IPCTM650中文版1.1切片制作
IPC-TM-650测试方法手册（ 2.1.1）
切片制作
1、范围：
此程序是用作PCB金板规格的准备，成品切板是用来评估基材和PTHS的质量，我们须评价PTH的这几个方面：铜箔的厚度、镀层及决定符合规格要求的涂层，相
同的基本程序可用作其它地区的插件和测试，因为手工的金板准备，被许多人看作
是基本的工作。这本手册描述了被证明是一般可行的技术，它对那些能够区分金板
制作者的不可接受的变量的阐述不是那么具体，而且，这些技术的成功，高度依赖
于金板制作者个人的技术。
2、适用文件
IPC-MS-810 高质量切片的指导方针
ASTM E3 金板样品准备的标准方法
3、试验规格：
首先把要求的样品从印制板上或附连测试区切割下来。为了使所检板不受损害，要彻底清洁板面。可推荐的最小清洁度是 2.54mm研磨剂切割轮能很好的切割所检板而对板面不造成损害，一般使用的方法包括用宝石切割，微小波段锯切割或研磨的切割轮。锣板使用一个很小的割磨机器。在啤板中使用尖的、空的冲模（不用于易碎的材料，即聚酷亚胺和一些变更的不氧树脂系统）参照IP-MS-810。据介绍一张切片最少要包括用于测试样品的最小的3个PTHS直径。当切割多层板时，在所有的层上没有非功能焊盘，要仔细挑选测试。比如：内层焊盘与选择性的PTHS相连，这就可以制作成一套完整的质量评估。
4、器具或材料
号码：2.1.1
主题：切片手册
日期：3198 修订本：D
原任务小组：
后分离任务小组
4.1样品祛除方法（参照IPC-MS-810满足你需要的最佳方法）
4.2 插件铸型/模子
4.3 平滑、扁平插件表面
4.4 隔离剂（可选择的）
4.5 样品支持（可选择的）
4.6 金相学的旋转辗磨/磨光系统
4.7 磨光带（可选择的）
4.8 可放大100到200倍的金相学的显微镜。
4.9 真空管和真空干燥器（可选择的）
4.10切割陶制材料的室内温度（推荐最大的切割温度是93℃）
4.11砂纸（美国CAMI级研磨尺寸180,240,320,400,和600,参照表1从美国到欧洲研
磨尺寸的转换）。
4.12磨光轮用的布：粗糙和中级磨光用硬的、低价的、没毛的布，而最后磨光用柔软
的、织物毛材质的布。
4.13 氧化物或硅胶磨光悬浮液（最后磨光0.3-0.04um）。
4.14 钻石磨光研磨剂（6-0.1um）
4.15 磨光润滑剂
4.16 样品蚀刻液（见 6.4）
4.17 清洁和蚀刻用的棉球和药签
表1 砂纸研磨尺寸（美国对欧洲）
4.18 Isopropyl酒精，25%的甲醇水溶剂或其它合适的溶剂（用封装介质和标记系统来
检测反应）。
4.19 样品标记系统
4.20 超声波清洁器（可选择的）
5、程序
5.1样品的准备，按顺序在180,240,320研磨轮上磨样品,最后磨光的深度大概是
1.27mm。在插件之前应除去所有边缘上的毛刺。
5.2 插件金板
5.2.1清洁插件表面并彻底烘干，然后在电镀和插件环上隔离剂。
5.2.2使用合适的溶液（如isopropyl或乙烷基酒精）彻底清洁样品，这在切割热应
力（浮焊）样品时是非常重要的，若在样品和介物之间改孔，封装介质粘贴力
不好可能会导致残渣。这些孔是绝对有可能使金板样品准备特别难做。
5.2.3使插件中的样品直立，用样品芯片或是使用双面砂纸垂直于基材使其固定。
5.2.4被检测面应面向插件表面。
5.2.5用材料陶器材料小心地填满插件环，通过泼洒一面确保完整的填满PTH，制造
商供应的，为了填满PTHS面小直径减少粘性，可能需要稀释。据推荐为了防
止皮肤感光力，应用手工保护。
5.2.6样品必须直立，而且要用封装材料填孔。
5.2.7为了完成填孔工作，环氧材料可能需要真空放气。
5.2.8允许切割样品及从环上除去变硬插件、插件的最小质量应该是如下标准：
·在陶器材料和样品之间无缺口；
·用材料填满PTHS；
·在陶器材料中无泡沫。
如错过任何一项都会造成样品准备的困难（ 5.2.2里有所注明）用永久的方法
来确认样品，挑选的标记系统经过溶剂和润滑剂的曝光应仍不受影响。
5.2.9对那些有限的镀层厚度的测量（如在板边接触面金和镍的厚度）电镀样品放置
角度应为30°。这将会对于第2次测真正的厚度提供借鉴，被检测的厚度为了
接近真实的厚度，应被分成2半。若要更进一步的了解胶纸切割技术，请参照
6.5。
5.3 辗磨和磨光
5.3.1用金相学的设备在180研磨砂纸上粗插件，不接近PTH孔壁的边缘。
注意：为了除去磨板杂质必须使用大量的水流阻止样本过热和对样品造成损
伤。
5.3.2好的辗磨样品，使用大量的水流，使用240,320,400和600研磨盘，集中PTHS
最后的纸（600gritl）应完成在PTHS的中线轴。在辗磨时，轮速一般为
200-300rpm，在2个相连的研磨尺寸中将样品旋转90°，再辗磨2-3次，在
前工序除去擦刮的时间，确认已除去擦刮可以在工序间用显微镜检测。切割
的基材表面须是在一个单一的平面是非常重要的。在连续的研磨尺寸中旋转
切板90°的目的是为了推进检测。如若在最后一个工序中观察到了垂直于上
的擦刮，这就很好的显示了切板表面不是很平滑，需要再次的辗磨。若在辗
磨操作完成后，切板表面还是平滑，那么在粗磨过程中除去所有擦刮是不可
能的，金板制作者须认清这个事实。更粗糙研磨尺寸（180,240和320）会促
使更大的畸形的深度和碎片材料因为畸形深度减少在一个300um的原始子尺
寸之下（400grit），那么为了达到板面最后切割，最好是在400grit，特别是600研磨上花长一点时间，而不是在更粗糙的研磨尺寸上。
5.3.3若可以的话，在每个工序间用自来水浸洗样品，再用过滤空气吹干，超声波
清洗。
注意：在粗磨或所有磨光步骤之前，特别是在细致辗磨阶段应大力推荐超声波清洁，这是印制标品的特性。特别是在样品浸湿过程中，没祛除那些遵照热曝光的
环氧基材及能限制辗磨，磨光孔中的残渣，必须小心别用过度的超声波清洁
而伤害样品表面，即使是一分钟，都能损伤磨光的表面。
5.3.4用6um钻石研磨剂在一个硬的、低的、无毛布上粗磨标本。在接下来的粗磨
过程中，要细细检查样品，是否已除去所有600研磨刮痕，最好用超声波清
洁样品，然后又用1-3um钻石研磨剂，用一块硬的、低的、无毛的布继续磨
光。然后再细细检查样品，确认祛除所有6um钻石的刮痕，如果可以的话，
用超声波清洁样品，一般来说，正确放置在以上步骤中使用中等电压磨几分
钟就可以了。切板在粗磨和中间，研磨中一般轮速为200-300rpm。用一个柔软的、化物或毛布材料，或用1-0.1micron钻石来研磨，用0.05um蚀金或其它氧化物或一个硅胶磨光液来完成最后的打磨，若使用氧化物或氧化织磨光
混合物话，要使光打到中等压力，最后一个步骤用10-20秒就可以完成了，若用钻石混合物在柔软的织布上磨时，最后打磨时间将延长几分钟（见
5.3.5）。由于在切板时，增加了空气阻力，在最后磨光中一般减少轮速至
