实验大鼠常见脏器形态学取材方法和注意事项
实验大鼠常见脏器形态学取材方法和注意事项
[取材内容]
大鼠肺组织、大鼠肝脏组织、大鼠胰腺组织、大鼠胃部组织、大鼠空场回肠组织、大鼠肾组织、门静脉血、淋巴组织、大鼠心脏。
[试剂及药品]
戊巴比妥钠或10%水合氯醛、75%酒精、生理盐水、多聚甲醛或福尔马林液、3戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4戊二醛、肝素钠、器械液器械清洗消毒液
[器材]
备皮刀、解剖台、弯盘、组织剪、眼科剪、手术刀柄、刀片、小号弯式血管钳、蚊式血管钳、眼科镊、无损伤血管夹、聚乙烯管、三通管、丝线、培养皿、天平、一次性离2ml、1.5ml 、冻存管、肝素锂真空采血管、微量移液器、高速离心机、注射器10ml、5ml、
2ml、无菌手套、冰箱、冰盒、液氮罐
[取材动物]
大鼠
[取材步骤]
1. 取材前夜禁食，自由饮水。
2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。
3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。
4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。
5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门。
6.门静脉血采集：将剪成斜口的聚乙烯管尖端背向肝门方向插入门静脉，抽取门静脉血2ml，无创血管夹夹闭门静脉止血。将抽取门静脉血加入一次性离心管低温静置过夜，4℃离心，3000-3500/min，10分钟，吸出上清液，分装，-80摄氏度保存备用。
7.肝脏取材：结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3
块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
8.胰腺取材：把胃与脾之间的薄膜除去，可见到在其下方有如树枝状的肉色组织分为左、右两叶，钝锐结合整体取下胰腺组织及脾脏组织，结扎止血。胰腺放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。①切取胰腺体部约1mm×1mm×1mm 组织3块。3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；2.胰腺体部相邻部位组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③其余组织全部液氮冰冻保存备用。生理盐水冲洗操作器械。
9.脾脏取材：剔除脾周组织，放置脾脏于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。①从脾脏一端切取5×5mm脾组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；②继续切取脾约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；③其余组织液氮冰冻保存备用。
10.心脏取材：从剑突继续向上剪开皮肤自颌下，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露胸廓及颈浅肌层。沿正中剪开胸廓、胸膜，避免损伤胸腺的胸腔脏器。暴露心脏，找到主动脉弓，夹住主动脉，剪断动脉，①从心脏一端切取5×5mm 脾组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；②继续切取心脏约1mm×1mm×1mm 组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；
③其余组织液氮冰冻保存备用。
11.淋巴组织取材：展开肠系膜，于肠系膜根部寻找淡蓝色结节样淋巴结组织，剔取肠系膜淋巴结数枚，放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。①取部分淋巴结组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；②其余组织放置于无菌冻存管，液氮冰冻保存备用。上端于贲门上端结扎食管，下端于直肠远端结扎直肠末端钝锐结合完整取下胃肠道。
