5种提取三七基因组+DNA+方法的比较

植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)

植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。

三七总皂苷的现代提取方法研究进展汇总

三七总皂苷的现代提取方法研究进展 【摘要】在近期学者研究的基础上，本文综述了三七中总皂苷类成分的提取方法，分别阐述了超声法、酶法、加速溶剂法、超临界流体萃取法、湿式超微粉碎法等的优缺点，供科学研究参考。 【关键词】三七总皂甙；提取方法；研究进展 三七是五加科人参属植物三七((Panax notoginseng F.H.chen)的块根，《本草纲目》载：三七主“止血、散血、定痛、金刃箭伤、跌扑杖疮出血……诸病”。主要有三七素、三七总皂苷、黄酮、挥发油、氨基酸、糖类等有效成份，现代药理学表明三七总皂苷（PNS）具有止血活血、补血、改善脑血流功能、保护脑神经、增强免疫力、抗炎、镇痛、抗肝纤维化、改善肾脏功能等作用[1]。 三七皂苷主要成分是人参皂苷，因此三七皂苷提取方法与人参皂苷的提取方法相类似。比较传统的方法就是溶剂提取法，包括浸渍法、煎煮法、渗漉法、回流提取法，但操作都很费时间、溶剂。现代提取方法，如微波、超声波及超临界提取等，提取速度快，得率高，但要实现工业化，目前的生产成本还较高。本文就近期三七总皂苷现代提取方法的研究进行综述，供科学研究参考。 1 超声波提取 温度是影响提取结果的主要因素，超声提取可以在较低的温度下提取出有效成分，避免高温破坏有效成分。该法常用乙醇为提取溶剂，省时，省溶剂，提出杂质少。马妮等[2] 研究超声提取方法对三七中皂苷的提取率的影响，超声法提取三七皂苷能显著提高提取效率，采用超声提取30min~1h可以代替常规浸泡36h处理的方法。 2 酶法提取 三七药材含有大量的淀粉多糖，传统的水提醇沉法在水煎煮过程中容易糊化，难于滤过，醇沉后由于沉淀的吸附作用，皂苷损失较大，提取率低；渗漉法虽然提取率较高，但溶剂消耗过大，提取周期较长[3]。而酶法以水为提取溶剂，提取活性高，专一性强，条件温和，不污染环境，对药效成分的保存率、提取率高等优点。常用纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶等，纤维素酶能水解结构致密的植物细胞壁[4]，有利于胞内三七皂苷等有效成分的溶出，果胶酶能将三七药材中大量的淀粉、蛋白质等不溶物水解，从而增加提取物得率，而α-淀粉酶可以迅速水解淀粉。李元波等[5] 研究复合酶法提取三七总皂苷，发现双酶（纤维素酶、果胶酶）联合作用对皂苷含量和提取物得率都优于回流法、渗漉法及单一酶法。另外，水提pH对含量和得率影响较大，宋宏新等[6]采用模拟人体消化道pH环境分次提取，取得了较好的效果。 3 加速溶剂提取法 加速溶剂提取技术即加压溶剂提取技术是近年来发展起来的一种新的样品提取技术，不仅耗时短，提取效率高，重现性好，而且操作过程自动化，并且实现与多种定量定性检测手段联用[7,8]。其主要原理是通过升高压力使提取溶剂的沸点升高，使得提取过程可以在高于正常溶剂沸点的温度下进行。但温度并不是越高越好，尤其对于热敏性成分，更应该严格控制加热温度。加速溶剂提取法常用甲醇为提取溶剂，提取时间大为缩短，方便样品的后处理。 4 超临界流体萃取

