基因工程复习资料

基因工程复习资料

生物技术在制药行业的应用：基因工程制药、细胞工程制药、酶工程制药、发酵工程制药。

基因工程：基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。（又称遗传工程）

基因工程流程：分、切、接、转、筛、表。

基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。

基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

连接酶：T4连接酶(辅助因子为ATP，高等生物，实验采用)和大肠杆菌连接酶(辅助因子为NAD+，低等生物)。

基因工程诞生的理论基础：证明生物的遗传物质是DNA（20世纪40年代）、明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制（20世纪50年代）、明确了遗传信息的传递方式（20世纪60年代）。

基因工程诞生的技术突破：工具酶(限制性内切酶和DNA连接酶)的发现与应用（基因操作的剪刀，针线）、载体的发现（发现了运载工具）、逆转录酶的发现（便于真核生物基因的获取，因其常有内含子，不便于操作）。

基因工程诞生的元年：1973年的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。

基因工程制药：利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物，以及生物制品的一门技术。

工具酶：工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类。

核酸酶：核酸酶是指对核酸片段可以进行操作（核酸的扩增、核酸的切割、核酸的连接）的一类酶。

工具酶：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。

胰蛋白酶：动物细胞消散需要胰蛋白酶。

限制性核酸内切酶的限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制；这是维护宿主遗传稳定的保护机制。

限制性核酸内切酶的修饰作用：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏；这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用

机制。

主要运用限制性核酸内切酶Ⅱ类：识别位点特定序列（回文对称序列）、切割位点位于识别位点上。

限制性核酸内切酶的命名：Haemophilus influenzae d流感嗜血杆菌d株、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ。

①限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体)代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体)代表宿主菌种名(species)前两个字母。

②第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体)或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。

③若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体)。限制性核酸内切酶的特征：可识别特异性的序列；切割方式①在识别序列的对称轴的5’端切割，产生5’黏性末端，②在识别序列的对称轴的3’端切割，则产生3’黏性末端，③在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端

回文结构大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。

同裂酶：同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的II限制性核酸内切酶。

同尾酶：同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的II限制性核酸内切酶。

影响限制性核酸内切酶活性与酶切效果的因素：

1).酶的纯度：要求不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染。

2).DNA样品的纯度：DNA样品中的蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高NaCl等，都能抑制酶活性。样品中DNase会降解DNA，影响酶切。

3).酶切反应的温度、时间：多数II型限制酶最适反应温度是37℃，但Sma I为25℃或30℃，Sfi I为50℃，Taq I为65℃。反应温度过高或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。

4).DNA的甲基化程度：限制性核酸内切酶不能切割甲基化的核苷酸序列。大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I 等，但Bam HI、Bgl II、Sau3A I不受影响。

5).DNA分子的构型：限制性内切酶对不同构型DNA分子的酶切效果是不同的，例如超螺旋DNA酶解所需要的酶量，比线性DNA酶解所需要的酶量高许多，甚至可高达20倍。

6).反应缓冲液：主要成分：p H (Tris-HCl)、离子强度(Na Cl)、Mg2+；辅助成分：β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)防止酶氧化；牛血清蛋白(BSA)组分V对于某些酶是必需的，可防止酶在低浓度蛋白质溶液中变性。

7).星号活性：是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。例如Eco RI在高pH(＞8)、低盐(50mmol/L)和高浓度甘油(＞5％)存在的情况下，其识别序列由GAATTC 改变为NAATTN。以Eco RI表示其星号活性。常发生星活性的内切酶有：Eco RI、HindⅢ、Kpn I、Pst I、Sal I、Hinf I等。

DNA连接酶：DNA连接酶是指能催化双链DNA分子内或分子间的5’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键而使DNA链连接的一类酶。

DNA连接酶平末端DNA片段的连接：a).直接用T4 DNA连接酶连接：效率不高，较少采用。b).同聚物加尾连接平末端DNA片段：先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴后再用DNA连接酶进行连接。c).用衔接物连接平末端DNA分子：目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点，经酶切后产生特异的粘性末端，从而与具有互补末端的DNA连接。

衔接物：指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。

影响DNA连接酶在连接反应的因素：

1).DNA的浓度：连接产物的分子构型(线形或环状)与DNA浓度及DNA分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子DNA片段进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的DNA分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段=2:1。

