浙江大学生物化学丙实验报告3、4

浙江大学生物化学丙实验报告3、4
浙江大学生物化学丙实验报告3、4

实验报告

课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价

同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法;

②掌握分光光度法制作标准曲线,准确测定未知样品的蛋白质含量; ③掌握分光光度计的使用方法。

2、蔗糖酶活力测定——3.5-二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法; ②学习酶的比活力的计算。

二、实验内容和原理

1、Folin-酚测定法

Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成,在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用,生成紫红色络合物;乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成,在碱性条件下,铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基(酚基)和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂(乙试剂)产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物),其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定,适于测定蛋白质含量0.05~0.5g/L 。 优点: 简单、迅速、灵敏度高;反应较稳定。 缺点: 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定

蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。因此,每水解1mol 蔗糖,就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法,例如:纳尔逊-索模吉试剂比色法,斐林试剂法等。

本实验采用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量,由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定,求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。

3、蔗糖酶活力单位(u):

蔗糖酶在室温(25℃), pH4.5的条件下,每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。

4、蔗糖酶比活力的计算:

酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数,一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。

酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度,对于同一种酶来说,比活力越大,酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力,是表示酶的纯度高低的一个重要指标。

比活力=活力单位/mg蛋白

三、实验材料与试剂

1、实验材料

蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。

2、实验试剂

①标准蛋白质溶液:0.5g/L牛血清白蛋白

②Folin-酚试剂(甲试剂;乙试剂)

③1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量180.16);

④0.2mol/L乙酸缓冲液,pH4.5;

⑤5%蔗糖溶液;

⑥3,5-二硝基水杨酸试剂;

甲液:溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10%NaOH溶液中,并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。

乙液:称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中,再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.

甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。

四、实验器材与仪器

1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

①试管、试管架以及离心管(7ml)、离心管架;

②移液管(1ml、2ml、5ml);

③微量移液枪(200μl,1000μl)及枪头;

④可见光分光光度计及1cm玻璃比色皿;

⑤恒温水浴箱(25℃)。

2、蔗糖酶活力测定——3.5-二硝基水杨酸法

①试管、试管架以及离心管(7ml)和离心管架;

②移液管(1ml、2ml、10ml);

③微量移液枪(200μl,1000μl)及枪头;

④恒温水浴(25℃、100℃);

⑤可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿;

五、操作方法和实验步骤

1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法

①制备Folin-酚法蛋白质标准曲线

取6支试管,编号1-6,按表1顺序依次加入各种试剂,并在分光光度计于500nm处测定光吸收值(A500nm值)。

②各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定

由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高,因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前,可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释,以测定蔗糖酶蛋白质含量,A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。

取13支试管,编号1~13,按表2依次加入各种试剂,并在分光光度计于500nm处测定光吸收值(A500nm值)。

注:加入Folin-酚乙试剂后,要迅速混匀(加一管混匀一管),使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

③绘制标准曲线并计算

⑴绘制标准曲线:

以光吸收值(A500nm)为纵坐标,标准蛋白质含量(mg/L)为横坐标,在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。

⑵计算:

蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释溶液的光吸收值(A500nm),根据蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量,再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。

2、蔗糖酶活力测定——3.5-二硝基水杨酸法

①标准曲线的制作

按表3加操作,后以还原糖(mg数或μmol数)为横坐标,A520值为纵坐标,制作葡萄糖浓度-吸光值标准曲线。

②蔗糖酶的酶活力测定

按照表4加样,在520nm处测定吸光度。

六、实验数据记录和处理

表1

表2

表3

表4

七、实验结果与分析

1、蛋白质含量标准曲线

由表2可得:

由此得蛋白质含量标准曲线:

(1)在做标准曲线和样品曲线时,均应在加入乙试剂后要迅速混匀(加一管混匀一管),使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前,以防出现错误的实验结果。

(2)因为参照液蛋白质含量为0,所以标准曲线趋势线须过原点,即截距为零。所得R平方数为0.9944,较接近1,说明实验较为成功。

(3)蛋白质标准曲线的微小偏差可能来自于加入试剂后的局部未混匀以及添加试剂时的微小损失等。

2、样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量

将表2中的数据带入上述蛋白质含量标准曲线,可计算得:

由表中数据可知,从样品I到样品IV,样品中蛋白质含量呈减少趋势,这说明,随着离心,乙醇沉淀,离子交换柱层析等纯化步骤的进行,杂蛋白在逐步被分离,蔗糖酶的含量在逐渐增多,即蔗糖酶的纯度在逐渐增高。

3、葡萄糖标准曲线

由表3处理可得

由此得葡萄糖标准曲线

(1)葡萄糖浓度-吸光值标准曲线的R平方为0.9953,跟1比较接近,说明我们在测定葡萄糖浓度-吸光值标准曲线的时候操作基本正确,没有出现较大的误差。微小误差的产生可能是在试剂转移或者反应时间方面有误差。

(2)尽管1号试管本身也有一定值的吸光度,但是因为将1号试管作为参照,所以将其吸光度视为0.为保证理论的正确性,使趋势线经过原点。

4、各步提取液酶活力测定

将表4数据代入上述葡萄糖标准曲线可得

5、蔗糖酶各步纯化样品的纯度比较

总体蛋白质呈下降趋势,活力应呈上升趋势。因为杂质蛋白被除去,蔗糖酶纯度提高。我组实验总体上符合该趋势说明大致实验操作准确无误。但是在样品Ⅳ时,出现活力及比活力大幅度下降这一不正常现象。本次试验我们组用的是另外组的样品,参照他们之前得出的色谱图和试验情况,分析造成这一现象的原因可能为:

另外一组的同学在做实验之前,不小心将保存样品4的离心管打翻,造成了大量样品的损失,后来为了保证样品量足够,对其进行了稀释,使其浓度下降,从而导致蔗糖酶活力、比活力等的下降,并且由于未记录稀释倍数,故无法计算原有样品的酶活力,造成样品4活力显著低于前三个样品。

八、讨论、心得

①由于一开始做出结果颜色过深,活性过大,我们组稀释倍数较大。

②酶活力测定时,要控制好反应时间,各管的酶反应时间一定要一致,否则会影响整体结果;加各反应试剂的体积一定要准确且不能加错,否则将无法得到理想结果。

③本实验结果不是很理想,因为本次实验的结果与前面两次实验的操作密切相关,所以可能是因为前面两次实验中的操作不当。如可能是第一步时碾压不够,得出的样品一量较少,以及分离时操作不当,使得样品二含量也较少,还有离子交换柱制备时可能存在问题,使一部分蔗糖酶没能够分离出来,还有本次实验中可能实验时间控制的不够准确,造成结果的偏差。

④缺乏小组成员之间的沟通。我们在做实验之前并不知道另一小组的同学把样品打翻了,如果知道的话就应该用我们组的样品。所以在实验前和实验过程中能够好好沟通,就不会造成实验结果的不正常现象。

⑤在实验中应注意:1)酶活力测定时,要控制好反应时间,各管的酶反应时间一定要一致,否则会影响整体结果;2)加各反应试剂的体积一定要准确,否则也会影响最终结果。3)加入Folin-酚乙试剂后,要迅速混匀(加一管混匀一管),使还原反应产生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。

⑥使用分光光度计时应注意波长的设置,以免发生测完之后发现波长设置错误的问题。

⑦本实验的主要操作是各种溶液的取用以及酶液的稀释,每管各种溶液的取用量都不同,且不同组的稀释倍数不同,因此取用时应特别注意,防止取错溶液或取量不对,还要注意不要加错试管等。如果在配制出现加错等情况,应重新配置。

⑧本实验结果分析中,制作标准曲线时,采用了图像过原点的趋势线,以保证理论上的正确性。

⑨本实验步骤较繁琐,三个人应该明确分工,有条不紊,这样才可以做到高效的完成实验。

生物化学实验报告

一、实验目的: 1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项; 2、掌握3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色定糖的原理和方法; 3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; 4、掌握酶蛋白分离提纯的原理; 5、掌握酶的比活力测定及其计算方法; 6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法; 7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。 称量技术: 1、了解电子天平的用途 2、了解电子天平的工作原理 3、掌握电子天平的使用方法 4、掌握电子天平使用前后的注意事项 离心技术: 1、了解离心机的基本原理和用途 2、了解离心机的类型和用途 3、了解离心机的型号和控制版面 4、掌握离心机的使用方法 5、掌握离心机使用的注意事项 层析技术: 1、了解层析技术的基本原理 2、了解层析技术的分类情况 3、了解各种层析技术的原理 4、掌握凝胶层析技术 光谱分析技术: 1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理 2、了解仪器结构和分类 3、熟练掌握常用仪器的使用方法和注意事项 电泳技术: 1、了解电泳的基本原理 2、了解电泳的类型

3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 4、掌握垂直板电泳的操作技术 5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术 6、了解转移电泳的基本原理和操作方法 7、了解双向电泳的基本原理和操作方法 二、实验原理: 1、蔗糖酶的提取: ①酵母菌的基本特征: 单细胞,椭圆形、圆形或柱形。长5-30μm,宽1-5μm。 ②生物材料破碎方法: (1)机械(匀浆)法 ①研钵 ②玻璃或Teflon研棒匀浆器(50mL)Teflon:聚四氟乙烯 先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高,适用于少量组织和脏器。 ③高速组织捣碎机(0.5-1L) 将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3 体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 ④高压匀质机(XL) 高压下的细胞通过阀门流出时,细胞内外压力同时降低,但由于细胞膜的作用,胞外压力瞬间降至常压,而胞内压力相比之下降低较慢,从而在细胞内外形成压力差,使细胞膜破裂。 优点:快速,产热小,对蛋白损伤小,破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上 (2)超声波处理法 用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,常在30 至60Hz 频率下处理10-15 分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。(3)反复冻融法 将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。设备简单、效率不高,时间长,注意蛋白酶! (4)化学处理法 有些动物细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。

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,. 实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法 ①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; ②掌握分光光度法制作标准曲线,准确测定未知样品的蛋白质含量; ③掌握分光光度计的使用方法。 2、蔗糖酶活力测定——3.5-二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法; ②学习酶的比活力的计算。 二、实验内容和原理 1、Folin-酚测定法 Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成,在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用,生成紫红色络合物;乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成,在碱性条件下,铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基(酚基)和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂(乙试剂)产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物),其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定,适于测定蛋白质含量0.05~0.5g/L 。 优点: 简单、迅速、灵敏度高;反应较稳定。 缺点: 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定 蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。因此,每水解1mol 蔗糖,就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法,例如:纳尔逊-索模吉试剂比色法,斐林试剂法等。 专业: 农业资源与环境 姓名: 李佳怡 学号: 3130100246 日期: 2015.5. 26 地点: 生物实验中心310 装 订 线