三七生产工艺规程

XXXXXXX有限公司生产工艺规程 1目的：建立三七生产工艺规程，用于指导现场生产。 2 范围：三七生产过程。 3 职责：生产部、生产车间、质保部。 4 制定依据：《药品生产质量管理规范》（2010修订版） 《中国药典》2020年版。 5 产品概述 5.1 产品基本信息 5.1.1产品名称：三七 5.1.2规格：统 5.1.3性状：表面灰褐色或灰黄色，有断续的纵皱纹和支根痕。顶端有茎痕，周围有瘤状突起。体重，质坚实，断面灰绿色、黄绿色或灰白色，木部微呈放射状排列。气微，味苦回甜。筋条呈圆柱形或圆锥形，长2～6cm，上端直径约0.8cm,下端直径约0.3cm。剪口呈不规则的皱缩块状或条状，表面有数个明显的茎痕及环纹，断面中心灰绿色或白色，边缘深绿色或灰色。 5.1.4企业内部代码： 5.1 5性味与归经：甘、微苦，温。归肝、胃经。 5.1.6功能与主治：散瘀止血，消肿定痛。用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。 5.1.7用法与用量：3～9g；研粉吞服，一次1～3g。外用适量。 5.1.8贮藏：置阴凉干燥处，防蛀。

5.1.9包装规格：3g/袋；5g/袋；10g/袋；100g/罐；160g/罐；200g/罐；0.5kg/袋；1kg/袋；10kg/袋；15kg/袋；18kg/袋；20kg/袋；25kg/袋；30kg/袋；50kg/袋。 5.1.10贮存期限：36个月 5.2 生产批量：5-10000kg 5.3 辅料：无 5.4 生产环境：一般生产区 6 工艺流程图： 6.1 三七生产工艺流程图 6.2生产操作过程与工艺条件： 6.2.1领料 6.2.1.1饮片车间根据批准的批生产指令，按照“生产过程物料管理程序”，凭填写品名、编码、领料量、数量的指令单到原料库领取三七原料。 6.2.1.2领料过程中必须核对原料品名、编码、件数、数量、合格标志等内容。 6.2.2净制： 6.2.2.1取原料，置于不锈钢挑选台上，按照《净制岗位标准操作规程》手

