稻瘟病菌MoSom1剪切异构体、PKA磷酸化位点及含LisH模体蛋白编码基因

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点预测详 解 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]

蛋白质修饰位点分析目录

（特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标 可以返回目录） 实验目的 找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说明为什么（注释） 找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) 预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus:

预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测： 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列： 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果

DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： 开始预测 结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为：

蛋白酶酶切位点

蛋白酶酶切位点 木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素 胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写

名称三字符号单字符号 丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R 天冬氨酸Asp D 半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q 谷氨酸Glu/Gln E 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 甘氨酸Gly G 天冬酰胺Asn N 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F 脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W 酪氨酸Tyr Y 缬氨酸Val V 【生化】特异性蛋白酶的酶切位点 胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。 木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。 木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。 番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。

生物质谱分析蛋白质磷酸化位点

磷酸化蛋白的高效富集 在线酶解与快速鉴定 项目申请人：袁敏婷黄懿 指导教师：杨芃原 摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。 关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解 1.引言 蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。 蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。 在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸

蛋白质磷酸化1

浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷

蛋白酶专一性酶切位点地影响因素分析报告

蛋白酶专一性酶切位点的影响因素分析 摘要：生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽。酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点。蛋白酶和蛋白质的选择是关键步骤，局部构象、三维结构、实验条件以及其它偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。本文综述了温度、pH值、温度和pH值共同作用、金属离子对酶切位点的影响，旨在为研究酶切规律、制备高得率活性肽提供理论基础。 关键词：生物活性肽；蛋白酶；水解条件；酶切位点 Influencing Factors Analysis of Protease Specific Cleavage Sites Abstract:Bioactive peptides are fragments with specific amino acid sequences that exert a positive physiological influence on the body. Many reported Bioactive peptides are produced by enzymatic hydrolysis,but there are disadvantages of by-product and low yield.The choice of protease and protein source is a key step,and many factors such as local conformation,tertiary structure, experimental conditions and causal interference can influence the protease hydyolysis.This article presents the influencing fators,temperature,pH values,temperature combined pH values and metal ions included,to provide theoretical basis for enzymatic law analysis and higher yield bioactive peptides production. Key words:bioactive peptides;protease;hydrolysis conditions;protease cleavage sites 1.前言 生物活性肽(bioactive peptides)是具有特殊生理功能的肽，是氨基酸以不同组成和排列方式构成的不同肽类的总称（氨基酸数目一般小于100）。生物活性肽有的是天然存在的，如谷胱甘肽、催产素、加压素、舒缓激肽、部分抗菌肽等，有的生物活性肽是以非活性的状态存在于某些蛋白质中，当用特定的蛋白酶水解后被释放出来，才成为有特定生理活性的肽。同种蛋白质经不同的蛋白酶酶解后，可以产生具有不同氨基酸序列、不同生理功能的生物活性肽，如大豆蛋白、

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点分析 目录 实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)

（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) （2）真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点， 并说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: https://www.360docs.net/doc/4913902023.html,/(查看蛋白的修饰 情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.360docs.net/doc/4913902023.html,/disphos/

PhosphoSitePlus:https://www.360docs.net/doc/4913902023.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：fasta.txt

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。

用多样性增量特征选择技术识别 蛋白质磷酸化位点

Hans Journal of Computational Biology 计算生物学, 2018, 8(1), 24-32 Published Online March 2018 in Hans. https://www.360docs.net/doc/4913902023.html,/journal/hjcb https://https://www.360docs.net/doc/4913902023.html,/10.12677/hjcb.2018.81004 Identification of Protein Phosphorylation Sites by Diversity Increment Feature Selection Technique Shisai Hu, Zhen Liang, Yuxiang Chen, Ying Zhang*, Jun Lv* College of Science, Inner Mongolia University of Technology, Hohhot Inner Mongolia Received: Apr. 25th, 2018; accepted: May 15th, 2018; published: May 22nd, 2018 Abstract Phosphorylation is one of the most important protein post-translational modifications and plays important roles in numerous biological processes by significantly affecting proteins’ structure and dynamics. The development of computational biological methods for the accurate identification of phosphorylation sites helps to our understanding of key signal transduction mechanisms. In this paper, a kinase independent phosphorylation site identification model was presented, called FSID_PhSite. The model is featured by component of k-spaced amino acid pairs and the position conservation of residues surrounding the phosphorylation sites. Applying diversity incremental feature selection technique to feature selection and inputting the selected features into the sup-port vector machine algorithm for recognition, when the ratio of positive and negative samples is 1:1, on independent testing dataset validation, the accuracy of identification for serine, threonine and tyrosine sites is 84.34%, 82.32% and 68.89%, respectively. The results were superior to the existing kinase independent phosphorylation sites identification model. Keywords Protein Phosphorylation Site, Feature Selection Based on Increment of Diversity, Support Vector Machine 用多样性增量特征选择技术识别 蛋白质磷酸化位点 胡世赛，梁珍，陈宇翔，张颖*，吕军* 内蒙古工业大学理学院，内蒙古呼和浩特 *通讯作者。

