小鼠真皮成纤维细胞使用说明
小鼠真皮成纤维细胞
小鼠真皮成纤维细胞产品说明：
为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠真皮成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠真皮成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：
1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠真皮成纤维细胞产品简介：
1、产品名称：小鼠真皮成纤维细胞（Mouse dermal fibroblast cells）
2、组织来源：小鼠乳鼠背部皮肤组织
3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶
小鼠真皮成纤维细胞简介：
真皮成纤维样细胞是真皮组织的源细胞，是创面愈合的主要修复细胞。该细胞的体外分离、培养、诱导、分化，是创面修复的相关研究的关键之处。
本公司生产的小鼠真皮成纤维样细胞采用混合酶消化制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
小鼠真皮成纤维细胞培养基信息：
1）培养基类型：成纤维样细胞专用培养基
2）添加因子：FBS、Penicillin、Streptomycin 等
小鼠真皮成纤维细胞使用方法：
细胞培1. 取出25cm2 培养瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO
2
养箱中静置6-8小时或者过夜，以稳定细胞状态。
2. 将瓶内培养基大部分转移至无菌试剂瓶中待用，每瓶细胞仅留6~8mL培养基继续培养，然后根据实验目的进行后续实验。
3. 细胞传代
1) 吸出25cm2培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
2) 添加0.125%胰蛋白酶消化液约1mL至培养瓶中，37℃温浴1~2min左右；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，再加入完全培养液终止消化；
3) 用吸管轻轻吹打混匀，按1:2或1:3等适当的比例进行接种传代，然后补充
细胞培养箱中培养；
新鲜的完全培养基至5mL，放入37℃，5% CO
2
4) 待细胞完全贴壁后，培养观察。之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
小鼠真皮成纤维细胞注意事项：
1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。
3. 原代培养的细胞，不建议多次传代后进行实验。
4. 传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。
5. 该细胞只可用于科研。
小鼠真皮成纤维细胞其他相关小鼠原代细胞：
小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞
小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞
小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞
小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞
小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞
小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞
小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞
小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞
小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞
小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞
小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
小鼠肺大动脉内皮细胞小鼠前脂肪细胞
小鼠肺动脉成纤维细胞小鼠成骨细胞
小鼠肺大静脉内皮细胞小鼠关节软骨细胞
小鼠气管和支气管上皮细胞小鼠胎儿表皮角质形成层细胞
小鼠胰岛细胞小鼠成年表皮角质形成层细胞
小鼠胰腺星状细胞小鼠皮下脂肪细胞
小鼠胰腺导管上皮细胞小鼠内脏脂肪细胞
小鼠颌下腺上皮细胞小鼠脑动脉血管内皮细胞
小鼠腮腺细胞小鼠脑动脉血管平滑肌细胞
小鼠乳腺上皮细胞小鼠脑静脉血管内皮细胞小鼠胰腺上皮细胞小鼠脑静脉血管平滑肌细胞小鼠甲状腺上皮细胞小鼠脑膜细胞
小鼠淋巴管内皮细胞小鼠神经胶质细胞
小鼠淋巴成纤维细胞小鼠海马神经元细胞
小鼠外周血白细胞小鼠脑微血管内皮细胞
小鼠骨髓基质细胞小鼠脑成纤维细胞
小鼠食管上皮细胞小鼠神经小胶质细胞
小鼠食管平滑肌细胞小鼠雪旺氏细胞
小鼠肠动脉内皮细胞小鼠小脑颗粒细胞
小鼠肠静脉内皮细胞小鼠嗅鞘细胞
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小鼠小肠隐窝上皮细胞小鼠虹膜色素上皮细胞
小鼠肝内胆管上皮细胞小鼠晶状体上皮细胞
小鼠胃粘膜上皮细胞小鼠角膜上皮细胞
小鼠肝窦内皮细胞小鼠视网膜神经节细胞
小鼠肝星形细胞小鼠角膜成纤维细胞
小鼠直肠平滑肌细胞小鼠脉络膜血管细胞
小鼠小肠平滑肌细胞小鼠牙乳头细胞
小鼠结肠平滑肌细胞小鼠肝外胆管上皮细胞
小鼠肠上皮细胞小鼠肝Kupffer细胞
小鼠肠微血管细胞小鼠骨髓间充质干细胞
小鼠肠巨噬细胞小鼠下丘脑神经元细胞
小鼠子宫内膜上皮细胞小鼠睾丸支持细胞
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小鼠卵巢上皮细胞小鼠心脏干细胞
小鼠子宫成纤维细胞小鼠神经干细胞
小鼠卵巢成纤维细胞小鼠骨髓来源内皮祖细胞小鼠肾实质细胞小鼠椎间盘髓核细胞
小鼠肾系膜细胞小鼠肾足突细胞
小鼠膀胱上皮细胞小鼠肾小管平滑肌细胞
小鼠膀胱平滑肌细胞小鼠肾成纤维细胞
小鼠肾动脉内皮细胞小鼠尿道上皮细胞
小鼠肾动脉平滑肌细胞小鼠输尿管上皮细胞
小鼠肾小管上皮细胞小鼠肾管状上皮细胞
小鼠肾小球内皮细胞小鼠心肌细胞
小鼠前列腺上皮细胞小鼠心肌成纤维细胞
小鼠肾上皮细胞小鼠主动脉内皮细胞
小鼠膀胱成纤维细胞小鼠主动脉平滑肌细胞
小鼠血管外膜成纤维细胞
小鼠皮下脂肪细胞使用说明
