Mayer'苏木素染液(免疫组化)使用说明及注意事项

https://www.360docs.net/doc/4d13879810.html, Mayer'苏木素染液(免疫组化)使用说明及注意事项

货号：G1080

规格：10mL/100mL

保存：室温避光保存，有效期至少一年。

产品简介：

Mayer'苏木素染液(免疫组化)适合免疫组化中组织切片的复染，染色后细胞核呈蓝色。本产品为工作液，可直接使用。染色液可重复使用多次，但染色效果会逐渐降低。

使用方法：

1、免疫组化显色后，将组织切片浸入苏木素染色液，也可以直接滴加到样本上染色

5-10分钟(深染)，或0.5-2分钟（浅染）。

2、浸自来水中冲洗去除多余的染色液。

3、颜色过深可以在分化液（1%盐酸）中分化几秒钟，再用氨水(0.25%)或PBS(pH7.4)

冲洗返蓝，镜下观察结果。

4、染色、分化、返蓝时间都需要预实验优化至最佳，分化和返蓝步骤可选。

5、根据显色液的种类，用水性封片剂直接封片或梯度酒精脱水，二甲苯透明后用中性

树胶封片。

注意事项：

1、第一次使用本试剂盒时建议先取1-2个样品做预实验。

2、室温避光保存，2-8℃保存最佳，至少一年有效。

3、染色过程推荐浅染，通常只需能够分辨细胞核即可，颜色过深有可能影响细胞质颜色。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理：抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤：（以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。

免疫组化抗体手册

免疫组织化学抗体手册目录中间丝细胞角蛋白 AE1/AE3 Cam5.2 MNF-116 34βE12 CK5/6 常见肿瘤中的特殊角蛋白 CK1 CK7 CK8 CK13 CK14 CK18 CK19 CK20

TTF-1，CK7和CK20的表达有助于诊断原发性肺腺癌还是转移性腺癌Vimentin（波形蛋白） Desmin（结蛋白） GFAP（胶质纤维酸性蛋白） Neurofilament proteins（神经细丝蛋白） Acid phosphatase（酸性磷酸酶） Actins（肌动蛋白） Muscle-specific actin（HHF35）肌肉特异性肌动蛋白（MSA）Smooth muscle actin（SMA）平滑肌肌动蛋白 α-actinin（α-肌动蛋白） NPM/ALK（间变性淋巴瘤激酶） AAT、AACT （α 1-抗胰蛋白酶、α 1－抗糜蛋白酶） AFP （甲胎蛋白） α-lactalbumin （α-乳清蛋白） Angiotensin-converting enzyme（血管紧张素-转换酶）Anti- Mullerian hormone（AMH），Mullerian-抑制因子Cyclin D1（PRAD-1，bcl-1,CCND1）细胞周期蛋白D1 bcl-2 Bcl-6

Ber-EP4 Ca15.3 B72.3 (BRST-3) BCA-225 CA125 CA19.9 CEA（CD66e）Cadherins Calcitonin h-Caldesmon S-100 Calponin Calretinin CD1 CD2 CD3 CD4 CD5 CD7

医学检验《基础知识》考试题及答案

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一、A1 1、检测血糖时，实验室多采用血浆或血清而不使用全血的原因是 A、方便于同时检测其他生化指标 B、血细胞的糖酵解作用会使血中葡萄糖浓度降低 C、血细胞中的葡萄糖渗出使血中葡糖糖浓度升高 D、细菌污染使血中葡萄糖浓度升高 E、细菌污染使血中葡萄糖浓度降低【正确答案】 B 【答案解析】由于红细胞内的G-6-PD可促使葡萄糖的酵解从而使血糖浓度降低。 2、与试带法检测白细胞的原理有关的酶是 A、粒细胞酯酶 B、酸性磷酸酶 C、碱性磷酸酶 D、过氧化物酶 E、单核细胞酯酶【正确答案】 A 3、关于免疫耐受的描述，错误的是 A、免疫耐受是机体对抗原刺激表现出的特异性"免疫不应答"现象 B、T细胞和B细胞都可发生免疫耐受 C、免疫耐受机体对任何抗原均不应答 D、免疫耐受具有特异性 E、中枢免疫耐受状态可持续终身【正确答案】 C 4、肾移植进行组织配型.优先考虑的是