100-150rpm，很典型的是，紧跟着1um钻石的6um和一个0.04um硅胶或0.05um 氧化织，使用都非常成功，然而，其它变量如6um、3um、0.25um钻石都使用得很成功，有些人甚至在无毛的布上使用 1.0和0.3um氧化织，跟紧着把
0.05um氧化织使用于一个柔软的毛材料的布，这些程序之所以可以成功，主
要是依靠金板制作者的手艺，但是与钻石混合物比起来，会造成不良边缘保
持性和更多的浮雕效应（见参考1中6.5）。
5.3.5警告：毛布材料的使用可导致不良的边缘持力（成为圆形的）及组成物之间
的突起，因为它恶化了。原样祛除的不同率（即与基材上的铜和玻璃
纤维比起来，锡铝合金和软的封装介质在个更快的效率上祛除），毛
料越高，效果越好。可用者在最后的磨光阶段需阻少打磨时间，使用
大量润滑油和轻微的压力。
5.3.6 在温微和的肥皂、热水、溶济中浸湿然后吹干。
5.3.7检测和重磨，若有必要的话开始用6um钻石，直到出现这些情况：
1、再没有比那些由最后磨光研磨剂引发的更大的刮痕了。
2、样品不得高于或低于插件材料。
3、没有把电镀铜沾污到PTH或基材上去。
4、按规定，切割的板面在孔的中线上。如果辗磨深度不够，需要再次辗磨和重
新磨光。
5、对基材的玻璃纤维有一点可见的损害。
参照IPC-MS-810的显微照片，阐述了以上一些质量，若切片质量符合要求的话，检测在“磨光”条件下在 5.4.1确认，以黑线或部分黑线出现的内
层分离的疑似区的多层板的切板。这些地方在金板，蚀刻后就应被确认，当
检查具体放大时，对那些蚀刻后的标记，可能没有一对一的注有“磨光的”
分离标记的相关数。
5.3.8 用合适的蚀刻液的网状样品（见
6.4）一般只用2-3秒，再重复2-3秒，有
必要的话显露电镀的接触面。
注意：蚀刻过度的话会使铜箔和电镀铜之间的划分的线模糊而不能精确检测。
5.3.9 为了祛除蚀刻剂，在水龙头或离子水中浸泡。
5.3.10 在溶剂中浸湿，然后吹干。
5.4 评估。
5.4.1把放大倍率设定在100x，并用一个显微照片（设定在光亮度）测量规定要求
的所有特征，除非有另外的注明，调至200x。
5.4.2至少在3个PTHS中测量镀层厚度，总共表面铜厚在相同样品的交叉部分也能
被测定，把电镀厚度测定和电镀质量记录下来，电镀厚数决定不能有沙孔或
裂缝。
5.4.3质量检测可能包括如下方面：起泡、基材沙孔、裂缝、树脂未祛除、孔壁撕
裂、电镀不一致、毛刺、电镀沙孔和麻点，除此之外，多层板的电镀质量包
括：板内部与PTH相连，沾污树脂，玻璃纤维突出和树脂腐蚀，一些电镀条
件在蚀刻前须观测磨光样品。
6、注意：
6.1按照ASTM3规格用三层铜或其它类似样品的硬度电镀样品per ASTM3。在封装之前，
要提供更好的边缘保持力，因此要更为精密的厚度测量。
6.2 若要更加准确的测量内层分离，在推荐 6.2.1和6.2.2里面的方法包含的程序。
6.2.1 重磨过程
6.2.1.1 在磨光后，用金相学的显微镜检测。然后在最后的辗磨轮将电源关掉。
6.2.1.2用大量的水在一个静止位置与PTH桶平行的轮子600砂纸轻轻重磨样品，双
面打击6-8下就上够了。这将会除去在旋转磨光时。造成的使内部连接分离
的铜金沾污物。
6.2.1.3将样品浸湿，然后烘干再重磨，然后在显微照片下检测是否有内部连线分离
的存在。
6.2.1.4在“磨光”条件下检测之后（最好的方法是照显微照片），用在6.4中描述的
温和蚀刻液蚀刻样品，然后再检测样品是否有内连线分离和所有特征，可能
没有注明一对一的所有磨光后的分离相关数。
6.2.2 机械/化学准备（腐蚀磨板）
另一项有用的技术在最后的磨板步骤中是一个。同时机械/化学的磨板。使用
95%的硅胶和5%体积的过氧化氢（30%浓度）的混合剂在化学阻焊中打磨，这就
导致了样品磨损及机械和化学的磨损，金板制作者须要小心地用化学抗磨力平
衡化学磨损。太多的机器磨损会导致刮痕，太多的化学磨光将会导致样品的蚀
刻，这些条件都不理想。为了改善光学的平衡应多做些这方面的实验。
6.3 为了进一步探测内部连接分离，使用在平面上重辗、重磨样品（垂直于原竖直平
面）和检测半圆固接触面，这种方法成效不大，内层厚度的分离效果不到50%（在坚直切板中有所注明）。
6.4 以下是推荐的蚀刻液
25ml的氢氧化铵（25-30%）
3-5%的25ml-35ml体积的稳定的过氧化氢，额外25ml的水（蒸馏或反渗透）会稀释溶液将会延长蚀刻时间，在某些情况下是理想的。使用前先等几分钟，每几
个小时就准备清水。
6.4.1有其它蚀刻液被使用或是被用来蚀刻铜，必须小心选择和使用，因为电解、
电镀的敏感性箔蚀刻特点及锡织存在时可能有电流效果（见 6.5参考2和
IPC-MA-810）。
6.4.2当研究锡织阻焊时，使用特别制造的用来暴露那些合金的微观结构蚀刻剂有
时是非常有用的（见 6.5参考2）。
6.5 关于金相水实验额外参考
1、美国金属协会1982 ISBN：0-87170-135-9，金板磨光的机器方法。
2、金板蚀刻Gunter Petzow，美国金属协会1978。
3、金相学原则与实施。
4、金属手册案头便览板由美国金属协会Howard E.Boyer和Timothy L.Gall编
写。
徒手切片制作方法(借鉴材料)
一、目的要求 徒手切片法是观察植物内部结构的简易制片法。所需的仪器用具简单，药品经济，操作方便，费时较短，且易于保持材料的天然色泽和活体结构，必要时，也可经过脱水、染色制成永久制片而保存。但是徒手制片对于体积过小，质地太软或太硬的材料，则难于处理，同时，也不能制成连续切片，这些均为不足之处。 二、材料、用品 1、用品 显微镜、剃头刀（或刀片）、毛笔、镊子、培养皿、染色皿（或小酒杯）、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸。1%番红水溶液（或50%酒精溶液），0.5%固绿95%酒精溶液，70%、85%、95%酒精，纯酒精、二甲苯和中性树胶或加拿大树胶等。 三、方法与步骤 1、选材 所用材料不宜太软或太硬。一般植物幼嫩的根茎或一些植物的叶片、叶柄等均可使用此法。质地较薄的材料，如叶片，可沿主脉两侧切成宽约5～6毫米，长1～1.5厘米的小块，夹在夹持物(如胡萝卜根或马铃薯块茎等)中进行切片。使用夹持物时，先将夹持物的中央切成两
半，然后将切好的材料夹入，合拢夹持物进行切片，也可将叶片卷成筒状再切。 2、切片 （1）盛清洁的水于培养皿中。然后用左手的拇指及食指、中指夹住材料，拇指的位置要低于食指，并使材料的上端伸出指外2～3毫米，材料的切面必须保持水平方向。 （2）右手执刀(剃头刀或刀片)，平放在左手食指之上，刀口向内，自左前方向右后方滑行切割，要用臂力，不要用腕力，不可向内平切。 (3)拉切的速度宜快，一次切下，不要中途停顿或似拉锯式，以免损伤材料或切得不平。 (4) 切片过程中，如发现由于用力不均而使材料表面倾斜时，必须立即削平。 (5) 刀片或剃刀必须锋利，材料及切片均需经常沾水，以保持材料湿润、润滑。 (6)切下的薄片可随时涮入培养皿的水中，以备观察;等切到相当数量后;再选择其中最薄的透明度最大的做成临时玻片观察。如想短期保存，可用水或甘油封藏。如希望长期保存所切的材料，则还要经过以下几个步骤做成永久玻片标本。 3、固定 挑选出符合要求的切片，用毛笔移入盛有70%酒精的染色皿中进行固