小鼠皮下脂肪细胞 小鼠皮下脂肪细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠皮下脂肪细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠皮下脂肪细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠皮下脂肪细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠皮下脂肪细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠皮下脂肪细胞 2、组织来源：小鼠脂肪组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠皮下脂肪细胞简介： 小鼠皮下脂肪细胞来源于小鼠脂肪组织，皮下脂肪细胞主要功能： （1）脂肪细胞能储存能量并参与身体代谢。 （2）脂肪细胞分化是一个发展的过程，它对代谢稳态和营养信号很重要。（3）前脂肪细胞存在于小鼠脂肪组织中，能根据能量的平衡增殖和分化成熟的脂肪细胞。前体细胞的增殖和分化能够增加脂肪组织的体积。 （4）前脂肪细胞与脂肪分化以及许多生理病理过程密切相关，如脂肪代谢、能量平衡、肥胖、糖尿病、高血脂和乳癌，所以小鼠皮下脂肪细胞对这些疾病的研究提供素材。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
小鼠肾成纤维细胞使用说明
小鼠肾成纤维细胞 小鼠肾成纤维细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠肾成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠肾成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠肾成纤维细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠肾成纤维细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结 2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条 摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。 5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。 6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。 7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。 8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。 注释： MEF培养基成分：
原代小鼠心肌成纤维细胞提取
原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法 1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL（均用DMEM配置），放入37℃水浴锅中预热15min；准备1个50mL的离心管，提前加入10mL含10%FBS的完全培养基，冰浴备用； 2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠，用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔，迅速取出心脏，置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中； 3.将心脏组织转移至超净台，用DMEM反复清洗，取出血液、大血管组织，将组织放入1个1.5mL的EP管中，充分剪碎（小于1mm3）; 4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶，反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中，37℃水浴加热 3min，适当振荡；[循环1] 5.吸取上清液丢弃，余下的组织块中加入2mL胶原酶，37℃水浴加热5min，期间每分钟振荡1次，吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环2] 6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次）后水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环3] 7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后（约30次），此时肉眼可见组织块逐渐变小，呈透明粘液状，随后再次水浴消化4min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环4、5] 8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后（约20次），此时肉眼可见组织块逐渐消失，消化液变得浑浊，再次水浴消化3min，随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中；[循环6、7]； 9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中，1000rpm离心6min，小心吸去上清液，组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中，加3mL完全培养基（含4%双抗），2h后可见细胞贴壁，12h内换液；2-3d后常规传代（1:2），P1-2用于实验。
小鼠胚胎干细胞的培养
