25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转解析

大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化

【目的】

1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。

2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。

【原理】

1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理

细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。

本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的 E.coli. DH-5α细胞 , 使 E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。

2. 转化大肠杆菌的筛选

由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的 E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。进一步将转化菌涂布在含 IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为 lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。由α- 互补而产生的 LacZ + 细菌在诱导剂 IPTG 的作用下，在生色底物 X-gal 存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源 DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α- 互补能力的氨基端片

段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。

图 23-1 质粒 pUC18 图谱

图 23-2 质粒 pUC18 酶切图谱

【器材】

? 高速温控离心机

? 超净工作台

? 恒温水浴箱

? 10ml 离心管、 1.5m 1EP 管

? 培养皿（φ 9cm ）

? 酒精灯

? 推子

? 摇床

? 可调微量移液器

? 10ml 试管、 100ml 三角瓶

? 恒温培养箱

? 0.45μm 、 0.22μm 滤膜

? 封口膜

【试剂】

1 ．E.coli. DH-5α菌种

2 ． pUC-18 质粒（ 0.5μg/μl ）

3 ． LB （ Luria-Bertani ）液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨（ bacto-tryptone ） 10g 、细菌培养用酵母抽提物（ bacto-yeast extract ） 5g 、NaCl 10g 、加去离子水至 800ml ，搅拌，使溶质完全溶解。用 5mol/L NaOH （约 0.2ml ）调节 pH 值至 7.

4 ，加去离子水至总体积为 1L ，以 1.034×10

5 Pa 高压蒸气灭菌 20 分钟。

4 ． LB 固体培养基

上述 LB 液体培养基中按 15g /L 加入细菌培养用琼脂（ bacto-agar ），以1.034×10 5 Pa 高压灭菌 20 分钟。溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中。

5 ． 0.1mol/L CaCl 2 溶液

用蒸馏水溶解 11 g 的 CaCl 2 ，定容至 1000 ml ， 1.034×10 5 Pa ，高压灭菌 20 分钟， -20℃ 保存。

6 ．氨苄青霉素（ Amp ）溶液

取未开封氨苄青霉素粉 0.5g ，加入灭菌蒸馏水 5m 1 ，配制成 100mg/ml 溶液，过滤除菌， -20℃ 分装保存。

7 ． IPTG （异丙基 -β-D- 硫代半乳糖苷）

取 1g IPTG 溶于 4ml 去离子水中，再用水补至 5ml ，用 0.22μm 滤膜过滤除菌，每份 1ml 分装后， -20℃ 保存。

8 ． X-gal （ 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-D- 半乳糖苷）

用二甲基甲酰胺溶解 X-gal 配制成 20mg/ml 的储存液，不需滤过除菌，保存于1.5mlEP 管中，用铝箔包裹贮存于 -20℃避光保存。

9 ．甘油 50ml

取 50ml 甘油， 121℃ ,30 分钟高温灭菌。

【操作】

1 ．感受态细胞的制备

灭菌操作步骤于超净工作台中进行，下同。

（ 1 ）用无菌小枪尖从E.coli. DH-5α LB 平板上挑单菌落，将此枪尖放于含5m 1 LB 液体培养基的试管中， 37℃， 200r/min 振荡过夜，第二天将此试管中的 5m 1 LB 培养基接种于含 100m 1 LB 液体培养基的三角瓶中， 37℃，300r/min 振荡培养 2 ～ 4h ，到 A 600 一般在 0.2~0.4 之间（约含 5×10 7 个细菌 / ml ），为对数生长期或对数生长前期。

（ 2 ）将培养物于冰上放置 10 分钟，然后转移入两个 50ml 离心管中，

4℃， 4000 r/min 离心 10 分钟，弃去上清，倒置离心管 1 分钟，流尽剩余液体，加入 10m 1 预冷的 CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细菌，置冰浴中 10 分钟；