12.胃组织取材：离断胃放置于无菌培养皿残端结扎。①沿胃大弯剖开，生理盐水洗涤，切取约1mm×1mm×1mm胃窦和胃体黏膜组织各3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；②剪取宽约0.5-1.0cm包含胃窦、胃体组织1条，浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③其余胃组织放置于无菌冻存管，液氮冰冻保存备用。
13.空回肠取材：①treitz韧带10cm处切取空肠10cm距回盲部10cm处切取回肠10cm，生理盐水洗涤，距切取约1mm×1mm×1mm空肠和回肠黏膜组织各3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；②剪取宽约0.5-1.0cm包含全层的空肠和回肠组织各1条，做标记，浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③其余空肠和回肠组织全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
14.肾脏取材：于腹膜外腰部脊柱两侧寻找到肾脏，表面光滑、背腹略扁呈蚕豆形。剪开后腹膜，结扎剪断双侧肾门，钝锐结合，取下双侧肾脏，剔除肾周筋膜
组织，放置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。①于中间肾门部横行切开左侧肾脏，切取上端肾脏1mm×1mm×1mm组织3块。3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；②下端脾脏浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右侧肾脏放置于无菌冻存管，液氮冰冻保存备用。
15.肺组织取材：整体取下大鼠肺组织，剪开分离双侧肺脏置于盛有无菌生理盐水的培养皿中涮洗去血迹。①切取左肺1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；②余左肺浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定，冻存管，液氮冰冻保存备用。
16.各取样标本细致编号登记。
17. 大鼠废弃尸体处理。
[注意事项]
1. 戊巴比妥钠，配成1%生理盐水溶液，平均每只大鼠用量1
2.6mg，1.2ml左右。
2. 大鼠腹腔注射可以大鼠腹腔注射的给药容积一般为5-10ml/kg。
3. 完整取下胃肠道后已将肠系膜撕碎,不易寻找肠系膜淋巴结,所以先取淋巴结。取下胃肠道,由专人操作,取胃肠道及胃肠道取下后取材的操作器械单用一套。
4.取材时三人同时操作取一只大鼠,结合取材方案,多脏器并行取材缩短取材时间。
1、解剖后应迅速将脏器称重，以免水分蒸发造成差异。
2、脏器称重前应尽量将周围脂肪组织和结缔组织剔除，并用滤纸吸去脏器
表面血液及体液，特别是肾上腺、甲状腺、前列腺等较小的器官，更要新鲜称重，防止器官干燥失水而重量减轻。
3、空腔器官称重前，应清除其腔内液体，如心脏应除去血块。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。
敲除小鼠常见问题与回答
敲除小鼠常见问题与回答 一、什么是ES细胞显微注射？ 答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。 二、嵌合体 遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合 状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。 三、条件性敲除的原理？ 答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。 四、如何鉴定和挑选嵌合体？ 答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。
初中物理实验工具基本用法注意事项
