核黄素测定实验报告

核黄素测定实验报告

篇一：实验八荧光光光度法测定核黄素的含量

实验八荧光光度法测定核黄素的含量（见教材p118）

一. 实验目的

1. 了解荧光法测定核黄素的原理和方法；

2. 学习荧光光度计的操作和使用。

二. 实验原理

某些具有π-π电子共轭体系的分子易吸收某一波段的紫外光而被激发，如该物质具有较高的荧光效率，则会以荧光的形式释放出吸收的一部分能量而回到基态。建立在发生荧光现象基础上的分析方法，称为分子荧光分析法，而常把被测物称为荧光物质。在稀溶液中，荧光强度IF与入射光的强度I0、荧光量子效率?F以及荧光物质的浓度c等有关，可表示为IF=K?FI0εbc。式中为比例常数，与仪器的参数固定后，以最大激发波长的光为入射光，测定最大发射波长光的强度时，荧光强度IF与荧光物质的浓度c成正比。

核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二

氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。

OHHO

OHH3CHNOOHOHHOOHH3CH3C－2HH3CH二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：

核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，由还原前后的荧光差数可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。

注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。

三. 仪器与试剂

1. 实验试剂：核黄素标准品；冰醋酸；核黄素药片；连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠

2. 实验仪器：荧光光度计（F-2500型）天平（感量0.0001g）

3. 实验器材

普通试管：

容量瓶：

移液管：

烧杯：

滤纸： 25mL×9 100mL×1 10mL×1 5mL×1 1mL×1 50mL×1 9cm

研钵、漏斗、洗瓶、洗耳球、试管架、移液管架、玻棒：各1

四. 实验内容

1. 核黄素标准液（4×10-6g·mL-1）

准确称取核黄素4mg，加5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水定容至1000mL。转入棕色瓶中。

2. 样品液的制备

为了消除药片之间的差异，可取几片药片一起研磨，然后取部分有代表性的样品进行分析。

将5片核黄素药片称量后磨成粉末，然后从中准确称取1-2mg有代表性的样品，加0.5mL冰醋酸和适量蒸馏水，置水浴中避光加热直至溶解。冷却至室温，用蒸馏水定容至100mL（如果有沉淀，迅速通过定量滤纸干过滤，用该滤液在与标准溶液同样条件下测量核黄素的荧光强度）。转入棕

色瓶中。作样品待测液备用。

3. 绘制核黄素的激发光谱和荧光光谱

1）.固定激发波长λex（Excitation spectra）为440nm,在460-660nm处测定荧光强度，得溶液的发射光谱，在520nm 处得最大发射波长λem。

2）.再固定发射波长λem（emissionspectra）为520nm，测定激发波长λex为400-500nm处荧光强度，得溶液的激发光谱，在440nm处得最大激发波长λex。

4. 标准曲线制作及样品测定

取8支试管，按下表所示顺序操作。

注意：在测定中如果待测样品溶液的荧光强度超出100%，则需要再行稀释，并记录稀释倍数。

五. 结果处理

1. 从绘制的激发光谱和荧光光谱曲线上，确定它们的最大激发波长和最大发射波长。

2. 由1～6号管的数据，以核黄素含量(10-6g·mL-1)为横坐标，F值（F1-F2）为纵坐标，在坐标纸上绘制标准曲线；

—3. 求两个样品管F的平均值F；

—4. 由F从标准曲线中求样品管中核黄素的含量(10μg·mL-1)；

5. 计算药片中核黄素的含量（单位用g/g鲜重），并将测定值与说明书上的值比较。

六. 注意事项

1.在所有的操作过程中，避免核黄素受阳光直接照射。

2. 使用石英样品池时，应手持其棱角处，不能接触光面，用毕后，将其清洗干净。

3.影响荧光强度的因素很多，每次测定的条件很难完全控制一致，因此每次必须做工作曲线，且标准曲线最好与样品同时做。

F-2500分子荧光光度计操作规程

1 . 先打开仪器主机，打开电脑

2 . 点击桌面FL－Solutions

3 . 寻找激发波长：放入样品，寻找激发波长，点击Method ，出现对话框，点击General ，在Measurement 中选择wavelength scan ，点击Instrument ，在scan mode 中选择Excitation ，在 data mode 中只选 Fluorescence，在 EM WL中输入发射波长数值（520nm）。在EX start 中输

入激发起始波长(400nm)，在EX end WL 中输入激发终止波长(500nm)。点击确定即可得到荧光物质的激发光谱曲线。

4. 寻找发射波长：同上法。在scan mode 中选Emission。在 data mode 中只选 Fluorescence，在 EX WL 中输入激发波长数值（440nm）。在EM start 中输入发射起始波长(460nm)，在EM end WL 中输入发射终止波长(600nm)。点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。

5. 将样品放入，在scan mode 中选 Emission。在 data mode 中只选 Fluorescence，在 EX WL中输入激发波长数值（440nm）。在EM start 中输入发射起始波长(460nm)，在EM end WL 中输入发射终止波长(600nm)。点击确定即可得到荧光物质的发射光谱曲线。记录在520nm处的荧光值F1。加入10mg的连二硫酸钠或亚硫酸钠，混合溶解后，立即重新测定相对荧光强度F2

6. 在完成测量之后，关闭仪器按下列步骤执行。

（1）从文件菜单（F）中，选择退出（X）指令。

⊙close the monitor window , but keep lamp operating?