浙江大学生物化学丙实验报告1

实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶的提取 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、巩固理论知识,学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 1、实验内容: 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ①酵母细胞破碎 细胞破碎的常用方法 液体剪切法固体剪切法压力和研磨 物理法、化学渗透法、酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法(研磨)将酵母细胞破碎,把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。 ②蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有:盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性(加热)、有机溶剂(乙醇)沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活,为了能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯 操作中要始终保持酶的活性,如在低温下操作等,这样才能得到较好地分离提纯效果。 三、实验材料与试剂

1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3~4人) 2、实验试剂 石英砂,95%乙醇(-20℃),20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平(称量干酵母粉);研砵(每组一套);50ml高速离心管(4支/组、4孔50ml离心管架一个/组);托盘天平(离心管平衡用);高速冷冻离心机;恒温水浴箱(50℃);量筒(50ml)、微量移液枪(1000ul)及枪头或移液管(1ml)、玻棒、滴管等;1.5ml离心管(留样品Ⅰ、Ⅱ用)及离心管架;制冰机;-20℃冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹(干磨法) ①称量:称取市售干酵母粉10g+约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨):至尽可能成细粉末状(约15min) ③加液+研磨:量取总体积40 ml的20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液,分2次加研磨10min, 使呈糊状液体; ④离心:将糊状液体转移到2支50ml离心管中,两支离心管平衡后(托盘天平上),离心10min (条件:4℃、12000r/min) ⑤收集+测量:收集上清液并量出体积V1(样品I),另留1ml上清液(样品I )放置-20℃冰箱保存用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理:将上步抽提液(样品I),迅速放入50℃恒温水浴,保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却:保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心:将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中,平衡后,离心10min。 (条件:4℃,12000r/min) ④收集+测量:收集上清液并量出体积V2(样品Ⅱ),另留1ml上清液(样品Ⅱ)放置-20℃冰箱保存(用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂(乙醇)沉淀 ①冰浴:将热处理后的上清液加入相同体积的-20℃的95%乙醇,冰浴中温和搅动混匀,

高级生物化学与分子生物学综合实验报告优选资料p

5. 按表1中给出的浓缩胶配置方法制备浓缩胶。注意一旦加入TEMED,马上开始聚合,故应快速操作。 6. 在聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净梳子。 7. 在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:1体积比加入样品处理液,在100℃加热5min以使蛋白质变性。 8. 浓缩胶聚合完全后(30-60 min),小心移出梳子。将凝胶固定于电泳装置上,上下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。 二、上样电泳 1. 按预定顺序加样,加样量通常为10~25μL。 电泳检测样品至少包括:蛋白Marker、上样液(原液)、上样后的穿透液、10mM 咪唑冲洗液、50mM咪唑冲洗液、100mM咪唑冲洗液、250mM咪唑冲洗液。 2. 将电泳装置与电源相接,凝胶上所加电压为8V/ cm。当染料前沿进入分离胶后,把电压提高到15 V/ cm,继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1 cm,然后关闭电源。 3. 从电泳装置上卸下玻璃板,用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 三、用考马斯亮蓝对SDS聚丙稀酰胺凝胶进行染色和脱色 染色时间:现温度下不少于2h。 脱色需3~10小时,期间应多次更换脱色液直至背景清楚。为了永久性记录,应尽快对凝胶进行拍照。 四、实验结果与讨论 1、质粒的提取、酶切电泳图谱 1 2 M 图1-1 第四组电泳图谱图1-2 第三组电泳图谱 1:酶切后的质粒2:质粒M :Marker 1、2:质粒4、5:酶切后质粒 观察结果:通过对比第三组和第四组电泳图谱,可以发现酶切后的质粒条带在原质粒条带的前面,并且质粒泳道条带比较多;电泳条带模糊,呈凹凸形状,拖尾现象比较严重,不能很明显地观察结果。 原因分析:

浙江大学生物化学(乙)第1次

您的本次作业分数为:100分单选题2.生成酮体和胆固醇都需要的酶是()。 A HMG-CoA 合成酶 B HMG-CoA还原酶 C HMG-CoA裂解酶 D 乙酰乙酰硫激酶 E 转硫酶正确答案:A 单选题 3.乳糖操纵子的调节水平在()。 A 复制 B 转录 C 转录后 D 翻译 E 翻译后正确答案:B 单选题 4.变构效应物对酶结合的部位是()。 A 活性中心与底物结合的部位 B 活性中心的催化基团 C 酶的-SH基 D 活性中心以外的特殊部位 E 活性中心以外的任何部位正确答案:D 单选题 5.1分子葡萄糖经糖酵解分解为2分子乳酸时,其底物水平磷酸化次数为()。 A 1 B 2 C 3 D 4 E 5 正确答案:D 单选题 6.酶的辅基具有下述性质()。 A 是一种结合蛋白 B 与酶蛋白结合比较疏松 C 由活性中心的若干氨基酸残基组成 D 决定酶的专一性 E 与酶蛋白亲和力较大,一般不能用透析等物理方法彼此分开正确答案:E 单选题 7.体内转运一碳单位的载体是()。 A 生物素 B 磷酸吡哆醛

C 四氢叶酸 D 二氢叶酸 E CoA 正确答案:C 单选题 8.原核生物转录的终止因子是()。 A α B ρ C β D σ E Γ 正确答案:B 单选题 10.下列哪一物质含有高能键?() A 6-磷酸葡萄糖 B 1,6-二磷酸果糖 C 1,3-二磷酸甘油酸 D 烯醇式丙酮酸 E 乳酸正确答案:C 单选题 12.肝脏不能氧化利用酮体是由于缺乏()。 A HMGCoA合成酶 B HMGCoA裂解酶 C HMGCoA还原酶 D 琥珀酰CoA转硫酶 E 乙酰乙酰CoA硫解酶正确答案:D 单选题 14.下列关于遗传密码的基本特点,哪一点是错误的?() A 密码无标点 B 一种氨基酸只有一种遗传密码 C 有终止密码和起始密码 D 密码专一性主要由头两个碱基决定 E 病毒、原核细胞或真核细胞都利用同一套遗传密码正确答案:B 单选题 16.三羧酸循环的第一个产物是()。 A 乙酰CoA B 草酰乙酸 C 柠檬酸 D 苹果酸