初中物理实验工具基本用法注意事项 一、刻度尺 测量前： 1.找出它的零刻度线; 2.观察它的测量范围; 3.认清它的最小分度值． 测量时： 1.使零刻度线对准被测物体的一端且使刻度线靠近被测物体，如果零刻度线磨损了，应从其他刻度线量起； 2.读数时视线要正对刻度线 3.记录时既要记录准确值，又要记录估计值，数值后面必须注明单位． 二、量筒 测量前： 观察它的测量范围． 测量时： 1.往量筒里倒人适量的液体，读出液体的体积V1; 2.将待测物体浸没在量筒的液体内； 3．读出量筒内放人固体后液面的读数为V2； 4．固体的体积为V2 –V1； 5．观察读数时，视线要与液面的凹面（或凸面）相平． 三、弹簧测力计 测量前： 1.校零，使指针对准零刻度线; 2.明确弹簧测力计的测量范围和最小分度值． 测量时： 要使弹簧测力计内的弹簧伸长方向与所测力的方向在一条直线上． 四、天平 测量前： 1.将天平放在水平工作台面上作水平调节； 2.横梁平衡调节，包括（1）将游码移至横梁标尺左端零刻度线上；(2)调节横梁螺母，使指针对准标尺中央． 测量时： 1.把被测物体放在左盘，用镊子向右盘里增减砝码，配合调节游码，使天平横梁恢复平衡； 2.被测物体质量等于右盘内砝码总质量加上游码在标尺上标示的质量值．
五、温度计 测量前： 1.观察它的量程，估计被测物体温度，选择适当量程的温度计; 2.认清它的最小分度值． 测量时： 1.温度计的玻璃泡要与被测物体充分接触，不能碰及容器底或容器壁； 2.待示数稳定后再读数； 3.读数时，温度计不能离开被测物体，视线要与温度计液面齐平． 六、电流表 测量前： 1.观察电流表的两个量程； 2.对不同的量程，要认清刻度盘上的最小分度值； 3.校零，使指针对准零刻度线． 测量时： 1.电流表必须串联在被测的那部分电路中，使电流从电流表的“＋”接线柱流入，从“一”接线柱流出； 2．通过电流表的电流不允许超过它的量程； 3．禁止不经过用电器，将电流表的两个接线柱直接连到电源的两极上． 七、电压表 测量前： 1.观察电流表的两个量程； 2.对不同的量程，认清刻度盘上的最小分度值； 3.校零，使指针对准零刻度线． 测量时: 1.电压表必须并联在被测的那部分电路中，使电流从电压表的“＋”接线柱流入，从“一”接线柱流出； 2.所测电压不得超过电压表的量程． 八、变阻器 测量前: 1.观察变阻器铭牌上标注的变阻器最大电阻值（即变阻的范围）； 2.注意允许通过的最大电流． 测量时： 1．使用时先将变阻器的电阻调到最大值； 2．连接时注意一上一下，将整个线圈连入电路中
实验报告-大鼠
姓名：薛桂凤学号： 实验报告（二） 一、实验目的： 1.掌握大鼠的抓取和固定。 2.掌握大鼠的编号与标记方法。 3.掌握大鼠的常用实验方法。 4.掌握大鼠的常用麻醉方法。 5.掌握大鼠的安死术。 6.掌握大鼠的釆血方法。 7.了解小鼠的采尿、粪的方法。 8.了解小鼠各种脏器标本的采集方法。 二、实验器材：SD大鼠、电子称、手套、实验托盘、固定板、烧杯、注射器（3支）、 剪刀、镊子、灌胃针头、毛细管、酒精棉球、5%水合氯醛、生理盐水 三、实验内容 1.抓取：两种方法。第一种方法：右手食指和中指夹住大鼠颈部，使其头部固定，右 手拇指及无名指分别在大鼠前爪下抓住大鼠身体。第二种方法类似单手抓取小鼠的 方法，用右手拇指及其余四指并捏住大鼠颈部背部皮肤。 2.称重：小鼠放在烧杯中称重（去除烧杯重量），记录小鼠体重210g。 3.鉴别大鼠性别：观察生殖器雄性大鼠的阴囊非常明显。 4.编号：染色法：逆毛方向涂上有色斑点，顺序由左到右，由上向下，用两种颜色 可标记99只动物。 5.给药： （1）皮下注射小于1ml/100g（俯卧固定，左手拇指和食指捏住皮肤提起，右手持针沿纵轴方向刺入皮肤，阻力消失后回抽无血注入药物，拔针）（2）皮内注射小于（麻醉后进行，先备皮）（俯卧固定，与皮肤平行刺入捏起的皮肤，阻力大，注射药物局部有皮丘后停留片刻后拔针） （3）腹腔注射（仰面固定，在腹正中线两侧腹股沟平行的位置30-45°进针，挑起皮肤和肌肉，回抽无血，注药） （4）灌胃1-2ml/100g （大鼠固定身体呈一条直线，灌胃针头顺着上颚插入咽部，先少量注药证明未入气管后继续给药） 6.釆血：尾尖釆血法、眼眶静脉丛釆血法、心脏釆血法(麻醉后) 。 7.大鼠的采尿、粪的方法 （1）少量采集：在抓取固定时受到刺激排出少量尿液和粪便 （2）长期大量采集：使用代谢笼 8.麻醉：根据大鼠体重计算麻醉药物用量5%水合氯醛按300mg/kg，给药，计算药 量为，ip 麻醉小鼠，观察小鼠麻醉期。 (1)全身麻醉的第一期（随意兴奋期）：出现运动和运动失调；35秒 (2)全身麻醉的第二期（不随意兴奋期）：是由意识完全丧失至深而规则的自动 呼吸开始时止;2分30秒 (3)全身麻醉的第三期：角膜反射由迟钝渐趋消失，翻正反射消失，疼痛反射 消失； 9.安死术：颈椎脱臼法：用左手按住动物的头部于实验台上，右手抓住尾根部，快速、 不间断地向后、略向上使劲拉，以致脊椎脱臼，脊髓与脑干断离而死亡。 10.解剖：观察大鼠的脏器解剖结构