2).反应温度：连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15℃以下，然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是37℃。但在该温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷，所以连接反应一般采用16℃过夜。

（4-16℃）

3).ATP浓度：ATP最适的终浓度为0.5mmol/L，浓度过高会抑制连接。

基因克隆：成功导入受体细胞；具备独立的复制能力。

载体：载体在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的“运载工具”，其本质是DNA复制子。载体必备的条件：①能在宿主细胞内进行独立和稳定的自主复制；②具有合适的限制性内切酶位点（多克隆位点）；③具有合适的选择标记基因。

基因工程对载体的要求：1).在宿主细胞内能独立复制，ori。2).有选择性标记Amp r、Tet r、Kan r等。3).多克隆位点：外源基因插入的单一限制酶位点。4).分子量小，可容纳较大的外源基因片段。5).拷贝数多，方便外源基因在细胞内大量扩增。6).具有对受体细胞的可转移性。7).具有较好的安全性，不能任意转移。

载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。

载体的分类：

根据来源和性质不同载体可分为质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、病毒载体、人工染色体等。

根据功能和用途不同载体可分为克隆载体、表达载体(标签载体、分泌载体)、测序载体、转化载体、多功能载体等。

根据受体细胞不同载体分为原核生物载体(大肠杆菌载体)、真核生物载体(酵母载体、植物载体、动物载体)。质粒的一般生物学特性：1).质粒的分子特性；2).质粒的自主复制性；3).可转移性；4).质粒的不相容性（又称不亲和性）；5).携带特殊的遗传标记。

理想质粒载体必须具备的条件：

1).天然质粒用作载体的局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适。

2).理想质粒载体的必备条件：①具有较小的分子量和较高的拷贝数；②具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点)；③具有两种以上的选择标记基因；④缺失mob基因或nic位点；⑤插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。

多克隆位点(多接头，或限制性酶切位点库）：多克隆位点是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。

插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。

替换型载体可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。

蓝白斑筛选：lac Z基因编码β-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lac Z基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑。

其它载体：人工染色体、植物基因工程载体、动物基因工程载体。

目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。

★目的基因的制备：

1).物理分离法：直接用酶切割、或者机械破碎分离法。物理学密度梯度离心法。

2).化学合成法：a.全片段酶促连接法：将人工合成的全部寡核苷酸片段放在适宜的条件下进行复性，得到带有黏性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将其连接成完整的基因片段。b.酶促填充法：合成部分寡核苷酸链片段，在适当的条件下进行复性得到模板——引物复合体，然后在大肠杆菌DNA聚合酶I大片段作用下以四种核苷酸为原料去填充片段间的单链区域，于是就形成了我们要的基因。

3).逆转录法：cDNA第二链的合成。

4).RT-PCR技术法

5).筛选新基因的其它方法：鸟枪法、功能克隆法、差异显示技术。

聚合酶链反应（PCR）：是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或c DNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。

PCR的基本反应步骤及原理：1).变性，加热至95 ℃，使模板DNA解开成单链；2).退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；3).延伸，温度升至72 ℃，DNA聚合酶以4种d NTP为底物，在引物的3’-OH

上，合成与模板互补的DNA新链。

DNA连接：DNA连接目的基因DNA片段与载体DNA，在DNA连接酶作用下，通过形成磷酸二酯键，最终构成重组DNA分子的过程，称为DNA的连接。

平接法：具有3-羟基、和5-磷酰基的平齐末端的DNA之间，在T4-DNA连接酶的作用下，通过形成共价键结合，称为平结法。适用于：限制性内切酶切割产生的平端；粘端补齐或切平形成的平端。

转化：转化是指将质粒载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。

转染：转染是指将噬菌体载体或病毒载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。

重组DNA向细菌细胞转入：感受态细胞热激转化法(42℃热激45-90s)；电击转化法；载体介导外源DNA 转移(载体介导基因转移：病毒载体、质粒载体)；外源DNA直接转移(基因直接转移：磷酸钙沉淀法、脂质体介导法、DEAE-葡聚糖法、血影细胞介导法)；电击法；基因枪法；PEG法；精子介导法；花粉管通道法；微注射法。

重组子(转化子或克隆)的筛选：1).遗传学筛选法：a.根据载体表型特征的筛选(选择标记)-①抗药性标记插入失活筛选法；②β-半乳糖苷酶显色反应筛选法(α-筛选或蓝白斑筛选)。b.根据插入基因遗传性状的筛选-