实验二 徒手切片法和临时装片的制作方法以及植物细胞和组织观察
实验二临时装片的制作方法和徒手切片法以及植物细胞、组织观察 一、实验目的 1、掌握临时装片的制片方法、掌握徒手切片的方法 2、了解植物细胞结构。 二、实验材料 显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、解剖针、培养皿、毛笔、滴管、纱布、 0.9%的NaCl溶液；洋葱、马铃薯、芹菜、番茄 三、实验内容和实验方法 （一）临时装片的制作 1、擦净载玻片和盖玻片 （1）擦载玻片用左手的拇指和食指捏信载玻片的边缘，右手用纱布将载玻片上下两面包住，然后反复擦拭，擦好后放在干净处备用。 （2）擦盖玻片先用左手拇指和食指轻轻捏住盖玻片的一角，再将右手拇指和食指用纱布把盖玻片包住，然后从上下两面隔着纱布慢慢地进行擦试。 2、取样 用滴管滴一点水或其他溶液（根据需要）于载玻片的中央，把观察物放于载玻片上的液滴中，展开或摇匀。 3、盖盖玻片 右手持镊子，轻轻夹住盖玻片的一角，使盖玻片的边缘与液滴的边缘接触，然后慢慢倾斜下落，最后平放于载玻片上，避免气泡的产生。如盖玻片下的液体过多，可用吸水纸将多余的液体吸掉。
（二）徒手切片法 徒手切片法不需要任何的机械设备，只需要一把锋利的刀片就可以完成切片的制作，方法简单，也容易保持物的生活状态，有很大的实用价值。 1、选材 选择软适度的材料，先截成适当的段块。一般直径大小以3~5mm、长度以20~30mm为宜。若材料太软，如幼叶等，不能直接拿在手中进行切片，可用适当大小的马铃薯块茎或萝卜块根等作支持物，将材料夹入其中，一起切片。 2、切片 用左手拇指、食品指和中指夹住材料，使其稍突出在手指之上，拇指略低于食指，以免刀口损伤手指。材料和刀刃上蘸水，使其湿润。右手拇指和食指横向平握刀片，刀片要与材料断面平行，刀刃放在材料左前方稍低于材料断面的位置，以均匀的力量和平稳的动作从左前方向向右后方拉切。切片时要用臂力而不用腕力，手腕不要动，靠肘、肩关节的屈伸来切片，拉切要快，中途不要停顿，更不能用拉锯方式进行切片。 每切2~3片就要把刀片上的薄片用湿毛笔移入盛有清水的培养皿中暂存备用。如发现材料切面出现倾斜，应修平切面后再继续切片。 3、镜检观察 连续切下很多切片后，挑选最薄的切片放于加了1滴清水的载玻片，盖上盖玻片，制成临时装片，进行镜检、观察。 （三）植物细胞的结构观察 1、洋葱表皮细胞的观察 取一洁净载玻片，于载玻片中央加上一滴水。取洋葱一个，剥下一片新鲜的带紫色的南鳞叶，和刀片从外表面（或内表面）切一个面积为4mm2左右的方形小格，然后用镊子将表皮撕下，迅速入入载玻片上的小水滴中（表面向上）。并使其平展，盖上盖玻片，即制成临时装片。将装片放在显微镜下，用低倍镜观察细胞结构。
组织切片制作步骤
组织切片制作步骤： 1.取材 确定所取材料的来源及部位，纵切还是横切； 取材要迅速，防止阻止发生进一步变化，材料体积要适宜。 下图为植物芽体取样实拍。 2.固定 （1）固定液的选择 最常用的固定液为FAA（万用固定液）。 它的优点是材料固定时间不受限制，固定时间短则数小时，长则数月或数年。（可做材料保存液） 配方：50％或70％酒精90ml 冰醋酸5 ml 福尔马林5 ml (柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精配制) （2）材料固定后的处理 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。 (材料固定后，若暂时不能进行下一步操作，可于70%的酒精溶液或直接与FAA固定液中，于冰箱中4℃存放。) 下图为固定液浸泡的组织切块。 3.脱水 目的：水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进
入。 试剂：梯度酒精溶液 流程：70%---85%---95%--100%---100%每步1h-2h左右。 注意事项：保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但也不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩，这个时间大家可以根据自己的实验来摸索一下，不必完全按照本操作来）。 下图为自动组织脱水机，适于大量样品组织脱水用。如果材料体积及样品量较少可用小烧杯做容器来进行逐级脱水。 4.透明 目的：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。 (二甲苯是最常用的透明剂，可以很好地与石蜡互溶) 流程：二甲苯与酒精的等体积混合液1h---纯二甲苯1h---纯二甲苯1h。 5.浸蜡与包埋 目的：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 浸蜡程序:(恒温) （1）低温浸蜡（36℃）：接上步，在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和（石蜡不能溶解），过夜12-24h。 （2）高温浸蜡（55-60℃，高于石蜡熔点3℃）： 将上步二甲苯与石蜡的混合液倒出，不要倒掉材料，将烧杯中加入纯石蜡，共5-24h。纯石蜡需要更换三次。
组织切片制作步骤
徒手切片法： 徒手切片法是指手持刀片将新鲜的或固定的实验材料切成薄片的制作方法。徒手切片法是指不需要专门的仪器设备，试样也不需要特殊的化学试剂处理，而直接将新鲜的或固定的材料(一般为木质化程度较低的植物)切成薄片的方法。 基本信息： 徒手切片前，应先准备好一个盛有清水的培养皿。在切片时，用左手的拇指与食指、中指夹住实验材料，大拇指应低于食指2～3mm，以免被刀片割破。材料要伸出食指外约2～3mm，左手拿材料要松紧适度，右手平稳地拿住刀片并与材料成垂直。然后，在材料的切面上均匀地滴上清水，以保持材料湿润。将刀口向内对着材料，并使刀片与材料切口基本上保持平行，再用右手的臂力（不要用手的腕力）向自身方向拉切。此时，左手的食指一侧应抵住刀片的下面，使刀片始终平整。连续地切下数片后，将刀片放在培养皿的水中稍一晃动，切片即漂浮于水中。当切到一定数量后，可在培养皿内挑选透明的薄片用低倍镜观察检查。好的切片应该是薄且比较透明、组织结构完整，否则要重新进行切片。 对经检查符合要求的切片，如果只作临时观察，可封藏在水中进行观察。若要更清楚地显示其组织和细胞结构，可选择一些切片进一步通过固定、染色、脱水、透明及封藏等步骤，做成永久玻片标本。 徒手切片技巧 如果不想切斜，要注意两点，一个是左手拿的露出来那截要短，