基因组DNA提取方法

1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。

三七的药理作用及其临床应用研究

三七的药理作用及其临床应用研究 发表时间：2012-08-22T17:32:06.653Z 来源：《中外健康文摘》2012年第21期作者：钟晓凤[导读] 因此，三七不仅能够抑制中枢神经系统，而且能兴奋中枢神经系统，所以双重调节作用明显。 钟晓凤（河南省三门峡市中医院药剂科 472000） 【中图分类号】R285【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2012）21-0416-02 【摘要】目的讨论三七的药理作用及临床应用。方法对三七的化学成分进行分析，总结三七的药理作用及其在化学成分在临床的应用效果。结果三七能够对中枢神经系统、循环系统、消化系统、泌尿系统、生殖系统以及免疫系统等系统产生影响，还具有抗衰老、抗肿瘤和抗炎的作用。结论作为一种天然的植物药，三七及其提取物药用作用广泛，副作用少，是一味值得重视和开发的中药。【关键词】三七药理作用临床应用 三七，别称田七，是中国特有的一种五加科类名贵中药材，传统医学对该药的研究较多。近代药理学研究表明：三七含有三七皂甙类、黄酮、三七索、氨基酸、挥发油、植物箱醇、糖类、无机盐和无机离子等多种活性成分，具有广泛药理作用及临床用途。本研究总结三七的药理作用及其在化学成分在临床的应用效果，现总结报道如下： 1 对中枢神经系统的作用 三七所含人参三醇皂苷Rg1类成分能够兴奋大闹中枢，促进脑部血液循环，活动脑部组织，增强大闹记忆及抗脑部疲劳的作用。Rbl具有抑制中枢神经系统，具有镇静安神和催眠的作用。临床实验证明：三七能强化水合氯醛和戊巴比妥钠的催眠作用，增强氯丙嗪的安定作用。马氏报道[1]：三七总皂苷能对抗L-谷氨酸介导的神经毒性，改善神经细胞缺氧状态，保护皮层神经细胞，从而降低细胞损害。另外，马氏报道：三七总皂苷不仅能阻断细胞外Ca2 内流，而且能抑制内源性Ca2释放，还可用于脑梗死的治疗。因此，三七不仅能够抑制中枢神经系统，而且能兴奋中枢神经系统，所以双重调节作用明显。 2 对循环系统的作用 临床对三七在循环系统的作用研究和报道较多，尤其在心血管系统疾病的治疗方面的应用更为广泛。 2.1 对心脏的作用 三七总皂苷能改善急性胰腺炎的心肌缺血状态。三七总皂苷单体Rbl能够阻滞钙通道，起到抑制心肌收缩力的作用。陈氏研究表明[2]：三七能够直接扩张冠状动脉血管，增加冠状动脉血流量，从而达到治疗冠心病、心绞痛的目的，作用机理可能与改善心肌缺氧状态有关。三七注射液能显著提高心肌细胞内肌浆网膜上钙泵的活性，从而减少心肌细胞Ca2＋，使左心室心肌重量减轻。三七总皂甙是一种肌浆网膜钙泵活性激动剂，早期高血压心肌细胞的可塑性大，适当运用三七总皂甙将会对改变心衰病程有深远意义。 2.2 对血管的作用 三七皂苷降低血压和扩张血管作用明显，其作用机理可能与钙通道阻滞，影响细胞Ca2+ 运动有直接关系。另外，三七能够增加冠状动脉血流量，降低心肌耗氧量的作用，其提取液能明显引起麻醉，迅速而持久下降血压，同时对心率影响不大。低浓度三七提取液对蛙下支血管具有收缩的作用，而高浓度时，扩张作用短暂且明显，可能与血管壁的直接作用有关。三七醇提取物能兴奋离体蛙心，降压作用显著而持久。 2.3 降血脂作用 三七皂苷能抑制低浓度高脂血清对体外培养血管平滑肌细胞的作用，因此，对于防治动脉粥样硬化的发生及发展具有一定的临床意义。 3 对消化系统的作用 高氏研究显示[3]：三七浸出液能增加血液中的凝血酶，使凝血酶原时间缩短，通过收缩局部血管的作用，达到治疗上消化道出血的目的。三七注射液降低GTP浓度，改善异常的血浆蛋白，预防肝细胞坏死，因此，可用于治疗急慢性肝炎。裴氏研究表明[4]：三七总苷注射液2ml，加入10％葡萄糖50ml静滴，qd，在治疗小儿腹泻方面具有良好的疗效。 4 对泌尿系统的作用 苏氏报道[5]：三七粉合并知柏地黄丸治疗前后尿道及其所属腺体的慢性化脓性感染临床疗效显著。 5 对生殖系统的作用 动物实验证明：一定剂量的三七能增加实验小鼠的睾丸重量，增强正常男性的性欲，因此，临床可用于治疗男性性功能减退等疾病，对治疗女性子宫脱垂的疗效也很好。 6 对免疫系统的作用 三七能提高NK细胞的活性，增强红细胞免疫功能，从而强化机体的免疫能力。三七能使过低或过高的免疫反应恢复，因此具有免疫调节作用，同时不干扰正常的免疫反应。周氏等[6]报道：三七总皂甙具有提高大鼠的特异性和非特异性细胞的免疫功能。 7 抗衰老、抗肿瘤、抗炎等作用 三七茎叶中含有大量的水溶性多糖等，可能具有抗衰老作用。临床试验显示[7]：三七二醇苷能延长果蝇的平均寿命，又能延长最低寿命和最高寿命，能提高果蝇及老龄小鼠的交配率，还具有提高小鼠心脑组织的SOD活性，因此具有抗衰老作用。临床上三七经配伍可用于多种恶性肿瘤的治疗，民间有将三七粉用于治疗食管癌的方法。三七总皂苷的抗炎作用可能与升高Neu内cAMP从而抑制氧自由基生成、减轻脂质过氧化损伤有密切关系。另外，三七还可用于治疗蜂蜇伤，治疗某些皮肤病和治疗再生障碍性贫血的作用。 综上所述，作为一种天然的植物药，三七及其提取物药用作用广泛，副作用少，是一味值得重视和开发的中药。参考文献 [1]马丽焱，肖培根．三七总皂苷对脑细胞内游离钙浓度的影响[J]．中国药学杂志，1998，33(8)：467. [2]陈晓丽，狄群英．三七冠心宁片治疗冠心病心绞痛110分析[J]．中医药学刊，2003，21(5)：778. [3]高瑞琴．三七胶囊治疗高脂血症的临床应用[J]．现代医药卫生，2001，17(9)：733. [4]裴淑丽，董建成．三七总苷注射液佐治婴幼儿腹泻82例疗效[J]．儿科药学，2002，8(2)：40.