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
以前做冰冻切片
冰冻切片与漂片免疫组化 以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下. 1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的 2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做 3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作. 4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤) 5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等. 蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦 我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。 取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～ 防止脑袋冻碎办法： 先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。 脑片切好后保存方法： 1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。 2、37度干燥箱中烘干。 3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。 切忌经常打开盒子。
初中物理实验列表及注意事项
初中物理学生实验 八上实验 1、长度和时间的测量。器材：刻度尺、停表。 2、测量平均速度。器材：斜面、小车、金属片、刻度尺、停表。 3、用温度计测量水温。器材：烧杯、温度计、水 4、探究固体熔化时温度的变化规律。器材：铁架台、石棉网、烧杯、试管、温度计、停表、海波、 石蜡、酒精灯、火机。 5、探究水沸腾时温度变化的特点。器材：铁架台、石棉网、烧杯、盖板、温度计、停表、水、酒精 灯、火机。 6、探究光反射时的规律。器材：光的反射规律实验仪、激光、白纸。 7、探究平面镜成像的特点。器材：玻璃板、蜡烛、白纸。 8、探究凸透镜成像的规律。器材：光具座、蜡烛、凸透镜、光屏。 9、用天平测量物体质量。器材：天平、砝码、烧杯。 10、探究同种物质的质量与体积的关系。器材：天平、量筒、砝码。 11、测量盐水和小石块的密度。器材：量筒、天平、砝码、小烧杯、盐水、石块。 八下实验 1、练习使用弹簧测力计。器材：弹簧测力计。 2、探究重力的大小跟质量的关系。器材：弹簧测力计、钩码（或天平）。 3、探究二力平衡的条件。器材：小车、砝码、细线、托盘。 4、测量滑动摩擦力。器材：木板、木块、弹簧测力计。 5、研究影响滑动摩擦力大小的因素。器材：木板、木块、弹簧测力计、砝码、毛巾。 6、探究影响压力作用效果的因素。器材：小桌、海绵、砝码。 7、探究浮力的大小跟哪些因素有关。器材：弹簧测力计、物块、透明盛液筒、水、盐。 8、探究浮力的大小跟排开液体所受重力的关系。器材：弹簧测力计、溢水杯、小桶、物块、水。 9、探究物体的动能跟哪些因素有关。器材：斜面、钢球、木块。 10、探究杠杆的平衡条件。器材：杠杆、钩码、刻度尺、铁架台。 11、研究定滑轮和动滑轮的特点。器材：滑轮、弹簧测力计、铁架台、细绳、钩码。 12、测量滑轮组的机械效率。器材：滑轮、弹簧测力计、铁架台、细绳、钩码、刻度尺。 九年级实验 1、比较不同物质吸热的情况。器材：量热器、温度计、水、食用油。 2、连接串联电路和并联电路。器材：电源、导线、灯泡、开关。 3、练习使用电流表。器材：电源、导线、灯泡、开关、电流表。 4、探究串、并联电路的电流规律。器材：电源、导线、灯泡、开关、电流表。 5、练习使用电压表。器材：电源、导线、灯泡、开关、电压表。 6、探究串并联电路的电压规律。器材：电源、导线、灯泡、开关、电压表。 7、探究影响导体电阻大小的因素。器材：电源、导线、开关、电流表、导线板。 8、练习使用滑动变阻器。器材：电源、导线、开关、电流表、灯泡、滑动变阻器。 9、探究电流与电压、电阻的关系。器材：电源、导线、开关、电流表、电压表、定值电阻、滑动变 阻器。 10、伏安法测电阻。器材：电源、导线、开关、电流表、电压表、定值电阻、滑动变阻器。 11、测量小灯泡的电功率。器材：电源、导线、开关、电流表、电压表、灯泡、滑动变阻器。 12、研究磁场的方向。器材：条形磁铁、小磁针。 13、探究通电螺线管外部的磁场分布。器材：通电螺线管、铁棒、小磁针、电源、开关、导线。