尽量只能连续切2刀的样子(一般是可以切4，5刀的），一个是切口一定要水平，同时右手的刀片也要水平，拉刀的时候保持在一个平面上（拉快点容易做到）。这是根和茎的切法，不过每次的量会有所减少。对于叶，有三种切法，一个是直接切；一个是卷成管状，当茎来切；还有就是用三层刀片夹起来。其中，第一种适合于裸子植物那种针叶，方法要领和上面说的差不多；第二种适合于比较软的叶片，要领是要卷的细，中间的洞不要太大（大了容易斜）；第三种适用于比较坚韧，硬的叶片，绝对要放在载玻片之类的地方，要用划的，凌空切会很不顺，容易切不断。还有一种特殊的方法是切成小块的先，再夹到萝卜里面（事先挖个洞或切条槽），再一起切，这个适用于全部，根茎叶，软的硬的均可（就是那种针叶不太好用它，我都切不好）。所以克服柔软就是要注意，想办法使它变厚变硬（对叶：卷，夹，或者垫玻璃；对根茎，夹，或者用左手捏紧一点，捏上面一点，使它不会晃）。至于弯曲，我觉得不用太在意，要么舍弃掉这一段，要么用手压紧，关键只是上面要平。还有，如果切含有楞或者有叶脉的部分，一定要从这些地方开始切，先切硬的部分（朝向刀口）。平时切两到三层差不多，一层的细胞会破损，有空洞；这样也比较适合染色。 徒手切片的优缺点 徒手切片是用手持双面刀片或剃刀，将新鲜材料或预先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不经染色或经简单染色后，用水封片作临时装片观察。徒手切片法的优点是不需要复杂的设备，方法简便，制片迅速，而且能观察到植物组织的自然色泽和活体结构，常用于研
石蜡切片的制作过程(精)
石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法
石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片
植物组织切片制作以及注意事项
植物组织石蜡切片的制作以及注意事项 1 植物组织石蜡切片的制作方法 ⑴固定：用50%或70% FAA固定液（50%或70%酒精：甲醛：冰乙酸=16:1:1; 幼 嫩材料用50 % FAA；老的材料用70%的FAA），置于4℃固定24 h。 ⑵脱水：将固定液倒去，加入50%乙醇，室温静置30 min；重复一次，室温静置 20 min。换成1%番红O溶液(用70%酒精配制)，室温脱水染色过夜。次日继续 脱水，酒精浓度梯度和时间依次为：80% 乙醇1h、95% 乙醇1h、无水乙醇1h、40min（2次）。 ⑶透明：1/2无水乙醇+二甲苯混合液1h，纯二甲苯1h、40 min（2次）。最后加入 少量二甲苯（浸没材料即可）和碎蜡，放入38℃温箱中过夜。 ⑷浸蜡：将温箱温度调至56℃，计时1h；换成二级蜡1h；三级蜡（3次）各1h、 1h、40min（从温度上升到56℃开始计时）。 ⑸包埋：将带有材料的液体蜡倒入叠好的纸槽中，迅速放入冰水中使蜡凝固，防止 气泡产生，以及凝蜡不匀。 ⑹切片：修整蜡块，用Lica RM2126切片机切片，厚度5-10 μm。 ⑺贴片: 在载玻片上涂少许粘片剂，将切好的蜡带放入温水中，捞至载玻片上，最 后置于37℃恒温箱过夜烤片。 ⑻脱蜡及染色： ①番红-固绿对染 ⅰ脱蜡：二甲苯60min，二甲苯5 min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5 min、无水乙醇5 min、无水乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min、1%番红室温过夜。 ⅱ染色：80%乙醇5 min，1%固绿（用95%酒精配制）迅速蘸一下，大约10s，直接放到95%乙醇5min 、无水乙醇5min、无水乙醇5min、1/2无水乙醇+1/2二甲苯混合液5min、二甲苯5 min（2次）。
徒手切片制作方法
、目的要求 徒手切片法是观察植物内部结构的简易制片法。所需的仪器用具简单，药品经济，操作方便，费时较短，且易于保持材料的天然色泽和活体结构，必要时，也可经过脱水、染色制成永久制片而保存。但是徒手制片对于体积过小，质地太软或太硬的材料，则难于处理，同时，也不能制成连续切片，这些均为不足之处。 二、材料、用品 1、用品 显微镜、剃头刀（或刀片）、毛笔、镊子、培养皿、染色皿（或小酒杯）、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸。1%番红水溶液（或50%酒精溶液）， 0.5%固绿95%酒精溶液，70%、85%、95%酒精，纯酒精、二甲苯和中性树胶或加拿大树胶等。 三、方法与步骤 1、选材 所用材料不宜太软或太硬。一般植物幼嫩的根茎或一些植物的叶片、叶柄等均可使用此法。质地较薄的材料，如叶片，可沿主脉两侧切成宽约5?6毫米，长1? 1.5 厘米的小块，夹在夹持物（如胡萝卜根或马铃薯块茎等）中进行切片。使用夹持物时，先将夹持物的中央切成两半，然后将切好的材料夹入，合拢夹持物进行切片，也可将叶片卷成筒状再切。 2、切片 （1 ）盛清洁的水于培养皿中。然后用左手的拇指及食指、中指夹住材料，拇指的位置要低于食指，并使材料的上端伸出指外2?3毫米，材料的切面必须保持水平方向。 (2) 右手执刀(剃头刀或刀片)，平放在左手食指之上，刀口向内，自左前方向右后方滑行切割，要用臂力，不要用腕力，不可向内平切。
(3) 拉切的速度宜快，一次切下，不要中途停顿或似拉锯式，以免损伤材料或切得不平。 (4) 切片过程中，如发现由于用力不均而使材料表面倾斜时，必须立即削平。 (5) 刀片或剃刀必须锋利，材料及切片均需经常沾水，以保持材料湿润、润滑。 (6) 切下的薄片可随时涮入培养皿的水中，以备观察;等切到相当数量后;再选择其中最薄的透明度最大的做成临时玻片观察。如想短期保存，可用水或甘油封藏。如希望长期保存所切的材料，则还要经过以下几个步骤做成永久玻片标本。 3、固定 挑选出符合要求的切片，用毛笔移入盛有70%酒精的染色皿中进行固定。固定时间为16 分钟或更长时间。 4、染色、脱水、透明 ( 1)用吸水管吸去70%酒精，染以1%番红( 50%酒精溶液)约30 分钟。 (2)再用吸管吸去番红，换用70%>85%>95%酒精进行冲洗、脱水，每级酒精3?5分钟。 ( 3)复染色。吸去酒精，用 0.5%固绿(95%酒精溶液)进行复染色，时间为 0.5 分钟。 ( 4)冲洗、脱水。用95%酒精冲洗1 次，时间10 秒。后移入纯酒精中脱水2?3 次，每次3?5 分钟。 （5）透明。吸去纯酒精，放入二甲苯—纯酒精溶液中脱水和透明1 次，时间5 分钟。 （6）吸去脱水透明液，换以纯二甲苯透明2次，时间5 分钟。 5、封片、贴标签将已透明材料用镊子或解剖针轻挑于清洁的载玻片上，滴上中性树胶，盖上盖玻片进行干燥。