三七提取方法

2方法与结果[ 2～4] 2. 1超声提取法正交试验、验证和提取方法 超声波提取方法称取三七粗粉20 g ,经正交选择,用75%的乙醇超声提取3次,每次2 h 。提取后回收乙醇,剩余提取液用蒸馏水稀释,使提取液中乙醇含量不超过0. 5%,再用中空纤维膜过滤器进行超滤,获取2 000分子量以下的超滤液( 三七皂苷的分子量在2 000以下) ,浓缩,上D 101大孔吸附树脂柱,用水洗至流出液无色,改用75%的乙醇洗脱,收集75%的乙醇洗脱液[ 6, 7] ,减压浓缩,真空干燥得三七总提取物( 测总皂苷、人参皂苷Rb 1、Rg 1 的含量) 水煎煮方法称取三七粗粉20 g ,选择煎煮时间、用水倍量、煎煮次数三因素,应用L 9( 33) 正交试验表实施方案,优选出最佳提取工艺: 10倍量的水煎煮2次,每次1 h 。水提取液用中空纤维膜过滤器进行超滤,以下按2. 1. 3项获取2 000分子量以下的超滤液开始同法操作。 乙醇回流提取方法称取三七粗粉20 g ,选择回流时间、乙醇浓度、回流提取次数三因素,应用L 9 ( 33) 正交试验表实施方案,优选出最佳提取工艺: 75%的乙醇回流提取2次,每次1 h 。提取后回收乙醇,剩余提取液用蒸馏水稀释,使乙醇含量不超过0. 5%, 再用中空纤维膜过滤器进行超滤,以下按2. 1. 3项获取2 000分子量以下的超滤液开始同法操作。 提取工艺的得率比较 用上述三种提取方法, 即水煎煮法、乙醇回流法、超声提取法三法的最佳工艺提取。 三七有效成分不同提取方法结果比较 提取方法三七总皂苷提取率(%)占总皂苷含量(%) 人参皂苷Rg 1 人参皂苷Rb 1权重值 水煎煮法83. 29 10. 74 44. 12 88. 3 乙醇回流法80. 07 14. 08 55. 18 89. 47 超声提取法101. 12 16. 43 59. 59 97. 24 3含量测定3. 1三七总皂苷的含量测定3. 1. 1对照品溶液的制备精密称取三七总皂苷对照品5 mg ,用无水乙醇定容至50 mL容量瓶中, 做对照品溶液。3. 1. 2供试品溶液的制备[9] 称取样品适量,用无水乙醇定容在10 mL容量瓶中,用0. 45 μm滤膜过滤,弃去初滤液,选择续滤液。3. 1. 3线性关系考察精密称取对照品溶液0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、2. 0、4. 0 μL ,分别注入具塞试管中,去塞,水浴蒸去乙醇,每只试管分别精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液0. 2 mL , 高氯酸0. 8 mL ,摇匀,置60 ℃水浴中加热15 mi n , 取出,用冷水迅速冷却,加冰醋酸溶液5 mL ,摇匀, 在560 nm处测吸收度A,以吸收度A为纵坐标(Y) ,浓度C为横坐标(X) ,绘制标准曲线,得回归方程, Y=0. 013 66X+0. 007 4, r=0. 999 0, 结果表明,三七总皂苷在3. 3 ～66. 67 μg /mL内线性关系良好。3. 1. 4稳定性试验取供试品溶液0. 1 mL ,按3. 1. 3项中从加5%香草醛冰醋酸比色法显色后操作,在560 n m 处每隔一段时间测定吸收度 A ,在显色10 mi n后A趋于稳定,时间约为1 h内无变化,因此采用5%香草醛冰醋酸比色法显色,测定时间应在 1 h内完成。结果: 1 h内稳定,与文献报道一致。3. 1. 5回收率试验取已知总皂苷含量的样品9 份,精密称定,分别准确加入1. 2、1. 5、1. 8 mL对照品溶液( 0. 585 mg /mL) ,照3. 1. 3项下方法作加样回收试验, 分别测定其含量, 得平均回收率为99. 18%, RS D=0. 92%。3. 2人参皂苷Rg 1 的测定 3. 2. 1色谱条件色谱柱:Ag i l e n tT c -C 18 ( 5 μm , 4. 6 mm×250 mm); 检测器为紫外检测器; 流动