A、AB0血型 B、HLA-DR C、HLA-DP D、HLA-A E、HLA-B 【正确答案】 B 5、下列何种疾病使中性粒细胞和单核细胞的调理、吞噬和杀伤能力受损 A、慢性肉芽肿 B、髓过氧化物酶 C、G-6-PD缺乏症 D、Shwachman综合征 E、类白血病【正确答案】 A 【答案解析】慢性肉芽肿属原发性吞噬细胞功能缺陷，其中性粒细胞和单核细胞的调理、吞噬和杀伤能力受损。6、属于Ⅲ型超敏反应的疾病是 A、过敏性支气管哮喘 B、新生儿溶血症 C、接触性皮炎 D、过敏性休克 E、系统性红斑狼疮【正确答案】 E 7、用密度梯度离心法分离的外周血单个核细胞，不含有 A、单核细胞 B、T细胞 C、B细胞 D、NK细胞 E、多形核粒细胞【正确答案】 E 8、补体系统活化替代途径激活物主要是 A、结合抗原后的IgG类抗体 B、结合抗原后的IgM类抗体

免疫组化方法

免疫组化技术及其注意事项一、免疫组化染色前处理技术操作规范 1、取材：理想的取材厚度是0.2cm~0.3cm，大多数实验室都认为组织在加热抗原修复过程中造成脱片的主要原因是取材过厚或脱水浸蜡处理不当所致。良好的取材、固定、脱水过程是免疫组化质控的前提，如果H&E切片都做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起,根本无法保证染色质量。 2、固定：在众多的组织固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛等），不同的实验方法在使用上各有千秋。但在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林是最好、既经济又通用。而含酸或含汞的固定液对抗原保存均不理想。组织离体后固定一般不要超过30分钟，在常温条件下固定时间为8-24小时。同时还要注意避免福尔马林过度固定造成的组织抗原丢失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检测，因为组织固定后会引起蛋白或蛋白分子之间形成交联，导致抗原位点遮盖，可以通过抗原修复方法来修正，若加抗体前不采用抗原修复，则免疫组化染色常不能到达理想结果或不成功。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中，酒精固定后的组织形态不如福尔马林固定的组织.脱钙液对抗原破坏较为严重，因此在组织脱钙前最好在福尔马林液中固定48小时，若组织没有固定透则酸会破坏抗原，脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。 3、浸蜡：我们认为浸蜡温度应控制在58~60℃左右，浸蜡用的石蜡应经常更换，以减少石蜡中二甲苯的含量。高温下的二甲苯容易使组织发脆，细胞收缩，更容易掉片。 4、切片厚度：用于免疫组织化学染色的切片厚度为3-4微米。为防止在染色过程中脱片，需要使用硅化玻片裱片。 5、硅化玻片的制备：载玻片经酸洗冲洗干净后烤干；2%APES丙酮或无水酒精中浸泡1~2min；丙酮或无水酒精洗1~2分钟；蒸馏水浸洗1~2min；烤干备用。 6、烤片：切片在60℃~65℃烤箱中烤片30-60分钟左右。有些实验室采用烤片过夜。有报导烤片温度超过60℃时，烤片时间超过18小时的切片，免疫组化染色强度比烤4小时的切片要略弱。温度过高或时间过长均会影响抗原的活性，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。 7、切片保存：一些实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温

免疫组化染色过程中存在的问题

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。一、无色片染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。二、“杂音”染色片免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色

免疫组化方法(冰冻切片)