6树脂切片制作过程
树脂切片制作过程 一、实验仪器及试剂 1.器具 电子天平、70℃恒温箱、玻璃制刀机、半/超薄切片机、显微镜、包埋模、制刀用的玻璃条、镊子、刀片。 2.试剂 (1)固定剂：FAA (2)脱水剂：20%、40%、60%、80%、90%、95%、100%的乙醇；丙酮(3)树脂：Spurr树脂(4)染色剂：1%碱性品红二、实验步骤 1.取材和固定： 取样时所用的器具必须干净，刀、剪等必须锋利，在操作时尽量避免拉、锯、压等动作对组织细胞造成的机械损伤。一般样品块的大小约为1立方毫米，取材完成后立即放入固定液中，真空泵抽气两到三次，每次1-2min（注意不要让固定液沸出，如抽完后液体较少，可再补加固定液）。 2.脱水： 用50%、60%、70%、85%、95%、100%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理10～15min。 3.置换 (1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml丙酮，处理材料10min。 (2)向管瓶中追加1ml丙酮，处理材料10min。 (3)向管瓶中再追加2ml丙酮，处理材料10min。 (4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和丙酮混合液，加入纯丙酮3次，每次10min。4.浸透 (1)在管瓶中加入1ml丙酮，向内滴入1滴Spurr树脂，1～2h。 (2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，放置1～2h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。 (3)用吸管吸去管瓶中0.5～0.8ml的丙酮和Spurr树脂的混合液，然后加入纯Spurr树脂0.5ml，使树脂浓度达到50%～60%左右，2～3h。 (4)用吸管吸去管瓶中的丙酮和Spurr树脂的混合液，加入0.5～0.8ml的Spurr树脂，2～3h。 (5)更换新配制的Spurr树脂1ml，过夜。(6)重复换树脂3次，每次12h。5.包埋与聚合 (1)先将恒温箱调至温度至70℃，包埋模事前烘干置干燥器中存放。 (2)在湿度小的房间里进行包埋操作。在包埋模的中放上已浸透的材料(用牙签不损伤样品地桃)，用滴管吸取新配制的Spurr树脂，并注满每个穴孔，用牙签拨样品，使样品按一定方位(有利修块、切片和观察)排列。做好记载(各穴孔中放的是什么样品)。 (3)聚合：将包埋样品的包埋模放入70℃恒温箱中聚合，8h后取出置干燥器中存放。多余的树脂可放在胶囊中或放在包埋模的穴孔中同样品一同聚合。 6.修块 用锉刀或铁砂皮磨样品块，使样品稍稍暴露，使待切部位呈方形或长方形，最后用刀片将样品块的磨面切平7.玻璃刀的制作 用玻璃制刀机先将玻璃条制成边长为25mm的正方块，然后再将每正方块制作成2把璃制刀。8.切片、贴片 (1)固定样品块和玻璃刀将样品块和玻璃刀固定在半薄切片机上，玻璃刀的避样品角约为5度，切片机装样品部位平放时，玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置，使刀口接近样品块。 (2)荒切开动切片机，调节进刀距离和速度，让玻璃刀荒切样品块，使样品块的切面逐渐平整光滑起来。 (3)切片当样品块的切面平整光滑后便可正式切片。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1-2μm左右。
徒手切片的基本要求
、目的与要求 1、学习并掌握临时装片的制作方法和步骤。 2、学习徒手切片技术。 3、了解细胞基本结构和厚角组织的特点。 二、材料和用品 1、自备材料：解剖器（镊子、解剖针、单面刀片或双面刀片）；洋葱鳞茎、青红椒、芹菜叶柄、女贞叶片或其它植物的叶片、胡萝卜块等。 2、其它材料和用品：显微镜、盖玻片、载玻片、纱布、蒸馏水、吸水纸、10%甘油水溶液、50%甘油水溶液、纯甘油、碘—碘化钾稀溶液、培养皿、吸管。 三、实验内容 1、临时装片的制作方法 2、徒手切片方法 四、实验方法 要观察、研究植物细胞、组织和器官的微细结构，以及一些很微小的藻、菌植物等，这些用肉眼是无法看到的，必须借助于显微镜来观察，要用显微镜观察，首先必须制成各种制片，放在显微镜下才能观察。制片的方法很多，这里着重介绍临时装片法和徒手切片的方法技术。 1、临时装片的制作方法 临时装片法是用少量的新鲜植物材料，如单个细胞、薄的表皮或切成的薄片以及其它小的或扁平的材料（如丝状或叶状的藻类、菌类、蕨类的原叶体和孢子囊、纤细的苔藓植物等等），把这些材料放在载玻片的水滴中，再盖上盖玻片做成玻片标本的方法。这种方法制成的标本，可以保持材料的生活状态和天然的色彩。此法一般多做为临时观察使用，也可根据需要选择适宜的染料染色，制成永久制片或用某些化学试剂作组织化学反应。 临时装片的制作方法和步骤如下： （1）清洁玻片：将盖玻片和载玻片用清水洗净，再用纱布擦干，擦玻片时用左手食指和拇指夹住玻片的两边，右手食指和拇指包住纱布，同时擦到的玻片的两面，用力要均匀。 注意：由于盖玻片很薄，所以擦盖玻片时要特别小心，用力要轻，右手食指和拇指要轻轻捻动，以免把盖玻片捏破。 （2）放置材料：先将载玻片平放在桌面上，于载玻片中央滴一滴蒸馏水或稀甘油，然后用镊子镊取或吸管吸取少量要观察的材料（如洋葱鳞叶表皮或水绵……），放在载玻片中央的水滴或甘油中，再用镊子和解剖针将材料展平或分散开，勿使材料折叠或干燥。（3）加盖玻片及其它处理：为了避免产生气泡，盖盖玻片时，应该以大拇指和食指拿着盖玻片的两个角或用镊子夹住其一端，使盖玻片的一边先与载玻片上的水滴边缘接触，而后徐徐放下另一边，当盖玻片被夹持的一边将贴近载玻片时，则可放手或抽出镊子，使其自然轻轻复盖，这样可以使盖玻片下的空气挤出，免生气泡。注意载玻片中央的液滴要适中，既要使其充满盖玻片，又要不会使盖玻片浮动或使液滴从盖片下外溢，假如水不够，可用吸管小心地从盖玻片的边上再滴入一小滴水，使它和盖玻片下面的水相接触；如果水太多，溢出盖玻片，则可用吸水纸吸去，盖玻片的上面，一定不能被水浸湿，如果发生这种情况，应该小心地取下盖玻片，擦干以后，再按上述方法重新盖上。这样做好的装片，便可在显微镜下进行观察。根据需要，临时水装片做好后还可以进行简单的染色（例如用碘—碘化钾或番红等来染色），其方法是直接在盖玻片的一侧加一滴染液，用吸水纸条在盖玻片的另一侧吸水，引入染液，以使盖片下的材料染上色。
电镜切片样品制作步骤知识讲解
