MISEQ数据处理步骤

M I S E Q数据处理步骤 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）

1、下载Java：for64位。

2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。

Java-Xmx4g-jar..\\dist\注意：刚开始时输入“cd..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C盘。

手打指令，适用本机。

3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。

Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目

Phylum:门Kingdom:界Species:种

二、删除chloroplast（叶绿体）

1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；

2、找到后缀名为“”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel打开；

3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast （叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；

4、新建“”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；

5、打开程序“mothur”，输入：(accnos=,fasta=，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“。

三、多个样本时的序列深度归一化处理

1、经过步骤一、二处理后，以各样本的“*.”为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件；

2、用Excel打开“txt”文件，记录各个样本的“Totalreads”；以最小的“Totalreads”为基准，进行多个样本的序列深度归一化处理；

3、打开程序“mothur”，输入：

(fasta=式中，*即为最小的“Totalreads”数。

系统会自动生成一个新的fasta文件“。

4、以新的fasta文件为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件，对“txt”文件进行整理，进行后续分析。

四、热图

1、数据预处理：将原始相对丰度数据取自然对数（lg），对于丰度为0的物种，人为输入经自然对数处理后的下限值；

2、保存数据为CSV文件，拷贝至R文件夹“h:/Software/R/”；（注意数据呈现方式，是否需要转置）

注意：物种和实验组名称不得出现“—”和空格，以下划线“_”代替。

2、按教程操作（蓝白配图命令）。

pheatmap(hm[1:m,]),col=colorRampPalette(c("white","blue"))(n=100),=1,scale="ro w",key=TRUE,symkey=FALSE,="none",trace="none")

如果想颜色与取了自然对数（lg）后的数据相匹配，则将上面的命令中scale="none"，即可。