质粒转化细胞转染步骤
转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate每well60-70%时transfection
接种时2.5×105个/ml/well
质粒DNA转染液优化培养基opti-MEM
步骤：2.5ug质粒DNA+200ulopti-MEM+6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基opti-MEM1.3ml，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell
把transfectioncomplex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
细胞转染的详细过程
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
病毒转染原理及步骤
病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包括以下步骤：1构建载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 一、慢病毒载体构建原理： 慢病毒载体的包装系统一般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
细胞转染的步骤
【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
脂质体转染实验原理与操作步骤总
脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
转染实验方法 (全)
转染实验方案 1.LB培养基的配制：500ml（5皿+2锥形瓶） 准备：500ml玻璃瓶1个，250ml玻璃瓶2个，500ml容量瓶一个，平皿5个 称取：酵母浸提液 5.0g 蛋白胨10.0g 氯化钠10.0g 实验操作： 混合后加去离子水（或注射用水）水400ml，待充分溶解后加水定容至500ml，取100ml 做固体培养基用装入A瓶，余下装入500ml B瓶中（400ml/瓶） 称取1.5g琼脂粉加入A瓶中 另取一瓶（C瓶）接100ml水（稀释氨苄西林用） 将以上3瓶高压灭菌：121°C , 30min 取氨苄西林一支：规格：1g/支 加水于安瓶中溶解后，移入C瓶中，浓度：10mg/ml 按照50μg/ml氨苄西林的浓度加到A B C三瓶中 A瓶：0.5ml（即为LB固体培养基）——松弛型100μg/ml,严紧型50μg/ml B瓶：2ml（即为LB液体培养基） 将A瓶按20ml/平皿，分别移到5个平皿中，待冷却后即为固体培养基。 用膜封口放入4℃保存。 2.感受态转化与培养（TOP10） 准备：37℃摇床，37℃烘箱，10cm培养皿（LB琼脂凝胶+氨苄=50 ml LB+0.75 g琼脂+50μl氨苄），冰盒，42℃水浴,无菌牙签，氨苄溶液40~60 μg/ml 实验前：水浴调至42℃，SOC培养液放至室温，LB加氨苄培养皿于37度烘箱中加热半小时 实验操作： 1)将质粒短暂离心后迅速放入冰浴中 2)冰上解冻TOP10 3)吸取1到10μl质粒加入TOP10中，轻轻敲打混匀（切记不可用移液枪混匀）。剩 余的质粒可储存于-20℃中 4)冰上孵育TOP10离心管30min。 5)42℃水浴30s（精确），不要晃动离心管 6)迅速转入冰浴2-3min，加入250μl预热的soc溶液，保证过程无菌 7)37℃摇床水平225 rpm摇1h 8)吸取200μl用三角耙铺板（最好同时做不同加入量的2个皿，LA培养皿预热）， 剩余溶液储存于4 ℃ 9)正置20min，倒置37 ℃培养过夜 10)第二天取出平皿，观察菌落，选择较大菌落，用牙签挑取菌落放入对应的试管中， 加入15 μl氨苄西林（C瓶母液），最后加3ml LB液体培养基，试管放架子上37 ℃ 摇4-6 h（预培养） 11)按照培养基：菌液=200ml：2ml进行转菌，剩余菌液放入EP管中-20℃保存（复苏 加时100μl菌液预培养）。37℃摇床过夜（约12h），收集菌体。
细胞转染与设计的原则
磷酸钙-DNA共沉淀法 核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。 1、配液 (1)2×HBS 1.63g NaCl 1.19g Hepes 0.023g Na2PO4、2H2O 加水至100ml pH7.1过滤，4℃保存 (2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌 (3)TE：0.1mmol/L EDTA 1mmol/L Tris-HCL PH8.0 (4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL过滤除菌4℃保存。 (5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～800mg/L 注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。 2、操作步骤[方法一]： (1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。 (2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO2培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。 (3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备 ①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。 ②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混匀30秒。 ③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。 (4)转染受体细胞 ①将处于对数生长期已占瓶底50～70%的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。 ②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。 ③置37℃ 5% CO2培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。 ④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。 ⑤更换浓度800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。 ⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。 ⑦2周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。 本实验要加入PSV2-neo、DNA与外源DNA共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素(neo)基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的外源性