A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗； 固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附：2.5%戊二醛的配制 Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制： --------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克 磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克 双蒸馏水加至500毫升 pH调至7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25% 戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值7.3-7.4
病理切片的制作过程
1.7.1 修整组织 将手术切取的乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透和组织脱水等操作，通常以10 mm×10 mm×3mm或5mm×5mm×3mm为宜。找到不同的部位切取2块，以备后用。 1.7.2 组织洗涤 组织经修整后，组织中的福尔马林等必须冲洗干净，尤其是含有重金属的物质存在。因为残留在组织中的福尔马林，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。 1.7.3 组织脱水 组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。 80%乙醇溶液：2h 95%乙醇溶液:1h 95%乙醇溶液:1h 100%乙醇溶液:30min 100%乙醇溶液:30min 1.7.4 组织透明 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。 二甲苯Ⅰ：30min 二甲苯Ⅱ：10min 1.7.5 组织浸蜡 浸蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织的透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。 石蜡Ⅰ：1h
石蜡Ⅱ：1h。 石蜡Ⅲ：1h 1.7.6 组织包埋 将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块的过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，沿壁倒入包埋用的纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡，新的石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间。 1.7.7 组织切片 （1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快 （2）将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。 （3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。 （4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。 （5）调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。 （6）调整厚度调节器到所需的切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。 （7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-60r/min。 （8）切成的蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。 （9）感觉效果较好的蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43℃的水浴锅中展片，观察切片是否良好。 （10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。 1.7.8 贴片
显微镜标本切片的制作方法
1.涂片、铺片、磨片标本的制备 涂片标本的制备;涂片（smear）法是常用的一种方法，如血液等可直接涂于载玻片上制成涂片标本，干燥后进行固定、染色及封固。 铺片标本的制备;（stretched preparation）法用于疏松结缔组织、神经等柔软组织或肠系膜等薄层组织，可将其铺于载玻片上，撕开、展平制成铺片标本，待干燥后进行固定染色。 磨片标本的制备;（ground section）法是用于坚硬组织的标本制作，如骨和牙等坚硬组织除用酸（如稀硝酸）脱钙后再按常规制成切片标本外，也可直接将其磨成薄的磨片标本进行观察。 2.切片标本的制备 观察机体各部的微细结构时，首先要制成薄片，就是切片法，其中以石蜡切片（Paraffin section）最为常见。其制备程序大致如下： ①取材与固定：取材要尽量以人体材料为主，辅以动物材料。取得新鲜材料后，切成适当的小块1.0立方厘米大小）立即投入固定剂（fixative）中进行固定，使组织中蛋白质迅速凝固，防止组织自溶或腐败，以保持生活状态下的结构。常用的固定剂有甲醛、酒精、醋酸、苦味酸、饿酸等。 ②脱水（dehydtation）、透明（clearing）与包埋（embedding）:把固定好的材料用乙醇将组织内的水分脱掉，经二甲苯透明后，再浸入已融化的石蜡中进行浸透、包埋。 ③切片（section）与染色（staining）：用切片机（microtome）切成5～10μm的薄片，贴于载玻片上，脱蜡后进行染色，最常用的染色法是苏木精（hematoxylin,haematoxylin)和伊红（eosin）染色简称HE染色。配制后的苏木精染波呈碱性，可使细胞核内的染色质及细胞质内的核糖体等染成蓝紫色，称嗜碱性（basophilia)；伊红是酸性染料，可使多数细胞的细胞质染成粉红色，称嗜酸性（acidophilia）；耐碱性和酸性染液亲合力都不强的，称为中性（neutroPhilia）； ④封固（mounting）：切片经脱水、透明后，于切片上滴加中性树胶和盖片进行封固后，贴标签备用。 除HE染色外，还有多种染色方法。有的能特异性的显示细胞内某些结构，如使用雷锁辛品红 （resorcin-fuchsin)染液显示组织内的弹性纤维；有的细胞经重铬酸盐处理后，呈棕褐色，称嗜铬性（chromaffinity）；有的组织成分经硝酸银处理时，可使硝酸银还原，形成银微粒附着在组织中呈棕黑色，该特性称为亲银性（argentaffin）；有的组织结构成分，本身不能使硝酸银还原，需加还原剂方能使硝酸银还原，形成棕褐色很微粒附着在组织结构上，这种性质称为嗜银性（argyrophilia）；如肥大细胞中的颗粒经甲苯胺蓝（tofuidine blue）等碱性染料染色后,呈紫红色，这种现象称异染性(metachromasia），其原理可能是染料在溶液中以单体存在时呈蓝色，当它与颗粒中具有大量阴离子的多糖成分耦合后，聚合成多聚体而呈紫红色。 除石蜡切片外，在制作较大结构（如眼球、睾丸等）的切片时，常用火棉胶包埋法；骨和牙等坚硬的组织，可用弱酸（稀硝酸）脱钙后，用石蜡或火棉胶切片（celloidin section）法制成切片标本；还有，为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，可选用冷冻切片（frozen section），它是将组织先在低温下快速冻结，经直接切片后进行染色，或将组织块置入液氮（-196℃）内快速冷冻，用恒冷箱切片（cryostat section）后进行染色。