生物化学实验六——酵母RNA的提取与含量测定 山东大学实验报告

实验六——酵母RNA的提取与含量测定 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-10 同组者:张奕 一、实验目的 1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握紫外分光光度计的使用。 3.了解和掌握紫外吸收法测定RNA浓度的原理。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多,DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液,当碱被中和后,可加乙醇使其沉淀,由此即可得到RNA制品。但是用碱液提取的RNA有不同的降解。 核酸及其衍生物,核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在260nm 左右,且一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比(浓度为5μg/ml—45μg/ml吸光度与浓度成正比),利用此性质,可用RNA标准液绘制RNA吸光标准曲线(标准曲线的斜率为0.022-0.024左右),测定样品RNA浓度。由于蛋白质在280nm的光吸收,对核酸测定有一定的干扰作用,最大吸收峰在280nm处,原因是蛋白质组成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白质的干扰必须得先测260nm处的吸光度,再测280nm处的吸光度,通过计算消除其对核酸的影响。 三、实验器材 干酵母粉 电子天平 量筒 容量瓶100ml 磁力搅拌器 试管 100℃水浴锅pH试纸(pH1-14)烧杯 离心机 722型分光光度计锥形瓶 离心管 四、实验试剂 0.2%氢氧化钠溶液95%乙醇 无水乙醚酸性乙醇(5ml浓Hcl加入到500ml95%乙醇中混匀)RNA标准蛋白溶液(200μg/ml)

1.RNA的提取 (1)称取4g干酵母粉,放入200ml锥形瓶中,加入40ml0.2%的氢氧化钠溶液混匀,在沸水浴中煮沸30min中并冷却; (2)冷却后,把液体倒入离心管中,在4000r/min的条件下离心15min; (3)离心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml,边加边搅拌,静置5min左右,再4000r/min的条件下离心5min; (4)离心后保留沉淀,用20ml 95%乙醇分两次洗涤沉淀,每次洗后在3000r/min的条件下离心5min; (5)离心后的沉淀再用无水乙醇10ml洗涤两次,每次用3000r/min离心5min; (6)离心结束后,收集沉淀与滤纸上,称重备用。 2.RNA样液的配制 (1)取粗RNA0.2-0.25g与烧杯中,加入5mlNaOH溶液,搅拌,溶解,调成糊状。 (2)再加入蒸馏水40ml,搅拌混匀,调PH至7.0后,放入100ml容量瓶中定容。 (3)再分3-4次分别取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中继续定容待测,并且把容量瓶依次编号为A、B、C。 3.RNA标准曲线的绘制 (1)取洁净的试管,依次标号为1-10、A、B、C后,按照下表分别往各试管中加所需液体,并用磁力搅拌器混匀。 (2)混匀后以0号试管为参比液,在260nm下测各试管的吸光度A,并根据0-9试管的吸光值绘制出RNA标准曲线,并最终得出样品的浓度。 六、注意事项 1.离心机的使用,使用前一定要将两离心液(包括外壳)在天平上调平,对称放置在离 心机上,防止力臂不对称而损坏离心机。 2.紫外分光光度计的使用,要先预热10分钟,往比色皿中到液体只需到三分之二即可, 防止液体溢出腐蚀仪器,爱护仪器。

生物化学实验报告册

生物化学实验报告册 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入

水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。 实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。 实验报告通过分析总结实验的结果和问题,加深对有关理论和技术的理解与掌握,提高分析、综合、概括问题的能力,同时也是学习撰写研究论文的过程。 1.实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。 2.实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料、③实验步骤要求在实验课前预习后撰写,作为实验预习报告的内容。预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。 3.每项内容的基本要求 实验原理:简明扼要地写出实验的原理,涉及化学反应时用化学反应方程式表示。 实验材料:应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪

浙大生化(丙)课堂期中试卷

生物化学(丙)期中试卷 一.判断题 1.1分子的NADH+H+经呼吸链氧化可产生 2.5分子ATP。 2.蛋白质变性的本质是蛋白质分子的高级结构被破坏,一级结构则保持完整。 3.琥珀酸脱氢酶和NADH脱氢酶的辅助因子都是FAD。 4.磺胺药可使乙酰胆碱酯酶的Km上升,Vmax不变。 5.ATP的主要功能是为机体提供能量和提供活性磷酸基团。 6.糖异生是指由丙酮酸、琥珀酸CoA、6-磷酸果糖、苹果酸等物质转变为葡萄糖的过程。 7.蛋白质三级结构的稳定力包括氢键、盐键、疏水相互作用、范德华力、二硫键、配位键 等次级键。 8.同源蛋白质的种属差异性说明一级结构的局部改变并不会影响蛋白质的功能。 9.同工酶是指功能相同,但结构和性质不同的一类酶。 10.限制性内切酶是指在一特殊序列处将DNA的两条链同时切断的一类酶。 11.ATP是磷酸果糖激酶I的底物,因此对该酶的活性起别构激活作用。 12.反馈抑制作用是指反应的产物对催化反应的酶的抑制作用。 13.硫辛酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和辅酶A都可以作为酰基的载体起传递作用。 14.酶催化高效性的机理是通过酸碱催化、温度效应、共价催化等因素降低了反应的活化能。 15.蛋白质的基本化学键是肽键、核酸的基本化学键是3’,5’-磷酸二酯键。 二.单选题 1.根据酶催化反应的性质,延胡索酸酶属于: (1)水解酶类(2)合成酶类(3)裂合酶类(4)转移酶类 2.当[S]=2Km时,V的值是: (1)2Vmax(2)2/3Vmax(3)1/3Vmax(4)1/2Vmax 3.下列酶催化的反应无CO2参与的是: (1)6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶 (2)苹果酸酶 (3)3-磷酸甘油醛脱氢酶 (4)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 4.1分子的F1,6-2P被彻底氧化分解为CO2和H2O可产生的高能化合物分子数为(通过 α-磷酸甘油穿梭): (1)32(2)30(3)34(4)28 5.在2,4-二硝基苯存在下一分子FADH2通过呼吸链可产生的ATP分子数是: (1)1(2)0(3)1.5(4)2.5 6.DNA的双螺旋结构中,主要的稳定力是: (1)氢键 (2)疏水相互作用 (3)范德华力 (4)离子键 7.下列代谢途径既不发生在细胞液也不发生在线粒体中的是: (1)EMP途径(2)TCA途径(3)HMP途径(4)乙醛酸循环 8.蛋白质的特征吸收波长是:(1)260nm(2)280nm(3)340nm(4)500nm 9.下列代谢途径中能为机体提供NADPH+H+的代谢途径是: (1)糖酵解途径(2)乙醛酸循环途径(3)磷酸戊糖途径(4)呼吸链 10.在酶的活化和去活化中,磷酸化和去磷酸化常发生在那个氨基酸残基:

大学生物化学实验

生物化学实验安排 实验一蛋白质及氨基酸的呈色反应 一、实验目的 1、了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式 2、了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3、学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 二、实验原理 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热,呈现紫色或红色,此反应称为双缩脲反应,双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 3.苯环的黄色反应 Tyr + 浓硝酸黄色 Trp Phe+少量浓硫酸+浓硝酸黄色 4. 乙醛酸的反应: 检测Trp或含Trp蛋白质的反应。当Trp与乙醛酸和浓硫酸在试管中滴加时,产生分层现象,界面出现紫色环。主要是由于蛋白质中的吲哚环作用。 5. 偶氮反应

偶氮化合物都含有-N=N-这样结构,通常作为染料。 6. 醋酸铅反应 ()↓ --→+--+Pb COO NH Pb COOH N H 2222Pr Pr 三、实验步骤 1. 双缩脲反应(biuret reaction) 取1支试管,加乳蛋白溶液(蛋清:水= 1:9)约1ml 和10%NaOH 约2ml ,摇匀,再加1%CuSO4溶液2滴,随加随摇。观察现象,记录。 2. 茚三酮反应(ninhydrin reaction) (1)取2支试管分别加入蛋白质溶液(蛋清:水= 1:9)和甘氨酸溶液1ml ,再各加0.5ml0.1%茚三酮,混匀,沸水浴中加热1-2分钟,观察颜色是否由粉红色变紫红色再变蓝色。 (2)在一块小滤纸上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液,风干后再在原处滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察是否有紫红色斑点的出现。 3. 苯环的黄色反应 向6个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。鸡蛋清溶液(蛋清:水= 1:9) 4. 乙醛酸的反应: 向3个试管中按下表加试剂,观察现象并记录。蛋白质溶液(蛋清:水= 1:20)

生物化学实验报告

生物化学实验报告 动物营养研究所 张树润 2015.10.12 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活性测定一.实验目地 1.通过实验了解活性物质的分离提取。 2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应用。 二.实验原理 超氧化物歧化酶是一种酸性蛋白,是唯一以自由基为底物 的酶,具有清除自由基的功能酶,在酶分子上共价连接金属辅 基,因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。 该酶首次从牛红细胞中分离得到,是一种蓝色含铜蛋白,之后, 研究发现该蛋白酶具有催化氧发生歧化反应的能力,因此将其 命名为超氧化物歧化酶1-2。超氧化物歧化酶是一种能专一地清 除超氧离子自由基(O2-)的金属酶,它具有抗衰老、抗辐射、 抗炎抗癌等作用,因而在医药(如关节炎、红斑狼疮等疾病的 治疗3)、化妆品(有防晒抗炎效果4)、食品工业(SOD灵芝菌5 等)等方面具有了广泛的应用前景。 超氧化物歧化酶是广泛存在于生物体内的一种金属酶, 可 催化超氧阴离子自由基(O2-)与H+发生歧化反应, 生成H2O2和 O2。SOD催化下述反应:2H++2O2-→H2O2+O2。

超氧化物歧化酶按照它所含金属离子的不同,可分为 Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体, 呈蓝绿色;Mn-SOD呈紫红色;Fe-SOD呈黄褐色。 SOD提取、纯化制备方法各异, 常用方法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。本实验采用有机溶剂沉淀法8以新鲜猪血为原料,从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法:邻苯三酚自氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。 该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定,酶活性单 位定义为:每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率 达50%的酶量定义为一个酶单位。 样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮 蓝G-250在游离状态下呈红色,与蛋白质结合呈现蓝色。在一 定范围内,溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比, 可用比色法测定,测定范围1-1000μg。 三.实验试剂与器材 1.实验试剂 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝 G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶 液、3mmol/L邻苯三酚溶液等 2.实验器材

浙江大学生物化学丙实验报告.