小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养 一、实验材料 1．主要仪器设备 倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊） 2．试剂 RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶 3．实验动物 孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。 二、实验步骤 1. 获取小鼠胚胎 (1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上 (2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的 皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。 (3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整 个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸 上去除血迹。 (4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。 (5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带 有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。 (6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和 内脏，得鼠胚躯干。 (7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血 色。 2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法） (1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成 约1 mm3以下的碎块。 (2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底 离心管中。 (3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。 (4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可 见组织块变得较为粘稠）。 (5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织 碎块沉淀。 (6) 每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培 养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。 (7) 做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃， 5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。 (8) 培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底， 周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有 的是呈圆形的上皮细胞。
老化皮肤成纤维细胞的分析研究进展
老化皮肤成纤维细胞的研究进展 丛敬1，2，指导：吴景东1 <1 辽宁中医药大学，沈阳110032；2 沈阳医学院，沈阳110034 ） 【摘要】延缓皮肤老化，永葆青春是人类从未放弃的梦想。成纤维细胞作为真皮中主要细胞成分，已广泛应用于皮肤老化模型的建立和研究中。较系统的介绍了成纤维细胞的组织学结构与功能，其在细胞和分子水平影响皮肤老化的机制，对深入研究皮肤老化的机制、预防和治疗具有重要意义。 【关键词】成纤维细胞；皮肤老化；机制；中药研究 成纤维细胞是皮肤真皮中最主要的细胞成分，在合成分泌纤维和细胞外基质中扮演着重要的角色，在组织创伤修复中发挥着重要的作用。随着年龄的增长，皮肤老化突显，可以表现为皮肤干燥粗糙，皱纹增多、加深，皮肤松弛，弹性下降等。这些临床表现都与成纤维细胞数量减少，合成功能下降或异常有关。因此，在皮肤老化的研究中，人们越来越关注成纤维细胞的结构和功能的改变及其对皮肤老化产生的影响。 1 成纤维细胞的组织学结构与功能 光镜下观察[1]，成纤维细胞胞体较大，常呈多突起的扁平星状。细胞核较大，扁卵圆形，着色浅，核仁明显。细胞质较丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞质内富于粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋白等基质成分[1]。在婴儿和青年人皮肤中，Ⅰ型胶原蛋白的含量约占70％，Ⅲ型胶原蛋白占30％。在衰老过程中，成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增加，Ⅰ型胶原蛋白减少。成纤维细胞受损，还可以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降，皱纹增多，且难以平复。 2 成纤维细胞致皮肤老化的作用机理 皮肤老化包括自然老化和外源性老化两种形式，其发生、发展的机制十分复杂。成纤维细胞在致皮肤老化的过程中发挥着十分重要的作用。 2.1基因调控异常 紫外线照射可导致成纤维细胞急性DNA 光损伤和突变，形成环丁烷嘧啶二聚体和6- 4 嘧啶- 嘧啶酮光产物，光老化的成纤维细胞对其修复能力下降，表达参与细胞核外切修复的蛋白及其mRNA水平亦下降[2-3]。而光老化成纤维细胞DNA修复能力的下降是由于修复合成相关因子表达下降导致核苷酸切除修复后期功能障碍造成的[4]。 人类线粒体DNA 第19卷第2期 江西农业大学学报 V o l.19,N o.2 1997年6月 A cta A gricu ltu rae U n iversitatis J iangx ien sis June,1997 α 小鼠胚胎干细胞培养体系的建立 汪河海1 刘红林2 范必勤1 钟 卉3 丁家桐4 (1 江苏农科院牧医所,南京 210014;2 南京农业大学动物科技学院,南京 210059;3 南京铁道医学院,南京 210009;4 扬州大学农学院动物科学系 225009) 摘 要 通过探讨影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素,建立了小鼠胚胎干细胞体外培养体系,并建成小鼠ES细胞系。 关键词:小鼠;胚胎干细胞;培养体系;ES细胞系 中图分类号:S865.1 胚胎干细胞又称ES细胞(Em b ryon ic Stem Cells)。其特点是在体外特定的培养条件下能保持其只生长、不分化的增殖状态,并具早期胚胎细胞发育的全能性。哺乳动物的ES细胞系自Evan s和Kaufm an(1981)首次建立以来[1],引起人们高度的重视,并被广泛地用于动物发育遗传学的基础理论研究和转基因动物的生产实践。但ES细胞系要在体外克隆成功,必须有成纤维细胞或STO细胞饲养层的支持[2],为建立有效的哺乳动物ES细胞体外培养体系,本文就影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备及胚胎干细胞体外培养的若干因素做初步探讨,为今后进一步开展研究奠定基础。 