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点分析 目录 （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后

的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说 明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus: ●预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测： 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：

2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： ●开始预测 ●结果 DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： ●开始预测 ●结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人

类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为： 1、N型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测 ●结果 2、O型糖基化位点预测 （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测 ●结果 （2）真核生物O型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测

磷酸化蛋白质的分析方法

磷酸化蛋白质的分析方法 试剂： 乙腈(Acetonitrile，ACN)，三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA) 购自 Merck 公司(Darmstadt，Germany)。尿素(urea)，氯化钠(Sodium chloride，NaCl)购自Sigma 公司。甲酸(Formic acid，FA)、乙酸(Acetic acid，HAC)购自Aldrich(St. Louis，MO，USA)。盐酸胍(Guanidine hydrochloride，GuCl)，二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)，碳酸氢铵(Ammonium bicarbonate)，碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA) 购自Bio-Rad (Hercules，CA，USA)。胰蛋白酶(Trypsin)购自Promega (Madison，WI)。所有的化学品的纯度级别除了乙腈是色谱纯外都是分析纯。实验所用水都经过Milli-Q system (Millipore，Bedford，MA，USA)处理。 样品制备 样品用2D 裂解液裂解（8 M Urea,4% CHAPS,65 mM DTT,40 mM Tris），100W 30 s 超声后，15,000g 离心45 min。取上清，Bradford法定量；取500μg 样品加入2ul 1M DTT，于37℃还原反应2.5h；再加入10ul 1M IAA 于室温避光烷基化40min。100%丙酮沉淀过夜，100mM碳酸氢铵（pH 8.5）溶解样品，按50：1加入胰蛋白酶酶解过夜。 磷酸化多肽的富集： Loading buffer: (饱和glutamic acid/65%乙腈/2%TFA) Wash buffer 1: (65%乙腈/0.5%TFA) Wash buffer 2: (65%乙腈/0.1% TFA)

蛋白酶的分类及酶切位点

蛋白酶的分类及酶切位点

氨基酸0.ppt 氨基酸的名称与符号

alanine 丙氨酸Ala A arginine 精氨酸Arg R asparagine 天冬酰氨Asn Asx N aspartic acid 天冬氨酸Asp Asx D cysteine 半胱氨酸Cys C glutamine 谷氨酰胺Gln Glx Q glutamic acid 谷氨酸Glu Glx E glycine 甘氨酸Gly G histidine 组氨酸His H isoleucine 异亮氨酸Ile I leucine 亮氨酸Leu L lysine 赖氨酸Lys K methionine 甲硫氨酸Met M phenylalanine 苯丙氨酸Phe F proline 脯氨酸Pro P serine 丝氨酸Ser S threonine 苏氨酸Thr T tryptophan 色氨酸Trp W tyrosine 酪氨酸Tyr Y valine 缬氨酸Val V 血清终止胰酶消化的原理 血清终止的原理其实是竞争抑制。就是用过量的牛血清中含有的蛋白来和胰酶结合。不给胰

酶消化细胞蛋白的机会。 细胞传代时，血清为什么能终止胰酶消化？ 胰蛋白酶的酶切位点是肽链的Lys和Arg两个残疾的羧基端肽键，血清的加入可使酶饱和，严格上说不是竞争性抑制，因为血清蛋白不是抑制剂，还是底物！ 什么样的细胞不能用胰酶-EDTA消化 植物细胞不能用胰酶-EDTA消化，要用纤维素酶消化。 应该是肿瘤细胞吧。正常的细胞，貌似都需要用胰酶或者胶原酶消化。 EDTA-胰酶，只不过是在胰酶里加入了EDTA而已。 EDTA是乙二胺四乙酸，一种金属螯合剂。一般和胰蛋白酶配合使用。原因在于，钙，镁等金属离子会降低胰酶活力，故在使用胰酶消化液时要配合加入EDTA。它可以螯合这些离子，消除对胰酶的抑制。 干细胞饲养层制作中，胰酶—EDTA消化成纤维细胞（MEF）时，EDTA的作用是什么？ 应该是胰酶分散细胞，EDTA鳌合金属离子使金属酶失活 《军医进修学院学报》1992年02期 加入收藏投稿 正常人血浆蛋白酶解产物对胃癌细胞肺转移抑制作用的研究 焦顺昌赵东海黄昌霞王洪海 【摘要】：本文采用胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶联合消化方法得到正常人血浆(NHP)有限蛋白酶解产物(NHP-EP)。体外研究发现,NHP的细胞粘附性可达90％;而NHP-EP的细胞粘附