. 实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 质粒DNA 的微量制备及电泳检测 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习并掌握质粒DNA 的提取原理和方法; 2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作; 3、学习并掌握对电泳检测结果的初步分析。 二、实验内容和原理 1、实验内容 ①质粒DNA 的提取 ②DNA 的琼脂糖凝胶电泳鉴定 2、实验原理 ①质粒: 质粒是一种染色体(核质体)外的寄生性的自主复制子,存在于细菌等细胞中,为双链闭环的DNA 分子,大小在1-200kb 之间,具有自主复制和转录功能, 能表达例如抗性、菌毒素等细胞非必需的遗传信息,但其复制和转录必须要利用依赖宿主细胞(细菌)基因组DNA 编码的一些酶和蛋白质。质粒能够自发的或人为的在细胞间转移,因此是基因工程技术中将外源基因导入受体细胞的重要载体。 ②从细菌细胞中抽提质粒DNA 的步骤: a 细菌培养使质粒大量扩增; b 收集和裂解细胞,并去掉细菌碎片和核质体DNA ; c 进一步除去蛋白、脂类、RNA 等杂质,分离和纯化质粒DNA 。 ③碱裂解法来分离纯化质粒DNA : 在EDTA 存在下,经过SDS 处理使细胞膜裂解,从而使菌体充分裂解,利用在碱性条件下(NaOH ), 使核质体DNA 与质粒DNA 的变性;加入乙酸钾,在中性条件下,核质体DNA 与质粒DNA 又存在复性的差异,质粒DNA 很快得以复性,而细菌核质体DNA 分子难以复性,核质体DNA 会缠绕附着在细胞膜碎片上专业: 农业资源与环境 姓名: 李佳怡 学号: 3130100246 日期: 2015.6.9 地点: 生物实验中心310 装 订 线

浙江大学考研生物化学真题及答案

一是非题1/30 1 酶反应的专一性取决于其辅助因子的结构 2 肽酰转移酶在蛋白质合成中催化肽键的生成和酯键的水解 3 E.coli 连接酶摧化两条游离单链DNA分子形成磷酸二酯键 4 通过柠檬酸途径将乙酰辅酶A转移至胞液中,同时可使NADH上的氢传递给NADP+生成NADPH 5 亮氨酸的疏水性比缬氨酸强 6 必需氨基酸是指合成蛋白质必不可少的一些氨基酸 7 脯氨酸是α螺旋破坏者 8 维系蛋白质三级结构最重要的作用力是氢键 9 在DNA变性过程中总是G-C对丰富区先解链 10 真核细胞中DNA只存在于细胞核中 11 DNA双螺旋的两条链方向一定是相反的 12 酶影响其催化反应的平衡 13 酶促反应的米氏常数与催化的底物无关 14 维生素E是一种天然的抗氧化剂 15 维生素B1的辅酶形式是TPP 16 ATP是体内能量的储存形式 17 糖酵解过程无需氧气的参与 18 胆固醇是生物膜的主要成分,可调节生物膜的流动性 19 蛋白质的生理价值主要取决于必需氨基酸的种类,数量和比例 20 磷酸吡哆醛只作为转氨酶的辅酶起作用 21 DNA复制时,后滞链需多个引物 22 绝缘子和增强子一样都属于顺式作用元件 23 PCR是包括变性,复性和延伸三个步骤的循环反应 24 Sanger曾两获诺贝尔奖 25 核糖体上有三个与tRNA有关的位点:A位点,P位点,E位点 26 生长激素释放抑制因子是一个14肽 27 脂肪酸合成酶催化的反应是脂肪酸-β氧化反应的逆反应 28 镰刀型贫血症患者血红蛋白与正常人的血红蛋白在氨基酸组成上只有2个残基有差别 29 地球上所有生物中存在的蛋白质和核酸的种类总数都超过1亿种 30 中国科学家在今年完成了人类基因组1%的测序任务 二写出下列物质的分子结构式1/6 1 Thr 2 D-核糖 3 A 4 GSH 5 尼克酰胺 6 丙酮酸 三名词解释4/24 1 反密码子 2 操纵基因 3 多肽核酸( peptide nucleic acid ) 4 折叠酶 5 共价调节 6 Humen Genome Project 四综合题10/40 1 试表述Glu经脱氨基,有氧氧化等途径彻底分解成NH3 , CO2, 和H2O 时的代谢路线,要求用箭头表示所经过的主要中间产物.计算1摩尔Glu共可产生多少摩尔的NH3,CO2,ATP? 2 以血红蛋白为例说明蛋白质四级结构的含义,比较血红蛋白与肌红蛋白结构和功能的异同 3 请对中心法则加以阐述 4 凝胶过滤是分离蛋白质混合物最有效的方法之一,请说明其工作原理并简述用该法分离蛋白质的实验操作步骤