实验大鼠取材方案
实验大鼠取材方案 [取材内容] 1.取大鼠静脉血，分离血浆、血清，-80℃保存。 2.取大鼠门静脉血，分离血清，-80℃保存。 3.取大鼠甲状腺组织，制备甲状腺电镜观察标本，其余组织液氮冰冻保存备用。 4.取大鼠胸腺组织，制备胸腺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织液氮冰冻 保存备用。 5.取大鼠肺组织，制备肺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液氮冰冻 保存备用。 6.取大鼠肝脏组织，制备肝脏组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液氮 冰冻保存备用。 7.取大鼠胰腺组织，制备胰腺组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液氮 冰冻保存备用。 8.取大鼠肠系膜淋巴结组织，制备肠系膜淋巴结免疫组化观察标本，其余组织液氮冰冻保 存。 9.取大鼠胃部组织，制备胃粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装液 氮冰冻保存备用。 10.取大鼠空肠组织，制备肠道粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装 液氮冰冻保存备用。 11.取大鼠回肠组织，制备肠道粘膜组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，其余组织分装 液氮冰冻保存备用。 12.取大鼠肾组织，制备左肾组织电镜观察标本、免疫组化观察标本，右肾组织液氮冰冻保 存备用。 13.取大鼠肾上腺组织，左侧制备肾上腺组织免疫组化观察标本，右侧肾上腺液氮冰冻保存 备用。 14.取大鼠睾丸组织，左侧制备电镜观察标本、免疫组化观察标本，右侧睾丸液氮冰冻保存 备有。 [试剂及药品] 戊巴比妥钠或10%水合氯醛、75%酒精、生理盐水、多聚甲醛或福尔马林液、3％戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4％戊二醛、肝素钠、器械液（器械清洗消毒液） [器材] 备皮刀、解剖台、弯盘、组织剪、眼科剪、手术刀柄、刀片、小号弯式血管钳、蚊式血管钳、眼科镊、无损伤血管夹、聚乙烯管、三通管、丝线、培养皿、天平、一次性离心管（5ml、
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
大鼠肾脏冰冻切片的体会
大鼠肾脏冰冻切片的体会 发表时间：2016-03-01T14:17:27.000Z 来源：《中国综合临床》2015年9月供稿作者：张丽娥[导读] 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 张丽娥 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００ 【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B 【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１ ０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１． ３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片. ２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果. ３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT 的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成. ３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒. 