1 材料和方法 111 动物准备 选3～4月龄的性成熟的昆明鼠,母鼠自然发情或超排后与公鼠交配,第2天早晨检查阴道栓,见栓查为发情受精。妊娠至一定日龄后取其胚胎或胎儿用于分离囊胚内细胞团细胞或制备胎儿成纤维细胞饲养层。 112 溶液的配制 按日本学者管原七郎的配方配制D PB S液,胰蛋白酶溶液、DM E M液及ES细胞培养液(配方略)。 113 胎儿成纤维细胞饲养层的制备 α 实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶 细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。 b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞 知识总结 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。 13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 小鼠真皮成纤维细胞 小鼠真皮成纤维细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠真皮成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠真皮成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠真皮成纤维细胞产品简介： 1、产品名称：小鼠真皮成纤维细胞（Mouse dermal fibroblast cells） 2、组织来源：小鼠乳鼠背部皮肤组织 3、产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠真皮成纤维细胞简介： 真皮成纤维样细胞是真皮组织的源细胞，是创面愈合的主要修复细胞。该细胞的体外分离、培养、诱导、分化，是创面修复的相关研究的关键之处。 本公司生产的小鼠真皮成纤维样细胞采用混合酶消化制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 小鼠真皮成纤维细胞培养基信息： 1）培养基类型：成纤维样细胞专用培养基 小鼠淋巴成纤维细胞 小鼠淋巴成纤维细胞产品说明： 为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠淋巴成纤维细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠淋巴成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠淋巴成纤维细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠淋巴成纤维细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞 Primary human/mouse lung fibroblast isolation 人类/小鼠原代肺成纤维细胞分离方法 参考文献(H: 1.Katharina Heinzelmann et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2018; 2. Claudia A Staab-Weijnitz et al. Am J Respir Crit Care Med. 2015. FK506-Binding Protein 10, a Potential Novel Drug Target for Idiopathic Pulmonary Fibrosis; M: Isolation and characterization of mouse fibroblasts, Benjamin L. Edelman and Elizabeth F. Redente) Materials: 材料： 1. Digestion solution: a).Liberase TM (5401119001, Merck) solution, 2.5mg/ml (HBSS); b).DNAse (D4263-5VL, Sigma), 2000U/ml(PBS) 消化液：a) Liberase TM 溶液（5401119001, Merck）：溶于HBSS（终浓度2.5mg/ml） b) DNAse溶液（D4263-5VL, Sigma）：溶于PBS（终浓度2000U/ml） 2. Nylon filters 40/70 μm 3. Complete medium (Mouse: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B + 1% Glu; Human: DMEM/F12 + 20% FBS + 1% Penicillin/Streptomycin + 0.1% Amphotericin B) 4. Knife (disposable) 5. Syringe 6. PBS Digestion solution: Steps: (Mouse from 1-13, Human from 7-13) 步骤： 1. Weight the mouse, calculate the amount of anesthesia, Xylazin : Kelamin : NaCl = 1:4:5, 100ul/10g weight; 称重小鼠后麻醉 2. Inject and wait 10min till the mouse sleep 腹腔注射后等待10分钟 临床医学小鼠胚胎干细胞培养体系的建立
小鼠成纤维细胞原代培养.docx
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结
小鼠真皮成纤维细胞使用说明
小鼠淋巴成纤维细胞使用说明
人类小鼠原代肺成纤维细胞分离方法
小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞生长状态
中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷 第 3 期 2008–01–15 出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 15, 2008 Vol.12, No.3
小鼠胚胎及人包皮成纤维细胞按比例制成混合饲养层上的人胚胎干细胞 生长状态★
李 斌1,2，彭秋平2，卢伟英1,2，徐 雯1,2，金应霞2，黄元华1,2
Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios
Li Bin1,2, Peng Qiu-ping2, Lu Wei-ying1,2, Xu Wen1,2, Jin Ying-xia1, Huang Yuan-hua1,2