浙江大学生物化学丙实验报告1

专业:农业资源与环境 姓名:李佳怡 ____________ 学号:_J6 _______________ 日期: __________________ 地点:生物实验中心310课程名称:生物化学实验(丙) 实验名称:蔗糖酶的提取 一、实验目的和要求(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 七、实验结果与分析(必填) .指导老师:方祥年 成绩:_ _同组学生姓名:金宇尊、鲍其琛 二、实验内容和原理(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 六、实验数据记录和处理 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、 学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法; 2、 巩固理论知识,学会学以致用并发现新问题。 二、实验内容和原理 订 1、实验内容: 线 蔗糖酶的提取、分离纯化 2、实验原理: ① 酵母细胞破碎 液体剪切法―超声波法.机械搅拌法.高压匀浆法 固体剪切法一压力和研磨 非机械法——> 物理法.化学渗透法.酶溶 本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法(研磨)将酵母细胞破碎,把蔗糖酶从酵母细胞中提取岀 来。 ② 蔗糖酶的初步分离纯化 蛋白酶常用的初步分离纯化方法有:盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。 本实验采用选择性变性(加热)、有机溶剂(乙醇)沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯以及收集 样品。 由于一般酶蛋白在常温下分离纯化过程中易变性失活,为了能获得尽可能高的产率和纯度,在提纯 操作中要始终保持酶的活性,如在低温下操作等,这样才能得到较好地分离提纯效果。 实验报告 细 胞 破碎 的 常 用 方 法

三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉10g/组(3?4人) 2、实验试剂 石英砂,95%乙醇(-20*0,20mmol/L Tris-HCl 缓冲液。 四、实验器材与仪器 电子天平(称量干酵母粉):研碎(每组一套):50ml高速离心管(4支/组、4孔50ml离心管架一个/组);托盘天平(离心管平衡用):高速冷冻离心机:恒温水浴箱(50°C);量筒(50ml)、微量移液枪(lOOOu 1)及枪头或移液管(1ml)、玻棒、滴管等;离心管(留样品I、II用)及离心管架:制冰机:一20°C冰箱。 五、操作方法和实验步骤 1、酵母细胞破粹(干磨法) ①称量:称取市售干酵母粉10計约3-5 g石英砂放入研钵 ②研磨(干磨):至尽可能成细粉末状(约15min) ③加液+研磨:呈:取总体积40 ml的20mmol几Tris-HCl缓冲液,分2次加研磨lOmin, 使呈糊状液体; ④离心:将糊状液体转移到2支50ml离心管中,两支离心管平衡后(托盘天平上),离心lOmin (条件:4°C、12000r/min) ⑤收集+测量:收集上淸液并量出体积VI (样品I),另留1ml上淸液(样品I )放置一20°C冰箱保存 用于蔗糖酶蛋白含量测眾、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析 2、热处理 ①水浴热处理:将上步抽提液(样品I),迅速放入50°C恒温水浴,保温30min, 并每隔5min用玻璃棒温和搅拌提取液。 ②冰浴冷却:保温后迅速用冰浴冷却5min ③离心:将热处理后的样品I转移至两支50ml离心管中,平衡后,离心10min a (条件:4°C, 12000r/min) ④收集+测量:收集上淸液并量出体积V2 (样品II),另留1ml上淸液(样品II )放宜一20°C冰箱保存(用于蔗糖酶蛋白含量测左、测左蔗糖酶活力和SDS-PAGE分析。 3、有机溶剂(乙醇)沉淀 ①冰浴:将热处理后的上淸液加入相同体枳的一20°C的95%乙醇,冰浴中温和搅动混匀,

生物化学实验报告

实验一糖类的性质实验 (一)糖类的颜色反应 一、实验目的 1、了解糖类某些颜色反应的原理。 2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。 二、颜色反应 (一)α-萘酚反应 1、原理糖在浓无机酸(硫酸、盐酸)作用下,脱水生成糠醛及糠醛衍生物,后 者能与α-萘酚生成紫红色物质。因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性,故此反应不是糖类的特异反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 莫氏试剂:5%α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g,溶于95%酒精中,总体积达100 mL,贮于棕色瓶内。用前配制。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 1%淀粉溶液100 mL %糠醛溶液100 mL 浓硫酸 500 mL 4、实验操作 取5支试管,分别加入1%葡萄糖溶液、1%果糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液、%糠醛溶液各1 mL。再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂,充分混合。倾斜试管,小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL,慢慢立起试管,切勿摇动。 观察记录各管颜色。 (二)间苯二酚反应 1、原理 在酸作用下,酮醣脱水生成羟甲基糠醛,后者再与间苯二酚作用生成红色物质。此反应是酮醣的特异反应。醛糖在同样条件下呈色反应缓慢,只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时,才呈微弱的阳性反应。实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。 2、器材 试管及试管架,滴管 3、试剂 塞氏试剂:%间苯二酚-盐酸溶液1000 mL,称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL 浓盐酸中,再用蒸馏水稀至1000 mL。 1%葡萄糖溶液100 mL 1%果糖溶液100 mL 1%蔗糖溶液100 mL 4、实验操作

浙江大学生物化学丙实验报告

. 实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理; 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术; 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验内容和原理 (1)实验原理 1、离子交换层析: 以离子交换剂为固定相,液体为流动相进行。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH 值的溶液中,不同的蛋白质所带的电荷存在差异,因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH 改变或者盐的离子强度逐渐提高时,使某一种蛋白质的电荷被中和,与离子交换剂的亲和力降低,不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来,达到分离的目的。 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 电荷基团 反离子 基质 基质 — + — + 可逆交换 可逆交换 溶液中的离子 (交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖) 阳离 阴离子交

由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 缓冲液的环境中,粗分离纯化样品蔗糖酶带负电荷,因此我们用阴离子交换剂达到分离蔗糖酶的目的。 2、酶活力检测(定性检测) 蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),能催化非还原性双糖(蔗糖)裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖。 本实验采用 3.5-二硝基水杨酸法,其原理是 3.5-二硝基水杨酸与还原糖共热(100℃)被还原成棕红色的氨基化合物,在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比,由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。 (2)实验内容 1、离子层析分离纯化实验1中粗分离纯化的蔗糖酶样品Ⅲ; 2、定性检测判断所提取的蔗糖酶纯化样品多少。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ① DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂); ②20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液;

