核进攻靶位点上5’-P-酪氨酸酯键，致使单链转座子插入到靶位点；7）靶位点上3’-OH亲核进攻单链转座子上的5’-P-酪氨酸酯键，靶位点的切口被缝合，转座酶得到释放；8）在靶位点的另一条链上进行DNA的修复合成，产生转座子的互补链。还有一种模型认为复制与插入是同时进行的：1）转座子的起点和靶位点同时被转座酶切开，产生5’-P-酪氨酸酯键连接和3’-OH；2）靶位点上的3’-OH进攻转座子起点上的5’-P-酪氨酸酯键，形成新的磷酸二酯键，致使转座子的一端插入到靶位点；3）在转座子起点的3’-OH开始DNA链取代合成，导致转座子的一条链被取代；4）转座酶在终

点的剪切导致转座子的一条链完全插入到靶位点上；5）在转座子和靶位点上分别进行3’-OH亲核进攻5’-P-酪氨酸酯键的反应，致使两个位点上的切口被缝合；6）在靶位点的另一条链上进行DNA的修复合成，产生转座子的互补链。需要RNA中间物的转座子复制：逆转座子都需要RNA中间物，但LTR-逆转座子和非LTR-逆转座子在转座的具体步骤上有很大的差别，其中LTR-逆转座子的转座机制类似于逆转录病毒，下面简介非LTR-逆转座子的转座过程（以LINE-1为例）：1）L1-DNA在RNA pol Ⅱ的催化下转录为L1-RNA；2）L1-RNA进入细胞质，被翻译成RT和内切酶；3）L1-RNA与翻译产物一起返回到细胞核；4）内切酶在靶位点上切开DNA的一条链，产生3’-OH 和5’-P；5）RT在靶位点的3’-OH上，以L1-RNA为模板，起动逆转录，开始合成cDNA的第一条链；6）靶位点上的第二条链被内切酶或宿主细胞内的核酸酶切开，而产生3’-OH和5’-P；7）新合成的cDNA的第一条链与靶位点上的另一条链通过微同源性而配对，使得靶位点上第二切点上的3’-OH能够作为引物，以起动cDNA第二条链的合成；8）靶位点上的缺口被宿主DNA聚合酶填补。有时，逆转录酶可能切换模板，以靶位点上的另一条链为模板，继续cDNA第一条链的合成，然后再由逆转录酶或宿主细胞内的DNA聚合酶合成cDNA的第二条链，并填补缺口。

第十五章染色质结构的控制（Controlling Chromation structure 课件上第16章）

1、简介：真核生物转录的特点：细胞基因组以核小体的形式组织在一起，这其中，组蛋白在抑制以及转录的过程中发挥功能。基因的激活需要染色质状态的改变。局部的染色质的结构作为控制基因表达的一部分而存在。有些在基因转录阶段发挥作用的激活子（activator）直接修饰组蛋白，特别是，组蛋白的乙酰化与基因激活直接相关。相反，有些阻遏蛋白（repressor）通过去乙酰化组蛋白来阻止基因转录。

2、染色质有着可变的状态（Alternative States）：染色质结构是稳定的，并且不能改变转录因子以及组蛋白之间的平衡。例如，如果promoter序列缠绕在核小体上，那么转录因子（以及RNA聚合酶）均不能与其结合。

3、染色质重塑是一个激活过程：染色质重塑为能量依赖型的核小体置换或者重组，这样会使基因激活转录。许多protein-protein以及protein-DNA接触可以参与到染色质中组蛋白的打散以及释放过程。染色质的重塑包括序列移位、核小体之间产生空隙、核小体替换（displaced）。这需要重塑复合体的帮助。例如：SW1/SNF复合体。

4、promoter附近的核小体组织可能会发生变化：重塑复合体究竟如何与染色质上的靶序列结合？重塑复合体通过与位点特异性的激活子（activator）结合被招募到启动子附近。一旦与重塑复合体结合，那么激活子就被释放。之后重塑复合体置换（displace）组蛋白复合体，释放DNA。例子：激素受体以及NF1不能与同时与MMTV线性的启动子结合，但是可以与同时与核小体状态启动子结合。（线性状态下只有激素受体能与DNA结合）。

5、组蛋白修饰是一个重要的过程：组蛋白可以被甲基化、乙酰化以及磷酸化。这些反应主要发生在组蛋白H3以及H4的N-端尾部。通常情况下，组蛋白的甲基化对应于基因的失活，而乙酰化则对应基因激活。

6、乙酰化与激活子相关而去乙酰化则与阻遏蛋白相关：组蛋白乙酰转移酶（HAT）修饰组蛋白的乙酰化，有些转录辅助因子（coactivators）也有HAT活性。第一个被阐述具有HAT活性的general activator为p300/CBP。去乙酰化酶（HDAC）一个典型的阻遏蛋白复合体包括三个组分：一个DNA结合亚基、一个核心阻遏蛋白（corepressor）以及一个组蛋白去乙酰酶。By the way，在DNA复制的过程中组蛋白也会被暂时的乙酰化。

7、启动子的激活涉及一系列的过程：重塑复合体被招募到乙酰复合体附近，4中已经阐述此过程，在替换了核小体之后，重塑复合体让出promoter区域，之后氨酰酶复合体就会与promoter区域结合将其乙酰化。

8、X染色体经历（undergo）球状改变：剂量效应表明细胞中育两个X染色体以及一个染色体之间的性别差异。剂量效应通过X染色体的随机失活来避免，在X-失活状态的染色体附近涉及Xist RNA的稳定存在，其编码产物包裹失活的染色体。

9、染色体的压缩需要condensins：染色体结构保持（SMC）表明有一系列蛋白（cohesins），他们可以把姐妹染色单体聚集（cohesin）并且压缩（condensin）。

第十六章蛋白质相互作用研究方法

蛋白质相互作用常用的研究方法：

1、酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid，Y2H）：很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具

有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有