免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。

2016病理试题及答案

2016年北京市医师定期考核业务水平测评（病理专业试卷）单位：____________________________________________________ 姓名：_________________ 性别：_________ 身份证号：___________________________________________________________ 分数共120分，75分合格。 A1型题（每题1分） 1.主动脉粥样硬化病变最严重受累的部位是（） A.升主动脉 B.主动脉弓 C.降主动脉 D.腹主动脉 E.胸主动脉 2.心肌梗死最常发生的部位为（） A.左心室侧壁 B.左心室前壁 C.左心室后壁 D.右心室前壁 E.室间隔后1/3A. 3.原发性良性高血压特征性病变是（） A.细小动脉痉挛 B.细小动脉粥样硬化斑 C.细小动脉的硬化 D.细小动脉的纤维蛋白样坏死 E.细小动脉闭塞 4.风湿性心肌炎时，Aschoff小体最多见于（） A.心内膜下结缔组织 B.心肌细胞间 C.心肌间质血管旁 D.心包脏层血管旁 E.心包壁层血管旁 5.动脉瘤最常见的部位是（） A.肾动脉 B.冠状动脉 C.主动脉和脑血管 D.下肢动脉 E.肺动脉 6.以下不属于肥厚性心肌病特征的是（） A.心脏肥大 B.心腔扩张 C.室间隔不均匀肥厚 D.舒张期充盈异常 E.左心室流出道受阻 7.肺腺癌呈阳性的标志物的是（） A.CK5/6、TTF1 B.CK5/6、Napsin A C.Napsin A、TTF1 D.TTF1、P40 E.P40、CK5/6 8.肺鳞状细胞癌呈阳性的标志物的是（） A.P40、CK5/6 B.CK5/6、Napsin A C.Napsin A、TTF1 D.TTF1、P40 E.CK5/6、TTF1 9.小细胞癌细胞核的大小（） A.小于2个静止的淋巴细胞 B.小于3个静止的淋巴细胞 C.小于1个静止的淋巴细胞 D.小于4个静止的淋巴细胞 E.小于5个静止的淋巴细胞 10.肺神经内分泌肿瘤不包括（） A.类癌 B.非典型性类癌 C.梭形细胞癌 D.大细胞神经内分泌癌 E.小细胞癌 11.肺硬化性肺泡细胞瘤的立方细胞和多角形细胞均呈阳性的标志物为（） A.TTF1 B.CK7 C.AE1/AE3 D.Napsin A E.CgA 12.下列哪项不是胚胎性横纹肌肉瘤的好发部位（）

一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项

文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？” 免疫组化王子毛博旁边插话：是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry ），是项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。免疫组化步骤详解免疫组化结果分析很多时候，我们千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10 个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0 分阴性着色，1 分淡黄色，2 分浅褐色，3 分深褐色）

和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。 1.对照染色和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。 2.定位抗原表达必须在特定部位。如LCA 应定位在细胞膜上；CK 应定位在细胞浆内；PCNA 及p53 蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。 3.半定位现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+ ），中++ ），强（+++ ）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和

免疫组化染色操作步骤

免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】

免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）

1月全国自考病理学试题及答案解析

全国2018年1月高等教育自学考试病理学试题课程代码：02901 一、单项选择题(本大题共25小题，每小题1分，共25分) 在每小题列出的四个备选项中只有一个是符合题目要求的，请将其代码填写在题后的括号内。错选、多选或未选均无分。 1.病理学对人体研究的常见三大内容是（） A.尸体解剖、细胞学检查、免疫组化检查 B.活体组织检查、免疫组化检查、细胞学检查 C.细胞学检查、尸体解剖、电子显微镜检查 D.尸体解剖、活体组织检查、细胞学检查 2.严重的细胞水变性进一步发展可发生（） A.凝固性坏死 B.细胞固缩坏死 C.液化性坏死 D.细胞嗜酸性坏死 3.手术伤口一期愈合7天拆线的病理学依据是（） A.表皮再生已完全覆盖创面 B.伤口已收缩变小 C.伤口胶原的含量已达到足够的抗拉力强度 D.创口干燥无渗出 4.低蛋白血症引起水肿的机制是（） A.毛细血管压升高 B.血浆胶体渗透压下降 C.组织间液胶体渗透压升高 D.组织间液流体静压下降 5.下肢静脉内血栓脱落易引起（） A.脑动脉栓塞 B.门静脉栓塞 C.肺动脉栓塞 D.肾动脉栓塞 6.引起炎症的因素中最常见的是（） A.化学性因子 B.物理性因子 C.异常免疫反应 D.生物性因子 7.调理素的作用主要是（） A.增强吞噬细胞吞噬作用 B.增强吞噬细胞消化作用 C.调理炎症介质间相互作用 D.调和细胞免疫作用 8.发生于实质器官的良性肿瘤外观多呈（） A.结节状 B.蕈伞状 1