Ｏ close the lamp，then close the monitor window.

选择yes， FL Solutions 程序将终止。

（2）关闭光度计的电源开关。

（3）点击Windows98 的开始按钮，选择关机（U），在关机窗口对

话框中，选择“关机“OK”按钮。

（4）关闭计算机和显示器电源（在③步中，计算机能通过某些设

定来关闭）。

（5）关闭打印机。

注：1、关灯：使用以上指令来关闭氙灯，为了再次打开氙灯，必须重新启动光度计。

2、狭缝宽度一般为5 nm 或 10 nm ，如果改变狭缝宽度时先选定狭缝宽度，光栅自动关闭，自动调零。

篇二：作业4尿中核黄素的测定(荧光法)

运动营养学实验报告

姓名：________ 学号：_____ 日期：_

_______

备注：受试者姓名：性别：尿液是否稀释：否

课后思考题

1. 维生素B2的测试过程中有哪些注意事项？为什么？

答：1. 由于核黄素余光分解，整个操作应在避光实验室中进行。

2. 做内标准的目的是去除尿中可能存在的有荧光的物质。

3. 使用荧光剂时应用荧光红纳校正。

荧光红纳溶液的配制：溶解25.0mg荧光红钠于少量水中，搅拌使其溶解后加水至250ml，此为储备液。取0.25ml 加水稀释成250ml，此为工作液。

校正步骤：先选择所需激发波长和发射波长，校正仪器零点，然后用荧光红钠工作也校正荧光计，使指针在某一刻度，再测定样品的荧光强度。

2. 营养和运动对机体维生素B2的影响都有哪些？

答：机体对维生素B2的需求似乎同能量的消耗或肌肉活动有关。维生素B2缺乏主要发生在素食主义者身上。如果膳食里未含奶类食品或其他动物脂肪的话，那么机体就有可能缺少维生素B2。

维生素B2与机体的有氧代谢能力关系密切。运动会导致机体对维生素B2的需求量增加，尤其是生长发育期的儿

童少年、控体重、减体重以及素食或不吃动物蛋白的运动者，更要注意的是维生素B2的营养状况。核黄素主要存在于动物内脏中（如肝、肾、心等），牛奶及蛋类含核黄素也较多，坚果类食品（如核桃、栗子、松子、花生、瓜子等）含量也不错。若缺乏维生素B2，可适量补充以上食物。

3. 为何加入低亚硫酸钠？

答：核黄素可被低亚硫酸钠还原而失去荧光，故测定还原前后的荧光强度可去除干扰性荧光物质的影响。

篇三：核黄素

核黄素(维生素B2)荧光光度定量测定法摘要: 维生素B2又名核黄素(Riboflavin),是核醇与7,8-二甲基异咯嗪的缩合物。由于在异咯嗪的1位和5位N原子上具有两个活泼的双键，易起氧化反应，故维生素B2有氧化型和还原型两种形式，在生物体内氧化还原过程中起传递氢的作用。在体内核黄素是以黄素单核苷酸（flavin mononucleotide,FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸

（flavin adenine dinucleotide,FAD)形式存在，是生物体内一些还原氧化酶（黄素蛋白）的辅基，与蛋白部分结合很牢。由于FAD,FAN广泛参与体内各种氧化还原反应，因此维生素B2能促进糖，脂肪和蛋白质的代谢，对维持皮

肤，粘膜和视觉的正常机能均有一定的作用。本实验采用荧光光度定量测定法测量核黄素的含量.

关键词：核黄素荧光光度还原氧化酶黄素蛋白

Vitamin B2 and Riboflavin (Riboflavin), is the nuclear alcohol and 7, 8 - dimethyl luo oxazine condensation product. Due to the different luo oxazine 1 and 5 N atom has two lively double bond, easy oxidation reaction, so the vitamin B2 type oxidation and reduced in two forms, REDOX process in biological hydrogen transfer function. Riboflavin in the body is flavin mononucleotide (flavin mononucleotide, FMN) and flavin adenine dinucleotide (flavin adenine dinucleotide, FAD) form, are some reduction in biological oxidase (flavoprotein) prosthetic group, combined with protein part is very fast. Because the FAD, FAN widely participate in various REDOX reaction in the body, so vitamin B2 can promote sugar, fat and protein metabolism, to maintain the skin, mucous membrane and have certain effect to the normal function of vision. This experiment adopts the quantitative determination of fluorescent photometric method of measuring the

content of riboflavin.