植物基因组DNA提取

植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。

5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。

三七粉灭菌工艺参数确认方案

确认方案目录 一、概述 二、验证目的 三、验证依据 四、验证条件 五、验证适用范围 六、验证内容 七、验证项目实施计划书 八、偏差情况及纠正预防措施 九、变更情况及处理 十、验证结果总结评价 十一、再验证

中药药粉灭菌（黄芩药粉）参数 确认方案 一、概述： 根据2014年12月19日GMP现场检查缺陷整改要求，在灭菌柜的安装确认、运行确认、性能确认都已经经过确认合格的情况下，由于灭菌柜灭菌（三七粉）生产的需要，公司特对三七粉灭菌参数进行确认。 二、确认目的 按规定的灭菌柜灭菌（三七粉）参数进行确认，从而保证在正常的灭菌工艺参数的生产条件下，生产出质量合格、均一、稳定的三七粉 三、确认依据： 1、《药品生产质量管理规范(2010年修订) 》及附录； 2、《中国药典》2010版一部； 3、《GMP2010年版质量系统实施指南》---热力灭菌（只适用于灭菌）第150 页； 4、灭菌柜操作规程及三七粉生产工艺规程； 四、验证条件 1、前期验证都已完成，如厂房设施、设备验证，公用系统都已完成验证并且合格； 2、计量器具已进行检定并在有效期内；仪器仪表校验已经验证合格； 3、检验设备、方法验证已完成并且合格； 4、各种批准的生产工艺文件都已具备，如经审批的工艺规程、批生产记录，生产岗位标准操作规程等； 5、验证小组人员已培训合格； 五、确认适用范围： 适用于灭菌柜灭菌（三七粉）参数的确认。 六、确认内容 （一）灭菌柜描述 1灭菌柜安装位置：饮片车间；灭菌柜编号：FYLYY-06-01-03-01 2灭菌盘编号：该灭菌柜有两个灭菌车，每个车有12层，每层有2个盘，每车有24个灭菌盘，将灭菌车编号为1号车、2号车，按内外顺序从上到下分别编号(1号车外1内2，2号车外3内4），1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11、1-12、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、2-11、2-12、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、