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Abstract
AIM: The key of the human embryonic stem cell culture is to guarantee the totipotency and inhibit spontaneous differentiation. There are the problems in the traditional methods that human embryonic stem cells were cultured on the mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts as feeder layer. We aimed to solve the problems, observe growth state of human embryonic stem cells when it was cultured on the mixed feeder layers of different proportion. METHODS：Experiments were completed in Reproductive Medical Center of Hainan Medical College from April 2006 to July 2007. ①The foreskin was from the boy who was circumcised, provided by Department of Urinary Surgery of Hospital Affiliated to Hainan Medical College. Child guardian signed an informed consent of the treatment and experiment and the experiment was approved by the hospital medical ethics committee. Human embryonic stem cell line (HN-1) was isolated from human blastocysts and identified. Eleven clean fetal mice of 12.5-14.5 d were collected and the disposal of animal conformed to the animal ethics standards during the experiments. ②The fetal mice whose heads, limbs and internal organs were removed were repeatedly digested by the trypsin to obtain cells, then cells were cultured. Parts of the original cells were cryopreserved after confluence. It was the mouse embryonic fibroblast feeder layer that cells which were treated for 2.0-3.0 h with mitomycin C were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. Isolation, culture and preparation of feeder layer of human foreskin fibroblast were the same as above. Mixed feeder layer was that cells which were mixed according to 1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1 were cultured in the center plate coated by gelatin at 1×108 L-1. ③Growth states of human embryonic stem cells were observed in three different feeder layers and undifferentiated phenotypes were detected, including expression of alkaline phosphatase, and presence of OCT-4, Tert and cell marker (OCT-4). Without feeder layer, human embryonic stem cell differentiation was observed in vitro. RESULTS：①Comparison of human embryonic stem cell growth state on different feeder layers: Colonies of human embryonic stem cells on the mouse embryonic fibroblast feeder layer and human foreskin fibroblast feeder layer was both flat and thin, but those on the mixed cells feeder layer were full and thick. The clonal morphology of the mixed feeder layer, overall, was significantly better than others. ②Comparison of human embryonic stem cell growth state on the mixed feeder layers prepared by different ratios: When mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts were mixed at a ratio of 1∶1 human embryonic stem cells accumulated significantly and cloning edge was clear, obvious and full. No significant changes were found at 1∶3. It was significantly better than others. ③Detection