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点预测详 解 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

蛋白质修饰位点分析目录

（特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并 说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus: ●预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测：

实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列： 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： ●开始预测 ●结果 DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： ●开始预测

●结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为： 1、N型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测 ●结果

2020年(生物科技行业)应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点生物质谱分析蛋白质磷酸化位

（生物科技行业）应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点生物质谱分析蛋白质磷 酸化位

应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点 项目完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉 项目完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心 摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制和功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之壹。我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丢失扫描和固相金属亲和色谱（IMAC）俩种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。应用这俩种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。俩种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中仍要视具体情况优化实验条件。 蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的壹种蛋白质翻译后修饰（PTM）。在哺乳动物中大约有三分之壹的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是壹种普遍的调控机制。细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。蛋白质组研究的壹个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。目前没有壹个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸（pSer）、磷酸化苏氨基酸（pThr）和磷酸化酪氨酸（pTyr）。毛细管电泳（CE）能够分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，可是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱（HPLC）分离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。 生物质谱（MS）是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质壹级结构分析的壹个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。是唯壹能够和蛋白质组研究水平相匹配的方法。近年来，生物质谱的发展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的壹个前沿领域，也是目前

蛋白磷酸化方法

蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。 然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。 研究蛋白质磷酸化的相关方法： 磷酸化Western Blot 对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。 我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗体（pan-phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一组以Clemens 为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。 与做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要额外需要注意的事项： 首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如

蛋白酶切位点

Enzymes E.C.Number Cleavage sites Serine proteases E.C.3.4.21. α-chymotrypsin(胰凝乳蛋白酶，糜蛋白酶)E.C.3.4.21.1Tyr-|-Xaa,Trp-|-Xaa,Phe-|-Xaa,and also Leu-|-Xaa,Met-|-Xaa, Trypsin(胰朊酶，胰蛋白酶) E.C.3.4.21.4Arg-|-Xaa,Lys-|-Xaa, Pancreatic elastase(胰弹性蛋白酶) E.C.3.4.21.36Ala-|-Xaa,and also Gly-|-Xaa, Val-|-Xaa,Ser-|-Xaa, Thrombin(凝血酶) E.C.3.4.21.5Arg-|-Gly, Plasmin(胞质素，胞浆素) E.C.3.4.21.7Lys-|-Xaa,>Arg-|-Xaa Prolyl oligopeptidase,or prolyl endopeptidase E.C.3.4.21.26Pro-|-Xaa,>>Ala-|-Xaa Plasma kallikrein(血浆激肽释放酶) E.C.3.4.21.34Arg-|-Xaa,Lys-|-Xaa,including Arg-|-Ser,Lys-|-Arg, Leukocyte elastase(白细胞弹性蛋 白酶 ),or neutrophil elastase(中性白细 胞弹性蛋白酶),or lysosomal elastase(溶酶体弹性蛋白酶) E.C.3.4.21.37Val-|-Xaa,Ala-|-Xaa, Cysteine proteases E.C.3.4.22. Cathepsin B(组织蛋白酶) E.C.3.4.22.1Arg-Arg-|-Xaa,and also Leu-|-Xaa, Ala-|-Xaa,Phe-|-Xaa,Trp-|-Xaa, Clostripain(梭菌蛋白酶),or endoproteinase Arg-C E.C.3.4.22.8Arg-|-Xaa including Arg-|-Pro,but not Lys-|-Xaa Calpain(钙激活中性蛋白酶)-1,or μ-calpain E.C.3.4.22.52Met-|-Xaa,Tyr-|-Xaa and Arg-|-Xaa(with Leu or Val as the P2 residue) Aspartic acid proteases E.C.3.4.23. Pepsin(胃朊酶，胃蛋白酶) E.C.3.4.23.1Preferentially Phe-|-Xaa,Tyr-|-Xaa, and also Leu-|-Xaa,and Trp-|-Xaa,,ideally with Xaa= Phe,Trp,or Tyr Cathepsin(组织蛋白酶)D E.C.3.4.23.5Preferentially Phe-|-Xaa,Tyr-|-Xaa, and also Leu-|-Xaa,ideally with Xaa ≠Ala or Val