C.菜花状 D.蟹足状 9.肝活检显示有分泌粘液的腺癌组成的小结节，肝外最可能的原发部位是（） A.肛管 B.结肠 C.膀胱 D.前列腺 10.风湿性心脏病中最常见的联合瓣膜病变是（） A.二尖瓣和三尖瓣 B.三尖瓣和肺动脉瓣 C.二尖瓣和主动脉瓣 D.三尖瓣和主动脉瓣 11.二尖瓣狭窄在临床上可表现为（） A.左心室肥大 B.水冲脉 C.球形心 D.慢性肺淤血 12.后果最为严重的动脉粥样硬化发生于（） A.大动脉 B.小动脉 C.中动脉 D.细动脉 13.小叶性肺炎的病变性质是（） A.化脓性炎 B.肉芽肿性炎 C.纤维蛋白性炎 D.浆液性炎 14.硅肺最常见的合并症为（） A.肺癌 B.肺脓肿 C.胸膜间皮瘤 D.肺结核 15.慢性支气管炎通常合并（） A.小叶中心型肺气肿 B.全小叶型肺气肿 C.小叶周围型肺气肿 D.老年性肺气肿 16.肝硬化晚期出现肝功能不全的临床表现，下列哪项是错误．．的？（） A.蜘蛛痣、肝掌 B.性腺发育 C.出血倾向 D.血浆白蛋白减少 17.消化性溃疡发生在哪个部位易引起大出血？（） A.胃小弯 B.幽门 C.胃底 D.十二指肠球部后壁 18.下列哪一种阑尾炎最易引起阑尾穿孔？（） A.急性蜂窝织性阑尾炎 B.急性单纯性阑尾炎 C.急性坏疽性阑尾炎 D.慢性阑尾炎 19.肾盂肾炎的基本病变属于（） A.纤维素性炎 B.化脓性炎 C.变质性炎 D.急性增生性炎 2

免疫组化步骤

免疫组化实验步骤细胞和组织的固定（一）固定为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大（二）固定剂用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min

↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin

切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结

免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等

2016病理试题及答案

A.CK5/6、TTF1 B.CK5/6、Napsin A C.Napsin A、TTF1 D.TTF1、P40 E.P40、CK5/6 8.肺鳞状细胞癌呈阳性的标志物的是（） A.P40、CK5/6 B.CK5/6、Napsin A C.Napsin A、TTF1 D.TTF1、P40 E.CK5/6、TTF1 9.小细胞癌细胞核的大小（） A.小于2个静止的淋巴细胞 B.小于3个静止的淋巴细胞 C.小于1个静止的淋巴细胞 D.小于4个静止的淋巴细胞 E.小于5个静止的淋巴细胞 10.肺神经内分泌肿瘤不包括（） A.类癌 B.非典型性类癌 C.梭形细胞癌 D.大细胞神经内分泌癌 E.小细胞癌 11.肺硬化性肺泡细胞瘤的立方细胞和多角形细胞均呈阳性的标志物为（） A.TTF1 B.CK7 C.AE1/AE3 D.Napsin A E.CgA 12.下列哪项不是胚胎性横纹肌肉瘤的好发部位（） A.头颈部 B.鼻咽部 C.泌尿生殖道 D.腹膜后 E.大关节周围 13.HMB45表达阴性的肿瘤的（） A.淋巴管平滑肌瘤病 B.黑色素瘤 C.透明细胞肿瘤（糖瘤） D.肾上腺皮质腺瘤 E.大细胞未分化癌 14.继发性肺结核的主要蔓延方式为（） A.血行蔓延 B.淋巴路蔓延 C.气道蔓延 D.沿胸膜蔓延 E.蔓延至心包 15.结节病改变不包括（） A.上皮样肉芽肿 B.结节境界清楚 C.明显纤维化 D.纵隔增宽 E.干酪型坏死 16.过敏性鼻息肉的诊断主要依据（） A.大量嗜酸性粒细胞 B.黏膜水肿 C.出现少数怪异细胞 D.腺体增生 E.纤维化 17.鼻硬结症为（） A.化脓性炎症 B.浆液性炎症 C.纤维素性炎症 D.