of human embryonic stem cell undifferented phenotypes on mixed feeder layer: Expression of alkaline phosphatase and OCT-4 antigen were strongly positive. Specific bands of OCT-4 and telomerase mRNA appeared respectively on 200-300 bp and 300-400 bp. ④Differentiation experiment in vitro: Human embryonic stem cells on mixed feeder layer was able to form embryoid bodies and differentiate into a variety of cells. CONCLUSION： ①Comparison with conventional feeder layers prepared by mouse embryonic fibroblasts or human foreskin fibroblasts, the mixed cells feeder layer may be better suitable for human embryonic stem cell culture in vitro and obtain better human embryonic stem cell clonal morphology. ②The feeder layer mixed at a ratio of 1∶1 can get better effect. Li B, Peng QP, Lu WY, Xu W, Jin YX, Huang YH.Growth state of human embryonic stem cells on mixed feeder layers with mouse embryonic fibroblasts and human foreskin fibroblasts at different ratios.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12 (3):424-428(China) [https://www.360docs.net/doc/309218154.html,/zglckf/ejournal/upfiles/08-3/3k-424(ps).pdf] 摘要
目的：人胚胎干细胞传代培养的关键是抑制其自发分化、保证细胞的全能性。欲解决以小鼠胚胎成纤维细胞或人包皮成纤维 细胞为常规饲养层培养人胚胎干细胞时存在的问题，观察两者按一定比例制成的混合饲养层上人胚胎干细胞的生长状态。 方法：实验于 2006-04/2007-07 在海南医学院附属医院生殖医学中心完成。①对象：包皮来自于行包皮环切的儿童，由海南 医学院附属医院泌尿外科提供，儿童家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。人胚胎干细胞 系 HN-1 由本实验室从人类囊胚中分离培养并鉴定。清洁级孕 12.5~14.5 d 的胎鼠 11 只，实验过程中对动物的处置符合动物 伦理学标准。②实验方法：将去除头、四肢和内脏的胎鼠按常规胰蛋白酶反复消化法获得细胞悬液进行接种培养，待生长汇 合后冻存部分原代细胞，用丝裂霉素 C 处理 2.0~3.0 h 后，按 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内，即小鼠胚胎成纤维 细胞饲养层。人包皮成纤维细胞的分离培养与饲养层制备同上。上述两种成纤维细胞分别计数后，按 1∶0，3∶1，1∶1， 1∶3，0∶1 比例混合，然后以 1×108 L-1 密度接种于明胶包被的中心皿内，即混合饲养层。③实验评估：观察体外传代培养 的人胚胎干细胞在 3 种不同饲养层上的生长状态。并对生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞进行碱性磷酸酶检测、OCT-4 表 达免疫组化检测、OCT-4 及端粒酶 mRNA 表达 RT-PCR 检测。撤除饲养层，观察人胚胎干细胞体外分化情况。 结果：①不同饲养层上人胚胎干细胞的生长状态比较：生长在小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞上的人胚胎干细胞克隆 扁平、不饱满，而生长在混合饲养层上的人胚胎干细胞克隆饱满、厚实，其克隆形态显著好于其他两种饲养层。②人胚胎干细 胞在不同比例混合饲养层上的生长状态比较：小鼠胚胎成纤维细胞：人包皮成纤维细胞按 1∶1 混合时，人胚胎干细胞显著堆积 生长，克隆边缘清晰、隆起明显且饱满，按 1∶3 混合时无明显变化，优于其余 3 种混合比例。③混合饲养层上人胚胎干细胞未 分化状态的检测：碱性磷酸酶染色及 OCT-4 抗原表达均呈强阳性，分别在 200~300 bp 和 300~400 bp 处可见 OCT-4 和端粒酶
Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China; 2 Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China Li Bin ★ , Master, Assistant, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China；Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China libinliccc@https://www.360docs.net/doc/309218154.html, Correspondence to: Huang Yuan-hua, Master, Professor, Hainan Medical College, Haikou 571101, Hainan Province, China; Reproductive Medical Center, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, Hainan Province, China huang_yuanhua@ https://www.360docs.net/doc/309218154.html, Received:2007-08-22 Accepted:2007-11-22
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kf23385083@https://www.360docs.net/doc/309218154.html,