电镜切片样品制作步骤
扫描电镜样品的准备 A悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等； 细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量 2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。 B贴壁培养的细胞： 在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。 SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。 C组织取材 样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右； 样品表面在固定前必须清洁： 使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。 如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；固定 2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。 附： 2.5%戊二醛的配制
Step 1: 0.2M磷酸缓冲液的配制：--------------------- 磷酸二氢钠（NaH2PO 4.H2O） 2.6xx 磷酸氢二钠(Na2HPO 4.12H2O)29xx 双蒸馏水加至500毫升pH调至 7.4 Step 2: 戊二醛固定液的配制： --------------------- 25%戊二醛1ml 双蒸馏水4ml 0.2mol/L磷酸缓冲液5ml 戊二醛最终浓度 2.5% pH值 7.3-
徒手切片制作方法
、目的要求徒手切片法是观察植物内部结构的简易制片法。所需的仪器用具简单，药品经济，操作方便，费时较短，且易于保持材料的天然色泽和活体结构，必要时，也可经过脱水、染色制成永久制片而保存。但是徒手制片对于体积过小，质地太软或太硬的材料，则难于处理，同时，也不能制成连续切片，这些均为不足之处。 二、材料、用品 1、用品 显微镜、剃头刀（或刀片）、毛笔、镊子、培养皿、染色皿（或小酒杯）、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸。1%番红水溶液（或50%酒精溶液），0.5%固绿95%酒精溶液，70%、85%、95%酒精，纯酒精、二甲苯和中性树胶或加拿大树胶等。 三、方法与步骤 1、选材 所用材料不宜太软或太硬。一般植物幼嫩的根茎或一些植物的叶片、叶柄等均可使用此法。质地较薄的材料，如叶片，可沿主脉两侧切成宽约5?6毫米，长1?1.5厘米的小块，夹在夹持物（如胡萝卜根或马铃薯块茎等）中进行切片。使用夹持物时，先将夹持物的中央切成两半，然后将切好的材料夹入，合拢夹持物进行切片，也可将叶片卷成筒状再切。 2、切片 (1)盛清洁的水于培养皿中。然后用左手的拇指及食指、中指夹住材料，拇指的位置要低于食指，并使材料的上端伸出指外2?3毫米，材料的切面必须保持水平方向。
( 2) 右手执刀(剃头刀或刀片)，平放在左手食指之上，刀口向内，自左前方向右后方滑行切割，要用臂力，不要用腕力，不可向内平切。 (3) 拉切的速度宜快，一次切下，不要中途停顿或似拉锯式，以免损伤材料或切得不平。 (4) 切片过程中，如发现由于用力不均而使材料表面倾斜时，必须立即削平。 (5) 刀片或剃刀必须锋利，材料及切片均需经常沾水，以保持材料湿润、润滑。 (6) 切下的薄片可随时涮入培养皿的水中，以备观察;等切到相当数量后;再选择其中最薄的透明度最大的做成临时玻片观察。如想短期保存，可用水或甘油封藏。如希望长期保存所切的材料，则还要经过以下几个步骤做成永久玻片标本。 3、固定 挑选出符合要求的切片，用毛笔移入盛有70%酒精的染色皿中进行固定。固定时间为16 分钟或更长时间。 4、染色、脱水、透明 (1)用吸水管吸去70%酒精，染以1%番红( 50%酒精溶液)约30 分钟。 (2)再用吸管吸去番红，换用70%-85%-95%酒精进行冲洗、脱水，每级酒精3?5分钟。(3)复染色。吸去酒精，用 0.5%固绿(95%酒精溶液)进行复染色，时间为0.5 分钟。 (4)冲洗、脱水。用95%酒精冲洗1次，时间10秒。后移入纯酒精中脱水2?3 次，每次3?5 分钟。
组织切片制作步骤
如何做出一张合格的组织切片？ 一般要先取材→固定→透明→包埋→切片，最后进行染色组化等操作。本文着重叙述取材以后如何进行包埋和切片。 包埋可分为OCT包埋（冰冻切片）与石蜡包埋。 .冰冻切片对于组织的抗原性保留比较好，但是形态保留比较差，一般用来做原位杂交ISH，免疫荧光IF。冰冻切片较厚一般厚度8~15μm。冰冻包埋步骤较为简洁，固定之后，直接用镊子将样品放置到样品托上，挤压OCT完全包裹组织，放入冷冻机待OCT凝固即可。凝固后就可以直接切片。如果不能及时切片，用锡箔纸包装好，放入-80℃存放。 .石蜡切片，一般用来做HE染色或者免疫组织化学IHC。厚度更薄，一般为4um，工艺较为复杂并且制作样本的好坏取决于不同组织的种类和组成，更加依赖制作者的经验，需要在实验过程中不断优化才能得到最佳的实验条件。 下面是石蜡包埋和切片的具体步骤： 一、实验材料
