昆虫基因组DNA的提取(CTAB法)

昆虫基因组DNA提取方法—CTAB法

1. 将95% 酒精浸泡过的标本取出，用吸水纸吸去标本表面的乙醇，用1×TE Buffer浸泡两次，每次20min；

2. 解剖取个体胸部肌肉组织约0.02g，将组织转入1.5mL离心管加入1mL 液氮使其迅速冻结, 用玻璃棒迅速有力地将团状组织研磨成细粉末。

3. 然后加入600μL预热至60℃的2%CTAB提取缓冲液（2% CTAB，0.1mol/L Tris?Cl pH8.0，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl），20mg/mLProK 2.5μL(终浓度100mg/mL)，和β-巯基乙醇溶液1.0μL，轻轻混匀，60℃下恒温水浴2.0-3.0 hr，不时加以轻轻混匀。

4. 水浴后取出，等体积氯仿/异戊醇（24：1）混合液混匀，然后7,000 rpm 离心10min，取其上层清液，量体积；重复一次。

5. 在上层清液中加入2倍体积冷冻的无水乙醇于－20℃沉降2小时( 或1倍体积异戊醇于－20℃沉降1hr)。4℃、10,000 rpm下离心15min，取沉淀, 小心弃上清。

6. 用500μL 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，10,000 rpm下离心5min，弃上清；重复一次。

7. 室温晾干或抽真空干燥；用40μL TE Buffer重溶。

8. 于基因组DNA中加入终浓度为50ug/mL的RNase（每次使用前90℃灭活10min），于37℃消化1.0-1.5hr。

9. 用0.8%的琼脂糖凝胶检测，取3μL DNA样品及2μL Load-buffer (含溴酚蓝和缓冲液)，加入点样孔。实验所用Marker是 DNA（EcoR/HindIII），100V 电压电泳90分钟。凝胶成象分析仪进行检测。

10. 用紫外可见分光光度计测定DNA的OD值，判定DNA纯度和浓度。