总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 参考文献[１] 陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２] 范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３] 吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．
课件医实动学实验(大鼠、小鼠)
实验三大、小鼠的基本操作技术 [实验目的]：通过大鼠、小鼠的抓取固定、性别辨认、灌胃、注射、采血、麻醉、标记、安乐死、动物剖检、脏器摘除与检查等实际操作，掌握大、小鼠动物实验的基本操作技术。 [实验动物]：大鼠、小鼠 [材料与器材]：大、小鼠饲养盒（带面罩）、大鼠和小鼠手术固定台，常规手术器械、大鼠灌胃针、小鼠灌胃针、lml注射器、5ml注射器、l0ml注射器、烧杯、75％酒精及酒精棉，干棉球。生理盐水、20％乌拉坦溶液（或3％戊巴比妥钠）、乙醚、新洁尔灭、3—5％苦味酸溶液、0.5％中性红或品红溶液、 [实验内容]： 一、实验动物标记编号的方法一染色法 （一）被毛染色法 1、单色涂染法；（3—5％苦味酸溶液，可染成黄色）。 2、双色涂染法：苦味酸（黄色）—为个位数；品红（红色）—为十位数．（二）耳缘打孔法：适于做长期实验用。、 （三）刺数钳烙印法：适用于长期或慢性实验的大动物编号。 （四）号牌法：用于大动物实验。 二、实验动物被毛的去除方法 （一）剪毛法；（二）拔毛法；（三）剃毛法；（四）脱毛法； 三、大鼠、小鼠性别的鉴定 方法步骤： 1、将动物抓取后，腹部朝上，观察肛门与生殖器之间的距离，距离近的为雌性，距离远的为雄性， 2、成年雌性大小鼠有12个乳头。 3、天热时或性成熟后，雄性动物的睾丸一般会从腹腔降至阴囊内，此时易于区别。 四、大鼠、小鼠的抓取和固定 （一）小鼠的抓取固定： [实验器材]：小鼠饲养盒(带面罩)1套，小鼠防护手套若干。 [方法步骤]： 1、用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部将小鼠提起，放在饲养盒面罩上。
2、用左手拇指和食指迅速、准确地捏住小鼠的两耳后、颈背部的皮肤，将 小鼠提起。 3、翻转左手掌，以左手掌心和中指夹小鼠背部的皮肤，使小鼠整个呈一条 直线。 4、用左手无名指压住小鼠背部的皮肤，小指压住小鼠的尾巴根部。 5、松开捏住小鼠尾巴的右手拇指和食指。 [注意事项]： 1、在抓取动物时，禁止对动物采取突然、粗暴的方法。 2、抓取时注意，过分用力，会使动物窒息或颈椎脱臼，用力过小，动物头 部能反转过来咬伤实验者的手，必须熟练掌握。 （二）大鼠的抓取固定： 大鼠抓取固定的方法有徒手固定、固定板固定、固定器固定、卵圆钳固定和使用立体定位仪进行头部固定等方法。徒手固定法常用于体重小的大鼠灌胃、腹腔注射、肌肉注射和皮下注射等操作。需尾静脉取血时，将大鼠固定在特定的固定器中固定。在进行外科手术或解剖时，须用固定板固定。徒手固定的方法如下：[实验器材]：大鼠饲养盒和面罩1套，大鼠防护手套（帆布或硬皮质手套）。 [方法步骤]： (1) 首先戴好防护手套。 (2) 用右手拇指和食指抓住大鼠尾巴中部将大鼠提起，放在大鼠饲养盒的 面罩上，轻轻向后拉尾。 (3) 左手迅速顺势按、卡在大鼠躯干背部，稍加压力向头颈部滑行。 (4) 以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈部皮肤，其余3指和手掌 握住大鼠背部皮肤，置于掌心，完成抓取固定。 (5) 较大体形的大鼠用单手不容易固定，可用右手固定其后肢和尾部，请 助手协助进行实验操作。 {注意事项}： (1)大鼠牙齿尖锐，性情较烈，在抓取时一定要特别注意，初学者应戴上防 护手套以防咬伤。 (2)抓取时，注意不能捉提大鼠尾尖，因为尾尖易于拉脱，也不能让大鼠悬 在空中时间过长，否则会激怒大鼠翻转咬人。 五、大、小鼠的给药方法： (一) 小鼠经口灌胃给药 原理：将药液直接注入小鼠的胃内。 器材：小鼠灌胃针1支、注射器1支、小鼠饲养盒(带面罩)1套、生理盐水、烧杯。 方法步骤： 1、将灌胃针连接在注射器上，吸入一定量的药液。 2、操作前，大致测量从口腔到胃的距离，估计出灌胃针头插入的深度。 3、左手固定小鼠，使小鼠头部向上。 3、右手将灌胃针从小鼠口角处进针放进小鼠口咽部，顺咽后壁轻轻往下推，灌胃针会顺着食管滑入小鼠的胃内，灌胃针插入约2—3cm。 4、用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的药液灌入小鼠的胃中。