①抗性基因；②功能互补筛选法。

2).依据核酸分子的筛选-检测法：菌落/噬菌斑印迹杂交；斑点印迹杂交；Southern印迹杂交；Northern 印迹杂交；PCR筛选-检测法(菌落/噬菌斑PCR法)；测序检测法。

3).物理检测法：直接凝胶电泳检测法、限制酶酶切片段分析检测法。

4).免疫化学筛选-检测法：免疫吸附筛选-检测法、免疫沉淀筛选-检测法、Western印迹筛选-检测法。

Western blotting：蛋白质。Northern blotting：DNA。

基因工程流程：1).分：分离目的基因；2).切：对目的基因和载体适当切割；3).接：目的基因与载体连接4).转：重组DNA转入受体细胞；5).筛：筛选出含有重组体的受体细胞；6).表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物。

表达系统是由宿主细胞、表达载体、外源基因共同组成。可分为原核表达系统和真核表达系统。

外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：1).转录：启动子、终止子；2).翻译：核糖体结合位点、密码子、质粒拷贝数。

核糖体结合位点（RBS）：在E.coli 的高效翻译中的重要因素就是原核的核糖体结合位点的存在。

选择标记常用抗生素抗性标记（如氨苄亲霉素、四环素、链霉素等）。

转录终止子：采用强启动子易发生转录过头现象，影响mRNA翻译效率；需要在真核基因下游加入强终止子序列，距离越近，表达水平越高。

包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶蛋白聚集折叠而形成的晶体结构物，称为包涵体。

包涵体表达：易于分离纯化、可保护外源蛋白不受蛋白酶降解、宿主免受有毒蛋白的伤害、氨基酸序列正确、空间构象错误（需要复性）、可与分子伴侣共表达。

常用的大肠杆菌信号肽：碱性磷酸酶信号肽（pho A）、膜外周质蛋白质信号肽（Omp A）、霍乱弧菌毒素B 亚单位（CTXB）。

影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：1).外源基因的拷贝数：与载体在宿主中的拷贝数直接相关。2).外源基因的表达效率影响因素：真核基因应该不含有内含子；启动子的强度；核糖体结合位点的有效性；SD序列和起始密码ATG的间距；密码子的组成；表达产物稳定；优化工程菌的培养条件等。

抗体工程：抗体工程就是指利用分子生物学、基因工程等手段对抗体进行各种不同的改造并在原核、真核细胞中表达制备的工程技术。

可变区：互补决定区（CDR）

基因工程抗体：基因工程抗体指用基因工程方法，对抗体的基因进行重组、缺失、修饰改型等，构建载体，在受体细胞中表达，获得抗体。

基因工程抗体的特(与单克隆抗体比较点)：1).通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。2).基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位。3).根据治疗的需要，制备新型抗体；4).可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子，大大降低生产成本。

基因工程抗体的应用：在肿瘤治疗方面；在治疗病毒病方面；在治疗自身免疫病方面的应用；在哮喘、移植排斥、血管疾病等方面。此外，在疾病诊断方面。

抗体基因克隆中的重要技术环节：1).保持抗体分子的可溶性；2).设计理想的Linker序列；3).正确PCR引物设计。

保持抗体分子的可溶性：影响抗体基因可溶性的因素；表达载体；可溶性表达途径。

抗体分子的克隆：嵌合抗体；改形抗体；双特异性及多特异性抗体；小分子抗体。

复制非专利生物药品的困难：蛋白质的高级结构难以复制；药效和安全性难以与原药品一致；开发周期较长，注册仍需要临床试验。

复制蛋白药物的主要问题－－免疫原性。

预测蛋白药物的免疫原性的方法：现有的抗原决定簇公式难以预测免疫原性；抗血清筛选不能完全说明该抗体就是由药物蛋白激发；同一种蛋白的转基因小鼠可以较好预测药物蛋白的免疫原性。

通过对现有药物的优化和改造研发新药：定向突变；定点突变。

创新药物设计：1).通过筛选同源基因的方法。2).通过RNA的表达谱：检测患者的特异性基因表达。3).蛋白质组学。4).使用寡核苷酸技术（干扰RNA）。5).基因功能系统分析（建立不同表型细胞模型，预测新基因功能。）。6).使用生物模型。