动物组织，4%多聚甲醛（PFA），PBS，ddH2O，二甲苯，梯度乙醇，石蜡，石蜡包埋机。 二、实验步骤 1、取材：针对各组织部位规范化取新鲜组织，并用刀片单向切割成约3-4mm大小组织块，不要超过5mm。 2、固定：将切好的组织块放入4%多聚甲醛（PFA）中固定，以组织块与4%多聚甲醛体积比1：7为宜。PFA最好现用现配，一般在4度固定24~48h即可，固定时间因组织而异。冰冻切片可以直接用丙酮固定。其他固定液比如缓冲福尔马林PBS配的福尔马林含有K+和Na+，PH=7.4。 固定的原理是采用蛋白质凝固剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构、位置和除水以外的物质的过程。固定的目的是为了防止组织细胞自溶与腐败，防止细胞内的酶对蛋白质的分解作用，使细胞内的各种成分如蛋白质、脂肪、碳水化合物、酶类转变为不溶性物质，以保持原有的结构和生活时相仿。 关于固定液的选择可以参考这篇文章[1]。 3、洗去PFA：固定完毕后，流水冲洗3次，每次5分钟。 4、脱水透明：此步骤应根据不同组织设置合适时间，基本流程如下
徒手切片制作方法
一、目的要求徒手切片法是观察植物内部结构的简易制片法。所需的仪器用具简单，药品经济，操作方便，费时较短，且易于保持材料的天然色泽和活体结构，必要时，也可经过脱水、染色制成永久制片而保存。但是徒手制片对于体积过小，质地太软或太硬的材料，则难于处理，同时，也不能制成连续切片，这些均为不足之处。 二、材料、用品 1、用品 显微镜、剃头刀（或刀片）、毛笔、镊子、培养皿、染色皿（或小酒杯）、吸管、载玻片、盖玻片、吸水纸。1%番红水溶液（或50%酒精溶液），0.5%固绿95%酒精溶液，70%、85%、95%酒精，纯酒精、二甲苯和中性树胶或加拿大树胶等。 三、方法与步骤 1 、选材所用材料不宜太软或太硬。一般植物幼嫩的根茎或一些植物的叶片、叶柄等均可使用此法。质地较薄的材料，如叶片，可沿主脉两侧切成宽约5?6毫米，长1?1.5厘米的小块，夹在夹持物（如胡萝卜根或马铃薯块茎等）中进行切片。使用夹持物时，先将夹持物的中央切成两半，然后将切好的材料夹入，合拢夹持物进行切片，也可将叶片卷 成筒状再切
2 、切片 (1) 盛清洁的水于培养皿中。然后用左手的拇指及食指、中指夹住 材料，拇指的位置要低于食指，并使材料的上端伸出指外2?3毫米，材料的切面必须保持水平方向。 (2) 右手执刀( 剃头刀或刀片)，平放在左手食指之上，刀口向内， 自左前方向右后方滑行切割，要用臂力，不要用腕力，不可向内平切。 (3) 拉切的速度宜快，一次切下，不要中途停顿或似拉锯式，以免损 伤材料或切得不平。 (4) 切片过程中，如发现由于用力不均而使材料表面倾斜时，必须立即削平。 (5) 刀片或剃刀必须锋利，材料及切片均需经常沾水，以保持材料湿润、润滑。 (6) 切下的薄片可随时涮入培养皿的水中，以备观察; 等切到相当数量后; 再选择其中最薄的透明度最大的做成临时玻片观察。如想短期保存，可用水或甘油封藏。如希望长期保存所切的材料，则还要经过以下几个步骤做成永久玻片标本。 3、固定 挑选出符合要求的切片，用毛笔移入盛有70%酒精的染色皿中进行固定。固定时间为16 分钟或更长时间。 4、染色、脱水、透明
动物组织切片观察
光学显微镜的使用及动物组织切片观察 丁曦钰 141140015 一、实验目的 1、了解显微镜的工作原理，学习光学显微镜的使用。 2、基本组织切片的观察与记录。 3、实验报告的书写要求。 4、生物量级、生物系统及生物类别。 二、实验原理 1.光学显微镜的工作原理：标本经物镜和管镜放大后，形成倒立的实像： 实像经目镜再次放大后，形成放大的虚像。 2.光学显微镜的使用：先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转 动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。 聚光镜下的虹彩光圈应调到适当的大小，以控制射入光线的量，整理增加明暗差。 3.生物量级：残基（氨基酸，核苷酸，脂肪酸，甘油）→生物大分子→亚 细胞结构（subcellular structure）→细胞器→细胞→组织（器官）→系统→种群→群落→生态系统→生物圈 物理量级：基本粒子（夸克，轻子）→电子（自旋反平行）→质子→原子→分子（物体：生物量级）→天体→星系→星云→宇宙→宇宙膜 4.各胚层细胞发育走向 1）外胚层：神经系统（脑、脊髓、脊神经、自主神经、视网膜、耳、肾上腺髓质），表皮（毛发、汗腺、油脂腺、乳腺、晶体、口腔黏膜）2）中胚层：肌肉、骨骼、血液、真皮、心脏血管系统、泌尿生殖系统以及结缔组织（固有结缔组织、骨与软骨、血液） 3）胚层：消化系统、呼吸系统的上皮和有关腺体（胰，肝）、膀胱上皮 5．分辨力：能分辨最小间隔的能力，单位距离（人眼距目标物25cm处） R=Kλ nsin(a 2) K是透镜品质，光镜在0.61~1.0之间，λ光波波长或电子波长，n是光镜介质折射率，a是镜口角（样本对物镜的镜口角，一般<180度），sina/2<1。 三、动物与器材 1.实验材料：13组织标本 2.实验设备：光学显微镜（生物显微镜） 四、方法与步骤 1.实验分组 2.实验原理讲解 3.实验报告要求介绍 4.使用显微镜进行操作观察 1）安放显微镜
6徒手切片制作与观察.
徒手切片的制作与观察 徒手切片简介 徒手切片法是指手持刀片将新鲜的或固定的实验材料切成薄片的制作方法。徒手切片前,应先准备好一个盛有清水的培养皿。在切片时,用左手的拇指与食指、中指夹住实验材料,大拇指应低于食指 2~3mm ,以免被刀片割破。材料要伸出食指外约 2~3mm ,左手拿材料要松紧适度,右手平稳地拿住刀片并与材料成垂直。然后,在材料的切面上均匀地滴上清水,以保持材料湿润。将刀口向内对着材料,并使刀片与材料切口基本上保持平行,再用右手的臂力 (不要用手的腕力向自身方向拉切。此时, 左手的食指一侧应抵住刀片的下面, 使刀片始终平整。连续地切下数片后,将刀片放在培养皿的水中稍一晃动,切片即漂浮于水中。当切到一定数量后,可在培养皿内挑选透明的薄片用低倍镜观察检查。好的切片应该是薄且比较透明、组织结构完整,否则要重新进行切片。对经检查符合要求的切片,如果只作临时观察,可封藏在水中进行观察。若要更清楚地显示其组织和细胞结构, 可选择一些切片进一步通过固定、染色、脱水、透明及封藏等步骤,做成永久玻片标本。 徒手切片技巧 如果不想切斜,要注意两点,一个是左手拿的露出来那截要短,尽量只能连续切 2刀的样子 (一般是可以切 4, 5刀的, 一个是切口一定要水平,同时右手的刀片也要水平, 拉刀的时候保持在一个平面上 (拉快点容易做到。这是根和茎的切法,不过每次的量会有所减少。对于叶,有三种切法,一个是直接切;一个是卷成管状,当茎来切;还有就是用三层刀片夹起来。其中,第一种适合于裸子植物那种针叶,方法要领和上面说的差不多;第二种适合于比较软的叶片,要领是要卷的细, 中间的洞不要太大(大了容易斜; 第三种适用于比较坚韧, 硬的叶片, 绝对要放在载玻片之类的地方, 要用划的, 凌空切会很不顺, 容易切不断。还有一种特殊的方法是切成小块的先, 再夹到萝卜里面(事先挖个洞或切条槽,再一起切,这个适用于全部,根茎叶,软的硬的均可(就是那种针叶不太好用它,我都切不好。所以克服柔软就是要注意,想办法使它变厚变硬(对叶:卷,夹,或者垫玻璃;对根茎,夹,或者用左手捏紧一点,捏上面一点,使它不会晃。