生化实验报告资料

生物化学实验报告 姓名:吴瑞 学号: 3120016004 专业年级: 2012级临床医学(妇幼保健) 组别:第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心

一、实验室规则 1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。 2.进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3.严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。 4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。 5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。 6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7.注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时,管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。 9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。 10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。

浙江大学考博生物化学03-13年试卷

2003年秋 一、名词 变性与复性构型和构象Km 氧化磷酸化脂肪酸ß-氧化核糖体中心法则辅酶与辅基人类基因组计划和后基因组计划分子伴侣 二、论述 1 生物大分子中结构与功能的关系(10) 2 糖酵解过程(10) 3 选择一种分离方法,叙述其原理和操作过程(15) 4 生物化学的最新前沿进展(15) 2004年春 一、名词 ATP 构型和构象Km 分解与合成代谢核糖体中心法则Sanger 反应变性与复性启动子基因表达 二、论述 1.生物中大分子物质构成的基本结构(10) 2葡萄糖转化二氧化碳和水过程中相应步骤和酶(10) 3凝胶电泳的原理及应用(15) 4.生物化学的最新前沿进展(15) 2004年秋 论述 1.蛋白质模体和结构域(15) 2.生物膜结构特征和生物学功能(15) 3.生物体在同化和进化中能量的转化形式与关系(15) 4. DNA复制和转录的原理(15) 5.真核生物基因的表达和表达的调节(20) 6.比较离子交换、分子排阻、和亲和层析的分离原理(20) 2005年春 论述 1蛋白质模体和结构域(15) 2生物膜结构特征和生物学功能(15) 3生物体在同化和进化中能量的转化形式与关系(15) 4 DNA复制和转录的原理(15) 5真核生物基因的表达和表达的调节(20) 6比较离子交换、分子排阻、和亲和层析的分离原理(20) 2006年 论述 1.生物化学研究的内容与目标 2.生物膜及其功能 3.蛋白膜质体与结构域 4.水对生物体的重要作用 5.DNA复制和转录的原理

6.氨基酸以R基分几类,写出其三字母、单字母的缩写 7.比较亲和层析、离子交换、分子排阻的原理 8.举例说明四种非共价键在蛋白质、核酸分子中的作用 9.构型与构象10. 生物体能量转化及其关系 未知年份 论述题 1.双向电泳的原理及步骤 2.单克隆抗体与多克隆抗体的定义 3.生物化学的定义与研究内容 4.蛋白质中二、三结构域的定义 5. DNA 的复制过程 2007年 一、名词解释 氧化磷酸化、折叠、第二信使、沉默子、反义RNA、胴体、一碳单位、别构酶、冈崎片段、基因文库 二、论述题 1.乙酰COA在脂肪氧化中的作用 2. RNA的分离纯化与鉴定 3.乳糖操纵子 4.真核生物基因表达的调控因子及其作用 5.肝糖原的激素影响及分子原理 6.生物重大研究进展与动物科学对其的指导意义 2008 年 论述 1.生物膜的组成及其功能 2.脂类的功能 3.蛋白质合成过程中和DNA复制过程中的化学防错 4.血红蛋白和BPG的结构和功能 5. ATP和NAD+的结构和功能 6.名词解释:糖酵解、乙醛酸循环、卡尔文循环、TCA循环 7.设计动力学试验,验证反应实质 2010年生物化学真题回忆版: 20种氨基酸的分类,简写 实验题2个关于分子实验和蛋白质实验的 电泳的原理和分类层析 化学渗透学说 蛋白组学和研究进展 c3植物和c4植物的区别 G蛋白介导的信号转导机制 生化题都是大题,回忆出大概内容,题目记不住了。 祝大家考博成功!

浙江大学生物化学丙实验报告3、4

实验报告 课程名称: 生物化学实验(丙) 指导老师: 方祥年 成绩:__________________ 实验名称: 蔗糖酶蛋白含量的测定、蔗糖酶活力测定及其分离纯化效果的评价 同组学生姓名: 金宇尊、鲍其琛、袁平、朱耀仁、蔡玉林 一、实验目的和要求(必填) 二、实验内容和原理(必填) 三、实验材料与试剂(必填) 四、实验器材与仪器(必填) 五、操作方法和实验步骤(必填) 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析(必填) 八、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法 ①学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法; ②掌握分光光度法制作标准曲线,准确测定未知样品的蛋白质含量; ③掌握分光光度计的使用方法。 2、蔗糖酶活力测定——3.5-二硝基水杨酸法 ①掌握酶活力测定的基本原理和方法; ②学习酶的比活力的计算。 二、实验内容和原理 1、Folin-酚测定法 Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成,在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用,生成紫红色络合物;乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成,在碱性条件下,铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基(酚基)和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂(乙试剂)产生深蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物),其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm 波长比色测定,适于测定蛋白质含量0.05~0.5g/L 。 优点: 简单、迅速、灵敏度高;反应较稳定。 缺点: 该反应受多种因素的干扰。 2、蔗糖酶活力测定 蔗糖酶(β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26),是一种水解酶。它能催化非还原性双糖(蔗糖)的1,2-糖苷键裂解,将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖(还原糖)。因此,每水解1mol 蔗糖,就能生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法,例如:纳尔逊-索模吉试剂比色法,斐林试剂法等。 专业: 农业资源与环境 姓名: 李佳怡 学号: 3130100246 日期: 2015.5. 26 地点: 生物实验中心310 装 订 线

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