（ 3 ）于 4℃， 4000 rpm 离心 10 分钟回收细胞，轻轻倒去上清，每 50ml 的原培养物再加入 2ml 冰冷的 CaCl 2 溶液，按 200μl 一管分装于 1.5m 1EP 管中 , 若不马上进行转化，该感受态细胞可以加入终浓度为 10% 的灭菌甘油，置于 -70℃冻存。

2 ．大肠杆菌质粒转化（热休克法）

（ 1 ）取一支感受态大肠杆菌加入 50μl 含 20ng pUC-18 的 TE 缓冲液，温和混匀，置冰上 30 分钟，此步骤操作时应设立两个对照组：

①取 50μl 含 20ng pUC-18 的 TE 缓冲液加入感受态细胞，做阳性对照（ A 组）；

②不加任何 DNA 的感受态细胞作阴性对照（ B 组），仅加入 50μlTE 缓冲液。

（ 2 ）转移到 42℃水浴中放置 90 秒，迅速放回冰中。

（ 3 ）将细胞冷却 1-2 分钟后，立即加入 0.8 m 1 LB 液体培养基，混匀，37℃保温 45 分钟。

3 ．转化大肠杆菌的筛选

（ 1 ） Amp 筛选

然后各取 50μl A 组、 B 组中的培养物分别用推子涂布于两块含 Amp

(100μg/ml 的 LB 平板中。另作一对照组，另各取 50μl A 组、 B 组中的培养

物用推子涂布于两块不含 Amp 的 LB 平板中。将上述平皿倒置放入 37℃恒温培养箱，培养过夜；第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。

（ 2 ）β- 半乳糖苷酶系统筛选

在预制好的 LB 琼脂平板（含 Amp 100μg/ml ）上，加上 40μl 20mg/ml 的 X-gal 和 4μl 200mg/ml 的 IPTG 溶液；用灭菌推子，将 X-gal 和 IPTG 溶液均匀涂布于琼脂凝胶表面， 37℃放置 3 小时，待溶液全部吸入琼脂表面，将取 A 组 50μl 细菌涂布于平板中，将平皿倒置放入 37℃恒温培养箱，培养过夜 , 第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。

【注意事项】

1 ．在实验过程中注意无菌（实验菌除外）操作。

2 ．必要的对照在实验过程中非常重要，不可不设。

【思考题】

1 ．为什么在热休克的情况下制备感受态细胞？

2 ．药物筛选法和蓝白斑筛选法（α- 互补）的原理各是什么？

3 ．氯化钙法和氯化镁法制备感受态细胞的优缺点各是什么？

附：氯化镁法

【试剂】

? 1×TSS 致敏缓冲液

? 10% PEG （ MW=4000 ）

? 5% DMSO （ 0.45μm 过滤）

? 50mmol/LMgCl 2

用 LB 培养基制备，调 pH 值至 6.5

【操作】

1 感受态细胞的制备及长期冻存

（一）E.coli. DH-5α菌株于 LB 培养基中生长至对数前期，然后转移入两个

50ml 离心管中，4℃ ， 4000 rpm 离心 10 分钟，弃去上清。

（二）用 5ml 的1×TSS 致敏缓冲液（冰预冷）悬浮细胞，然后分装成 0.1ml 一份速置冰上温和混匀， -70℃ 贮存。使用前，从 -70℃ 取出贮存的感受态细菌，冰上放置 5 分钟后即可。

2 转化细菌

（一） -70℃ 取出制备好的感受态细菌，冰上放置 5 分钟即可直接转化。

（二）每 0.1ml 感受态细胞加入 1μl ，混匀后冰上放置 30 分钟。

（三）加入 0.9mlLB 培养基, 37℃ 保温 45 分钟。

（四）取 200μl 用推子涂布于琼脂平板上， 20 分钟将平皿倒置放入37℃ 恒温培养箱，培养过夜 , 第二天观察各平皿上细菌生长情况，并作记录。