大鼠注射
孕期暴露于LPS 对子代大鼠肾脏结构和功能的影响 LPS 是革兰氏阴性细菌细胞壁的脂多糖，常用来作为炎症免疫刺激剂模仿非特异性炎症反应。LPS 和它的受体TLR4 结合后启动一系列的磷酸化过程，促进转录因子NF-κB 进入细胞核。 在孕期暴露于LPS的模型中，孕鼠(SD大鼠)被随机分成四个组(每组8只)：对照组、 LPS组、PDTC组和LPS+PDTC组。其中LPS组动物于孕第8、10、12天给予腹腔注射LPS 0.79mg/kg，LPS+PDTC组动物在给予LPS的基础上，在孕第8~14天每天给予腹腔注射PDTC 100 mg/kg。对照组和PDTC组大鼠分别于相应时间给予生理盐水或PDTC。 动物分组：SD 成年雌雄大鼠按4:1 合笼交配，室温(24±1)℃环境下喂养。分别于合笼次日7:00 做雌鼠阴道检查，有阴道栓或阴道涂片精子呈阳性者定为妊娠0天。 孕鼠随机分为4 组，每组8 只。 对照组：在孕第8~14 天腹腔注射生理盐水0.5 ml。 LPS 组：在孕第8、10、12 天每天腹腔注射LPS 0.79 mg/kg，第9、11、13、14 天腹腔注射生理盐水。 LPS+PDTC 组：在孕第8、10、12 天每天腹腔注射LPS 0.79 mg/kg，第8~14 天 每天腹腔注射PDTC 100 mg/kg，PDTC 注射在LPS 注射后立即进行。 PDTC 组：第8~14 天每天腹腔注射PDTC 100 mg/kg。 给药时间：分别在孕期8、10、12 天上午8：00~9：00 进行腹腔注射，注射后轻揉腹部片刻，以防药液漏出 PDTC Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate 吡咯烷二硫代氨基甲酸 1．LPS 注射液配置 用生理盐水将LPS 配制成1mg/ml 的浓度，放置4℃冰箱保存备用。
冰冻切片步骤 很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
关于冰冻切片的若干问题
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 1.做冰冻切片用的固定后样品能在蔗糖溶液放多久？ 问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！ 2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些 2、关于冰冻切片的问题(冰冻切片,免疫荧光,蔗糖,脱水) 问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小
不等的圆形洞洞,不知道是什么原因. 答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够 的. 从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔. 2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。 3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好.
医学实验动物学 比较各种动物在实验中的优缺点
比较各种动物在实验中的优缺点 一般来说，动物所处的进化阶段愈高，其功能、结构、反应也愈接近人类，如猩猩、猕猴、狒狒等非人灵长类动物是最类似于人类的。他们是胚胎学、病理学、解剖学、生理学、免疫学、牙科学和放射医学研究的理想动物。我国南方和印度生产的猕猴有很多特性与人相似，可用于细菌、病毒和寄生虫病的研究。例如脊髓灰质炎、麻疹、疱疹病毒感染、弓形虫病、阿米巴脑膜炎、南美锥虫病、间日疟和恶性疟，以及自发性类风湿因子，奴卡氏菌病、病毒性肝炎等，对痢疾杆菌和结核分枝杆菌也较敏感。猕猴的生殖生理非常近似于人，月经周期也是28天，可用于生殖生理、计划生育及避孕药研究。但实际中，非人灵长类动物属稀有动物，来源很少，又需特殊饲养，选择有很大困难。