基因组DNA提取步骤

基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，

基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转

三七的现代功用研究概况

三七的现代功用研究概况 【摘要】三七是一种名贵的中草药，具有散瘀止血，消肿止痛的作用，在现代临床上也被用于治疗心脑血管，神经系统等方面的疾病，其主要活性成分为三七总皂苷。本文主要通过现代功效对三七的研究进行概述。 【关键词】三七；三七总皂苷；现代功效 三七又名山漆、金不换、田三七、田七等，为五加科植物三七（Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen）的干燥根，主产于云南，在广西、湖北、江西、四川、贵州等地也有栽培。但黄氏[1]等经考证发现，三七的原产地是广西并非云南。这点在开化府志160多年的《本草纲目》、《本草纲目拾遗》、《本草从新》和1956年版的《中国药学大辞典》中均有提到。 三七主要用于活血化瘀、消肿止痛、滋补强壮，是古时治疗跌打损伤和金疮的要药。近年来随着对三七功效和作用的深入研究，作为三七主要活性物质的三七总皂苷已被用于心脑血管、神经系统等多疾病在现代治疗中。本文就三七鉴别及临床应用等方面作进一步的探讨。 1 三七现代功效研究 三七自古以来具有散瘀止血、消肿定痛的功效[2]，在现代三七也被广泛应用于血液系统、心脑血管系统、神经中枢系统、免疫系统等方面的疾病治疗中。 三七主要成分为三七总皂苷、三七素、黄酮、挥发油和糖类等。在现代研究中已将三七的药理活性广泛应用于血液系统、心脑血管系统、神经中枢系统、免疫系统、抗肿瘤、抗衰老等方面。相信对三七成分和药理作用的不断深入，三七的临床应用也将越来越深入。 1.1 对血液系统的影响 止血作用：三七能明显缩短出血和凝血时间，具有良好的止血功效。临床实验表明，用参三七注射液、三七粉治疗胃溃疡十二指肠球部溃疡出血及慢性胃炎等消化道出血，治愈率在92.0%以上[3]。三七也常被加在牙膏里用于治牙龈出血。 补血作用：三七能促进各类血细胞分裂生长和增殖，具有显著的造血功能。三七总皂苷（PNS）诱导造血细胞GATA-1和GATA-2转录调控蛋白质合成增加，并增高其余上游调控区的启动子和增强子结合的活性，调控与造血细胞增殖和分化相关的基因表达上凋[4]。 抗血栓作用：三七总皂苷能抑制血小板聚集，使cAMP含量明显增加，同时抑制5-HT的释放，抗凝血酶、促进纤维蛋白的溶解[5]。三七的另一成分——三醇苷类，有明显抑制花生四烯酸、胶原、二磷酸腺苷诱导的血小板聚集，研究发现，血小板Ca2+浓度随着三七三醇皂苷剂量的增加显著减少，抑制血小板血栓素A2释放等作用[5]。 1.2 对心脑血管系统的影响 对脑缺血的保护作用：王玉华[6]等通过连续7个月对180例脑缺血后遗症患者给予三七总皂苷注射液治疗，并与常规丹参注射液治疗进行对照，得出三七总皂苷可延缓缺血期间细胞内高能磷酸化合物的分解，改善缺血引起的脑能量耗竭，有明显的脑保护作用。 对心肌细胞的作用：李志泉[7]等人通过研究发现无论从分化细胞的形态、免疫组化，还是细胞特征性表达，都表明骨髓MSCs在体外诱导剂PNS作用下已向心肌样细胞转化，具有心肌细胞的特性，为推动应用骨髓MSCs治疗心肌梗

三七片生产工艺规程

1．主题内容： 本工艺规程规定了三七片生产全过程的工艺技术参数、质量，物耗、安全，工艺卫生等内容，检验合格符合GMP规范要求，本工艺规程具有技术法规作用。 2．适用范围： 本工艺规程适用于三七片工艺规程，是各部门共同遵循的技术准则。 3．引用标准：中国药典2010版一部 4．责任者：生产负责人、质量负责人、车间主任、岗位操作人员、QA。内容： 5．1．产品概述 5．1．1产品名称及剂型 通用名：三七片汉语拼音：Sanqi pian 剂型：片剂 5．1．2．性状：本品为灰黄色或棕黄色的片；味苦而微甜。 5．1．3．功能与主治：散瘀止血，消肿定痛。用于咯血，吐血，衄血，便血，崩漏，外伤出血，胸腹刺痛，跌扑肿痛。 5．1．4．用法与用量口服，一次2-6片，一日3次。 5．1．5．注意：孕妇忌服。 5．1．6．规格：每片含三七粉0.5克 5．1．7．包装：铝塑12片/板×2板/盒×300盒/箱 5．1．7．贮藏密封。 5．1．8．有效期：36个月 5．2．处方和依据 5．2．1 5．2．2．处方依据：中国药典2010版一部 5．2．3．【批准文号】国药准字。