1

前言

1.1核黄素的概述

维生素B2（化学式：C17H20N4O6，式量376.37）又叫核黄素，微溶于水，在中性或酸性溶液中加热是稳定的。为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用），当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等，故本品可用于上述疾病的防治。体内维生素B2的储存是很有限的，因此每天都要由饮食提供。维生素B2的两个性质是造成其损失的主要原因：

（1）可被光破坏；

（2）在碱溶液中加热可被破坏。

1.2 核黄素的生理功能

主要是与维生素B2分子中异咯嗪上1,5位N存在的活泼共轭双键有关，既可作氢供体，又可作氢递体。在人体内以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黄素单核苷酸（FMN）两种

形式参与氧化还原反应，起到递氢的作用，是机体中一些重要的氧化还原酶的辅基，如：琥珀酸脱氢酶、黄嘌呤氧化酶及NADH脱氢酶等。

2

主要参与的生化反应有呼吸链能量产生，氨基酸、脂类氧化，嘌呤碱转化为尿酸，芳香族化合物的羟化，蛋白质与某些激素的合成，铁的转运、储存及动员，参与叶酸、吡多醛、尼克酸的代谢等。

1、参与体内生物氧化与能量代谢，与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢有关，可提高肌体对蛋白质的利用率，促进生长发育，维护皮肤和细胞膜的完整性。具有保护皮肤毛囊粘膜及皮脂腺的功能。

2、参与细胞的生长代谢，是肌体组织代谢和修复的必须营养素，如强化肝功能、调节肾上腺素的分泌。

3、参与维生素B6和烟酸的代谢，是B族维生素协调作用的一个典范。FAD和FMN作为辅基参与色氨酸转化为尼克酸，维生素B6转化为磷酸吡哆醛的过程。

4、与机体铁的吸收、储存和动员有关。

5、还具有抗氧化活性，可能与黄素酶-谷胱甘肽还原酶有关。

1.3核黄素的吸收代谢

膳食中的大部分维生素B2是以黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅酶形式和蛋白质结合存在。进入胃后，在胃酸的作用下，与蛋白质分离，在上消化道转变为游离型维生素B2后，在小肠上部被吸收。当摄入量较大时，肝肾常有较高的浓度，但身体贮存维生素B2的能力有限，超过肾阈即通过泌尿系统，以游离形式排出体外，因此每日身体组织的需要必需由饮食供给。

3

1.4核黄素的作用机理

维生素B2的主要生理功用是作为辅酶促进代谢。核黄素和磷酸及一分子蛋白质结合成为黄色酶。这一类酶又叫脱氢酶，重要的是要非常介导的氢原子转移对糖、脂和氨基酸的代谢都很重要。它是许多动物和微生物生长的必需因素。

维生素B2与特定的蛋白质结合生成黄酶。黄酶在物质代谢中起传递氢的作用，参与组织的呼吸过程。

2 实验部分

2.1 实验目的

了解荧光法测定核黄素的原理和方法,学习荧光光度计

的操作和使用掌握荧光定量分析工作曲线法。

2.2 实验原理

核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，其水及酒精的中性溶液为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸或强碱中易破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：

核黄素的激发光波长范围约为440-500nm（一般定为460nm），发射光波长范围约为510-550nm（一般定为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比可进行定量分析。

4

2.3 实验材料

核黄素片（5mg/片）、蛋黄粉、大豆。

930型荧光光度计。

容量瓶100ml（×2）。

试管1.5cm×15cm（×7）。

吸管10.0 ml（×1），5.0 ml（×1），2.0 ml（×1），0.50 ml（×2）。量筒 1000 ml（×1），100 ml（×1）。

2.4实验试剂

核黄素标准溶液：准确称取核黄素10mg，放入预先装有约50ml蒸馏水的1000ml容量瓶中，加入5ml 6mol/L醋酸，再加入大约800ml水，置水浴中避光加热直至溶解，冷却直至室温，用蒸馏水再定溶至1000ml，混匀。连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠。

36%醋酸。

2.5操作

标准曲线绘制

将配好的10μg/ml标准核黄素溶液，按表1所示比例稀释成6个标准溶液。样品溶液的配制

将被测的样品（如核黄素药片，维生素B2针剂等）参照标准溶液的含量范围和溶剂体系配制成测定溶液。对于食物和生物材料中的核黄素测定，一定需要事先经过抽提，或经过分离，纯化处理。

荧光测定

参照荧光光度计的使用说明，选用滤光片，核黄素荧光测定的激发光波长为460nm，发射光波长为520nm。因此可选用带通型400nm（蓝色）滤光片为激发光滤光片，选用截

止型510nm（红色）滤光片为发射光滤光片。待仪器预热并调好零点后，用0号标准溶液（2.5μg/ml）作为参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度（100%），分别测定其他标准溶液和样品溶液的相对荧光强度，在测定中如果样品溶液的荧光强度超出100%则需要再行稀释，在每一个测定溶液测定完后，需要重新倒回到相应的试管内。

表1 核黄素的测定——标准曲线绘制

管号 0 1

试剂

2 3 4 5 5