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1.试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2.弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3.用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2)。
用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4.加入1ml的含血清培养基终止反应。 5.用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6.将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7.用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8.将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9.将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1.转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2.选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3.将混合液在室温放置10―15分钟。 4.吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5.加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6.到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
lipo2000转染操作步骤
Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
质粒转染流程
那么首先要有质粒，然后才能转染。 所以第一步就是做质粒： 然后继续分解： 1.要对质粒有了解，简单的说质粒是一个载体，可以携带目的基因进入细胞； 2.你要携带什么基因，根据你的描述，你要携带的是干扰基因，该基因能翻译成RNA后，可以干扰你的目的蛋白翻译，从而起到基因沉默的作用； 3.干扰基因的序列是什么，这需要你自己查资料自己设计或者找公司设计； 3.一般的质粒是我们成为空载，即没有携带目的基因。那么问题就来了，如何让空载带上干扰基因，也就是所谓的做干扰质粒。可以找公司，也可以自己做。 4.如何让做好的质粒进入细胞发挥作用：这个过程叫做转染。转染的方法很多，常用的是脂质体转染，多用Life公司的Lipo 2000（现在已经有lipo3000了，据说效果比2000提高了快10倍），这个最方便，属于瞬时转染,，具体方法有说明书；也有用电转的，这个需要特殊的电转设备，比较麻烦，但是转染率高，相应的转染条件也高。 4.转染之后第一步要确定干扰效果，可以问你师姐如何解决。 5.摸索好条件以后，就可以进行你后续的什么看细胞形态，相关分子表达情况，细胞侵袭等试验了。 6.从楼主的语言描述，感觉对质粒构建不是很熟悉，推荐直接找公司构建，当然，如果作为学习，自己也可以构建，但是要有多次失败，时间超长的心理准备。 7.如果转染效率不好，推荐病毒包装即用病毒作为载体，楼主可以看一下载体的一些知识。 对于：质粒转染需要做好哪些前期准备，如何建立细胞系，在质粒的选择和转染试剂的选择上. 细胞系也要根据自己的实验需要，楼主已经选好细胞系了。 至于质粒选择，也是要根据你的实验设计，比如你需要这个质粒具有抗某些药物的特点，以便于后期细胞筛选等等，这些都可以和公司商量。
慢病毒包装实验步骤(精选.)
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL 转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。 仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片 刚铺板后 铺板1天后 第三天：上午 细胞转染： 细胞铺板48h后，从培养箱取出293FT细胞，倒置显微镜观察，细胞密度达90%左右； 吸出原有培养基，沿皿壁缓慢加入8ml完全培养基，放置于培养箱中，待转染。 取出2个1.5ml的离心管，一份加入142ul的无血清培养基和58ulTRL转染试剂，吹打混匀。另一份加入包装质粒18ul、目的质粒10ul和无血清培养基总体积200ul充分混匀。 将2个离心管液体吹打混匀，室温静置20分钟
大提质粒实验步骤
质粒大量提取纯化试剂盒（plasmid Maxprep Kit ） 产品说明: 本试剂盒用碱裂解法从培养菌中提取质粒DNA采用全新技术，通过几次离心去除蛋白 质、多糖内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA纯化DNA的OD260/280通常在左右, 可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化过程均在Eppendof管中操作，方法简单，不需特殊设备，无须过柱，不用酚氯仿抽提；无论细菌裂解释放出的质粒在1mg以下还是10mg以上，基本都可完全回收，不必担心质粒DNA丢失, 本方法提取纯化质粒DNA对质粒损伤小，即使是1Okb甚至1OOkb以上的大型质粒或超大 型质粒，只要碱裂解法能够提取，就可以有效纯化。纯化过程约需~2小时。 产品内容与储存方法： 试剂盒可作20次（＜150ml菌液/次）质粒提取纯化。常温运输。RnaseA于-20 C保存，首次 使用时加入Buffer I中混匀，置4 C保存。Buffer IV与Buffer VI置4 C保存，其余溶液 保存于室温，有效期6个月。 Buffer II 和Buffer V 可能会有沉淀产生。请各在37C水浴和50C水浴加热溶解, 然后混匀使用。Buffer VI如有分层，混匀即可使用。 所需其他试剂： 使用者需准备TE （Tris-Hcl 10mM,EDTA1mM ,,超纯水配制，高压或过滤灭菌），异丙醇和70%乙醇（超纯水与无水乙醇配制）