5 . 2 . 4 . 辅料用量 5．3．工艺流程图 物料 工序检验 中间站

注： 为 D级洁净区为一般生产区 5．4．工艺过程及操作条件 5．4．1．原材料的整理炮制 5．4．1．1．炮制依据：中华人民共和国药典2010年版一部药材炮制通则。5．4．1．2．炮制方法及操作过程 5．4．1．2．1．三七：拣选除去杂质，洗净，干燥。 5．4．2．制剂操作过程及工艺条件 5．4．2．1．称量按批生产指令准确称量物料，称量结果二人复核，并有QA监督投料（称量后将剩余物料及时退库，不得在车间停留）。 5．4．2．2．粉碎：取称量好的三七原料，全部粉碎成细粉，过100目筛。 5．4．2．3．混合制软材：称量药粉、辅料，在混合机中搅拌30分钟，制成适宜软材。5．4．2．4．制湿粒：取上述软材送入颗粒机中用16目尼龙筛网制粒过14-16目筛。5．4．2．5．干燥：将湿粒用沸腾干燥器干燥。 5．4．2．6．整粒：将干燥后颗粒置整粒机中，通过14目不锈钢筛网，整理出大小均一的颗粒。 5．4．2．7．总混：将一个批次的颗粒加入混合机中，加入0.5-1%硬脂酸镁混合30分钟。混合后的颗粒存放于洁净、已消毒的双层塑料袋中，贴好标签，扎紧袋口，送入中 转室，质检员取样，取样后要贴上取样证，操作人员挂上“待验”标牌，经检验 合格后换成“合格品”标牌，方可进入下一工序。 5．4．2．8．以上操作完成后，操作工应按照有关SOP文件要求对设备及操作间等进行彻底清场，并填写清场工作记录，残料集中存放，统一处理。 5．4．2．9．压片： 5．4．2．9．1 操作工应按照要求安装φ=11.0mm浅圆模具。颗粒经检验合格后压片，调整好片重调节器，根据片芯的外观厚薄调节压力。压片时先检查外观，重量差

动物基因组DNA的提取

动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)

9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液

三七粉生产工艺规程

2范围：本标准适用三七粉生产工艺执行。 3职责：车间主管、工艺监督员、岗位操作工、质量监督员。 4 内容: 4.1 引用标准和文件 《中华人民共和国药典》（2010年版） 《药品生产质量管理规范》（2010年版） 《三七粉质量标准》 （企业标准） 4.2 产品基本信息 取三七饮片，干燥，粉碎成细粉，混匀，分装，即得。 4.4 批量：每料300kg ，每批1料，合计2400kg 药材。

4.5 工艺流程图（后附） 4.6详细的生产步骤和工艺参数说明 4.6.1 在每个工序开始前，按生产前准备工作程序进行相关项目检查。 4.6.2破碎处理： 破碎处理：调节碰碎机间隙至合适范围，将净药材置碰碎机中进行破碎。 4.6.3称量配料 投料规格：符合《中华人民共和国药典》（2010年版）标准项下规定的净饮片。 4.6.4低温真空干燥： 蒸汽压力控制在0.05-0.2 Mpa，真空度控制在0.06-0.09Mpa，干燥温度控制在60-70 ℃。干燥至水分＜5%。 4.6.5粉碎 将干燥好的物料投入粉碎机组中进行粉碎,过120目筛。 4.6.6混合 将粉碎后的细粉经混合机充分混合均匀,混合时间为50 分钟。 4.6.7包装 内包装：双层PVC袋包装，每袋重10~16kg，两层包装袋分别贴好标签，标签内容应当包含品名、批号、重量等信息；内包装过程中取样送检，入库待检。 中包装：铝箔袋包装，贴标签，标签内容同内包装标签要求。 外包装：瓦楞纸箱包装，贴标签，标签内容应当包含品名、批号、规格、净重、原料产地、生产日期、贮存条件等信息，每箱装1包，每箱10~16kg。 4.6.8全程收率85-95%。以上生产过程中产生的质量偏离的中间产品、废品、工序残留物、不合格物料等按照相应规定处理。