免疫组化染色的操作技巧和注意事项

免疫组化染色的操作技巧和注意事项【摘要】目的本院对免疫组化染色过程中存在的问题及对策进行深入的探讨以及仔细的分析。方法自从2010 年6 月~2011 年7 月期间, 本院共收治免疫组化染色标本患者有200 例, 对其中存在问题的60例患者标本进行了仔细的分析, 并且要提出科学的应对措施。结果本院对疫组化染色过程提出了主要的积极应对措施和科学的建议。结论对于每一个步骤以及环节, 都会影响到染色的最终后果, 对此, 要尽量避免在染色过程中会出现一些问题, 会使免疫组化染色的质量有所提高。【关键词】免疫组化；技术方法；质量控制；抗原修复；原因分析对于免疫组化(IHC) 技术在上世纪的80 年代之后, 在我国就迅速的开展, 至今已经有20 年快速发展的历程, 现在已经逐渐的成为病理科工作中主要的组成要素。综合性操作技术主要是导致免疫组化, 这样会使其反应步骤增加, 出现复杂的影响因素, 技术员在基础技术上的操作要求是相对较高的, 对免疫组织学习要进行不断的提高, 了解这种技术在病理诊断方面是主要的辅助方式, 在对疾病诊断、分析、预后以及指导临床个体化治疗等方面, 都有着主要的作用。

在免疫组化的技术方面, 也存在着各种实质性的问题, 收治免疫组化染色标本200 例, 其中有60 例标本存在着问题, 本院对其进行仔细的分析, 并且提出相应的科学对策治疗方式。 1 免疫组化染色不理想的原因分析及改进措施 1. 1 由于大分子的化学结构相对稳定, 它在水中呈现胶状体, 不易被机体破坏或排除, 这样在体内存留时间就很长, 有利于持续刺激淋巴细胞。抗体是人体抵抗感染的一种重要武器, 抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质, 并具有疏水性, 因此当对抗体进行稀释时可降低它的疏水性, 当pH 接近抗体的等电点时, 抗体的疏水性能十分巨大。 1. 2 抗体与抗原的交叉反应抗原是一类能诱导免疫系统发生免疫应答, 并能与免疫应答的产物发生特异性结合的物质；抗体是人或动物受抗原物质刺激后, 由浆细胞合成和分泌的一种特异性蛋白质。组织中其它蛋白质存在相同的抗原, 就能与抗体直接产生反应, 会有其它反应, 临床由于多克隆抗体适应性强, 极容易有交叉反应单克隆抗体也能产生交叉反应, 所以对克隆抗体的应用必须谨慎, 使交叉反应降到最低。 1. 3 抗原修复不足对于固定的组织, 会导致抗原之间有相交的联系, 是抗原决定簇被封闭, 对此, 要尽早的对抗原进行有效的修复。应根据需要进行选择在修复时所用

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#

免疫组化操作流程试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。操作流程免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化：脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟；自来水中浸泡3分钟；

梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020

免疫组化一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机五主要试剂配置: 缓冲液应用液配成1000毫升溶液应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。枸橼酸钠抗原修复液应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。