操作方法： 质粒提取： 1）取过夜培养菌＜150ml菌液，装入合适的离心瓶中，4500~6000xg于4C离心10min沉淀菌体，完全弃除上清。 2）加入5ml Buffer I ，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在，细菌悬液移入50ml 离心管中。 3）加入5ml Buffer II ，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置5min,使细菌完全裂解，溶液透明。4）加入5ml Buffer III ,立即颠倒离心管6~8 次,充分混匀,至白色絮状物产生,冰上放置10~15min。 5）上述裂解液于4 C 12000~16000xg离心15min，小心倒出上清液把它移入到50ml离心管中。 6）加入10ml 异丙醇,颠倒离心管,然后充分混匀,冰上放置10~15min。 7）于4C 12000~16000xg离心10min，小心弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入Buffer I 完全溶解沉淀团块（可用宽口吸管轻轻吹打辅助溶解）,倒入新的离心管中室温放置 10~20min。 8）质粒粗提物用台式离心机室温高速离心2mi n。上清液移入离心管中。 质粒纯化： 1）0. 5ml质粒粗提液中加入100ul Buffer IV 轻轻混匀，12000xg离心2min,将上清液移至全新的离心管中。 2）再加入Buffer IV ，轻轻混匀，12000xg离心5min,将上清液移至全新的离心管中。 3）加入70ul Buffer V ，轻轻混匀，12000xg离心5min,将上清液移至全新的离心管中。 4）加入异丙醇，混匀，室温放置10min。12000xg室温离心10min,弃去上清液，用70%乙醇1ml 轻轻洗涤,弃去液体,室温倒置晾干5min。 5）水溶液沉淀（可在37 度水浴中震荡以辅助溶解） 6）加入200ul Buffer VI ，混匀后冰上放置10~30min , 12000xg室温离心10min，弃去上 清液，用70%乙醇1ml轻轻洗涤两次，弃去液体，室温倒置晾干5~10min，使乙醇完全挥发。
细胞转染的各种方法比较
细胞转染的各种方法比较 梭华-Sofast TM 基因转染试剂 （高效率和细胞毒性低的聚阳离子转染试剂） 梭华-Sofast TM 是新一代的阳离子聚合物基因转染试剂，梭华-Sofast TM 具有高效率转染所必备特征，如浓缩DNA ，将DNA 运送到细胞内，并使其在细胞核内释放等；梭华-Sofast TM 的细胞毒性很低，这是它的另一个重要特点；而且与其它转染试剂相比，梭华-Sofast TM 很稳定，不被血清清除。以上优点使得基因转染的操作简便易行，重复性好。梭华-Sofast TM 已被成功应用于很多原代培养细胞和转化细胞株的基因转染。 一. 特点 ★ 转染效率高且稳定，比目前常用产品高10%。 ★ 细胞培养基中的血清存在与否，均能获得高效率转染。 ★ 细胞毒性低。 ★ 转染程序简单，转染前后无需更换培养基转染实验可以在半小时内完成。 ★ 价格比进口产品便宜60%。 ★ 完善的技术支持，保证质量，无效退货。 二. 效果比较 将梭华转染试剂与其它公司的聚阳离子转染试剂和常用的脂质体转染试剂分别在常用 的报告基因如GFP 、荧光素酶基因和LacZ 基因的转染效率方面作了对比。 实验表明: 1. 梭华-Sofast TM 具有很高和稳定的转染率，是一种很好的基因转染试剂。对某些常用的细胞株梭华-Sofast TM 转染率高于某常用阳离子脂质体，对其他多数细胞株的转染效率相近。 2. 需特别指出梭华-Sofast TM 在原代培养细胞HUV-EC 中有较高的转染效率，而大多数阳离子脂质体对此细胞的转染效率很低。 3. 通过检测转染细胞荧光素酶基因的活性，测定其转染效率。实验表明梭华转染试剂具有最高的转
各种细胞转染方法比较
各种细胞转染方法比较 细胞转染方法包括DEAE－葡聚糖法，磷酸钙法，阳离子脂质体法，阳离子聚合物，病毒介导法，Biolistic 颗粒传递法（基因枪粒子轰击法），显微注射法，电穿孔法等，对各种方法的原理，应用，特点，厂家产品等信息的比较结果如下表： 转染方法原理主要应用特点厂家及产品 DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚 糖与核酸带负电的 磷酸骨架相互作用 形成的复合物被细 胞内吞 瞬时转染 相对简便、重复比磷酸钙好，但 对细胞有一定的毒副作用，转染 时需除血清且一般只用于BSC-1， CV-1，COS细胞系 Sigma-Aldrich (DEAE-Dextran Transfection Kit) 磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸 附细胞膜被细胞内 吞 稳定转染， 染瞬转染 不适用于原代细胞（所需的DNA 浓度较高），操作简便但重复性 差，有些细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心，转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL ， Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与 核酸带负电的磷酸 基团形成复合物，然 后脂质体上剩余的 电核与细胞膜上的 唾液酸残基的负电 核结合；另一种解释 是通过细胞是内吞 作用而被进入细胞。 (若DNA浓度过高， 中和脂质体表面电 核，而降低了与细胞 的结合能力) 稳定转染， 瞬时转染， 所有细胞 使用方法简单，可携带大片段 DNA，通用于各种类型的裸露DNA 或RNA，能转染各种类型的细胞， 没有免疫原性。虽在体外基因转 染中有很高的效率，但在体内， 能被血清清除，并在肺组织内累 积，诱发强烈的抗炎反应，导致 高水平的毒性，这在很大程度上 限制了其应用 Invitrogen （Lipofectami ne 2000， Lipofectamine ，Lipofectin， Lipofectamine Plus， Cellfectin） Roche（Dosper， DOTAP，FuGENE 6） CPG Biotech Co （GeneLimo Plus，GeneLimo Super） Promega （Transfast， Tfx， Transfectam） 阳离子聚合物带正电的聚合物与 核酸带负电的磷酸 基团形成带正电的 复合物后与细胞表 面带负电的蛋白多 稳定转染， 瞬时转染， 所有细胞 除了具有阳离子脂质体的转染效 率高，操作简单，适用范围广， 重复性好等特点外，还具有在体 内，转染效率高，细胞毒性低等 特点，是新一代的转染试剂。 Sunma(梭华－ Sofast?) Qbiogene （jetPEI?） Qiagen(SuperF