三七粉成品检验标准操作规程

三七粉成品检验操作规程 目的：建立一个三七粉成品检验操作程序，以规范操作过程，确保检验结果准确可靠。 责任人：文件制订人及所有相关人员。 标准来源：《中华人民共和国药典》2010年版一部、《河南省中药饮片炮制规范》、《江苏省中药饮片炮制规范》等。 内容： 三七粉检验操作规程 1、性状 取本品适量，放入白瓷盘中，用眼观察，可见以下性状特征： 为灰白色或灰黄色粉末，气微，微苦回甜。 2、鉴别 仪器：电子分析天平、电子显微镜、紫外光灯等。 2.1显微鉴别： 2.1.1 试液配制 2.1.1.1 水合氯醛试液：取水合氯醛50克，加水15毫升与甘油10毫升使溶解，即得。 2.1.1.2 甘油醋酸试液：取甘油、醋酸及水各等份混匀，即得。 2.1.1.3 稀甘油：取甘油33毫升，加水稀释至100毫升，再加樟脑一小块或液化苯酚1滴，即得。 2.1.2 供试品制备 2.1.2.1 取本品10g，研细后取少量粉末，置载玻片上，滴加水合氯醛搅拌均

匀，置酒精灯上加热透化；加稀甘油数滴，搅拌均匀，分装2～3片，加盖玻片，即得。 2.1.2.2 取研细的粉末少量置载玻片上，加甘油醋酸试液，搅拌均匀，加盖玻片，即得。 2.1.2.3取研细后取少量粉末，置载玻片上，滴加水搅拌均匀，同时滴加少许稀甘油，加盖玻片，即得。 2.1.3 置显微镜下观察 本品粉末灰黄色。淀粉粒甚多，单粒圆形、半圆形或圆多角形，直径4～30μm；复粒由2～10余分粒组成。树脂道碎片含黄色分泌物。梯纹导管、网纹导管及螺纹导管直径15～55μm，草酸钙簇晶少见，直径50～80μm。 2.2 薄层鉴别 取本品粉末0.5g，加水5滴，搅匀，再加以水饱和的正丁醇5ml ，密塞，振摇约10分钟，放置2小时，离心，取上清液，加3倍量以正丁醇饱和的水，摇匀，放置使分层（必要时离心），取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解， 作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb 1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rg 1 对照品及三七皂苷R 1 对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15：40：22：10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸溶液（1→10），于105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，显相同的荧光斑点。 3、检查 仪器：电子分析天平、电热恒温干燥箱等。 3.1水分取供试品2-5g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中厚度不超过 5mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，按下式计算即得。 W2－W3 供试品中的含水量（%）＝────────×100％

三七渗漉提取工艺的研究汇总

三七渗漉提取工艺的研究(1) 作者：谭朝阳,尤昭玲,袁宏佳 【摘要】目的优选三七的最佳渗漉提取工艺。方法采用正交试验法,以三七总皂苷和三七总氨基酸为考察指标,对影响三七渗漉提取工艺的因素进行研究。结果乙醇浓度、乙醇用量、渗漉速度均对三七提取工艺有显著影响。结论三七的最佳渗漉提取工艺为用12倍量50%乙醇,渗漉速度为1～3 mL/(min·kg)。 【关键词】正交试验；三七；提取工艺；三七总皂苷；三七素· Abstract：Objective To optimize the conditions for the percolation extraction process of Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen. Methods Conditions for the percolation were studied by orthogonal experimental design as guided by the contents of total notoginseng saponin and total amino acids. Results The percolate rate, concentration and quantity of alcohol had significant effects on the process. Conclusion The optimum condition for the extraction of Panax notoginseng was adding 12 times amount of 50% alcohol and percolating at a rate of 1～3 mL/(min·kg). Key words：orthogonal experiment；Panax Notoginseng (Burk.) F.H.Chen；extraction process；notoginseng saponin；dencichine 三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属植物,药用主要取其根,具有散瘀止血、消肿定痛的功效。有关三七的提取研究方法报道较多,但多以三七皂苷为考察指标,而对其止血活性成分三七素未涉及。本试验以三七总皂苷及含三七素的总氨基酸为考察指标,对三七渗漉提取工艺进行研究,为三七有效成分的提取及最佳工艺条件的优选提供依据。 1 仪器与试药 TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。三七皂苷Rg1对照品由中国药品生物制品检定所提供(供含量测定用,批号703-200201)；三 七购自湖南三湘饮片实业有限公司。所用试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 三七总皂苷测定方法 2.1.1 标准曲线的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品适量,加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。精密量取对照品溶液10、20、40、60、80、