另一方面，也并非只有非人灵长类动物与人具有相似性。许多哺乳类实验动物在某些功能、代谢、结构及疾病特点方面也与人类近似。可从如下几方面来比较各种动物在实验中的优缺点以及其应用的实验： 1. 组织结构 哺乳动物之间，有许多组织结构上的相似点，因而其生命功能基本过程也很相似。如猪的皮肤组织结构与人类相似，其上皮再生、皮下脂肪层、烧伤后的内分泌及代谢等也类似人类，故选用小型猪做烧伤实验研究较为理想。 2. 系统功能 许多动物各系统的功能与人类是相似的，如犬具有发达的血液循环和神经系统，在毒理方面的反应和人类也比较接近，适于做实验外科学、营养学、药理学、毒理学、行为学等方面的研究。两栖类的蛙和蟾蜍，大脑很不发达，当然不能用于高级神经活动的研究，但在做简单的反射弧实验时，则很合适，因为最简单的反射中枢位于脊髓，而两栖类脊髓已发展到合乎实验要求的程度，且其结构简单明了，易于分析。 3. 生理特性 许多哺乳类动物与人类一样，其心率、呼吸频率、体温三者成正比关系。发热时，心率和呼吸频率都增加。鸟类的体温比哺乳类的高。恒温动物的体温昼夜有一定变动范围，变动情况与行为类型有关，一般夜间活动的动物凌晨2时至3时是一日的峰值。了解这些与人类的细微差别对具体研究是十分有益的。由于动物的临床生理观察指标随动物种类、年龄以及周围环境变化而有所差异，因此正常参考值有较大的变动范围，实验时应按照实际情况具体考虑。
为什么用雌性小鼠
为什么雌性比雄性产生抗体的能力强？ 已明确性激素与免疫系统有关，但其作用机制尚不清楚。推测性激素通过几个不同的靶部位调节免疫系统:性激素可以直接作用于包括胸腺和腔上囊的淋巴器官;也可以通过对非淋巴器官的间接作用，影响免疫系统。性激素可能作用于:①中枢神经系统，释放免疫调节肤或复合物;②巨噬细胞一单核细胞系统，调节它们的功能和细胞因子;③其他内分泌腺体，释放免疫调节激素。尽管究竟是哪种机制还不清楚，但肯定不是一个简单的途径. 1.性激素对胸腺和T细胞介导的细胞免疫的影响 很多实验发现，性激素与胸腺关系密切。性腺切除，胸腺会增生，而过度补充性激素会引起胸腺萎缩。正常发育过程中，青春期前性激素水平低而胸腺大，青春期后性激素水平升高，胸腺则明显缩小。性激素可以改变T细胞亚群。雌激素可以减少CD8+细胞(Ts细胞)，过量雌激素使CD4+与CD8+细胞耗竭，而雄激素可以维持CD8十细胞。5位青春期前的男孩，因高位皋丸应用绒毛膜促性腺激素引起皋酮水平增高，使CD4 + /CD8+比例下降。 性激素还可调节T细胞淋巴因子。性激素有调节IL-2活性的作用，如雄激素可维持其活性，通过对IL-2水平的调节，性激素可明显地改变免疫反应。 雌激素促进抗自身抗体的产生，促进巨噬细胞的功能，抑制NK细胞功能。 2.性激素对抗体介导的体液免疫的影响 性激素调节抗体和自身抗体的表达，表明性激素对B细胞功能有影响。正常雌鼠比雄鼠产生更多抗红细胞的自身抗体，产生自身抗体的细胞大量存在于雌鼠的腹腔内。抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)包括巨噬细胞或其他细胞，对B细胞产生抗自身抗体是必需的，表明正性信号(细胞接触或分泌细胞因子)从抗原递呈细胞传递给了B细胞。 雌激素调节血清和子宫免疫球蛋白。总的说来，雌激素增加抗自身抗体水平，雄激素抑制或不影响抗自身抗体水平。雌激素使自身免疫鼠的多种抗自身抗体增加，使非自身免疫病鼠的抗红细胞自身抗体增加。雌激素对B细胞的数量影响不大。与安慰剂组相比，经雌激素治疗后，小鼠的B细胞可增强脂多糖(LPS)引起的鸟氨酸脱竣酶(ODC)活动。尚不清楚性激素影响自身抗体的产生是直接通过B细胞还是间接地通过影响T细胞、巨噬细胞和其他细胞起作用。也不了解性激素对B细胞活化、增殖和分化的影响。 小鼠实验中总是选择雌性小鼠，老板要我用雌性balb/c小鼠，为什么不能用雄性的阿？ 雌性小鼠通常不会打斗，整群饲养的雄性小鼠，则时常打斗.将二只或二只以上的成年公小鼠关在一起通常是无法和平相处的；因此，公小鼠应分开笼饲以避免互相打斗。新近组合的公鼠群，新的公鼠进入已被划定的领域，或先前独自饲养的小鼠等，皆有可能发生打斗，雌性鼠则较少发生打斗现象。 为什么免疫时要用雌性的小鼠呢？ 因为不同窝雌鼠易群养，雄鼠虽然产生的抗体会比雌鼠高，但不易群养. 雌鼠产生抗体效价要高于雄鼠，并且持续时间也比雄鼠持续时间长！做单克隆抗体用的小鼠全是雌的小鼠~！ 【求助】雌性雄性小鼠 请问一下行为学模型中有时候用雄性小鼠有时雌雄兼用,请问其根据什么啊?假如全用雄性