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第一章绪论

1 ?基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

2?基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现

3 ?基因工程的基本步骤

（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。

（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。

（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。

（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。

4 ?基因工程的意义

（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。

（2）基因工程在工业中的应用：

1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。

2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。或用酿酒酵母生产蛋白质等。

（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。

（4）基因工程在环境保护中的作用：

1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染

2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。

（5）基因工程商业化的发展

第二章基因工程主要技术原理

1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么

质粒的提取和纯化方法

最常用的为碱抽提法：

原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。

步骤：1）溶菌：溶液I （50mM 葡萄糖,25mMTris-HCI, 10mM EDTA,4-5mg/ml 溶菌酶）2）破膜：溶液II （0.2N NaOH 1.0%SDS）

3）中和：溶液III （3M醋酸钠pH4.8）

4）离心

5）转移：将上清转移到一个新的离心管中

6）抽提：酚?氯仿抽提，酚/氯仿/异戊醇一25/24/1

7）沉淀：用0.6倍体积的异戊醇或2倍体积的乙醇（可以加入1/10体积的3M醋酸钱辅助沉淀）

基因组DNA的提取纯化方法

（1）细菌基因组DNA的制备

细胞裂解（10%SDS和蛋白酶K。SDS是阴离子型去垢剂（detergent）,可以使细胞膜崩解。

）-＞DNA纯化（CTAB（十六烷基三甲基漠化鞍）除去多糖，酚■氯仿■异戊醇除去蛋白。

）一〉沉淀DNA （0.6倍体枳的异丙醇或2倍乙醇（可以加入V10体枳的3M醋酸氨辅助沉淀））

（2）哺乳动物细胞基因组DNA的抽提

组织粉碎（动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末；组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。）一〉细胞裂解（0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50°C温育。）一＞沉淀DNA （用2倍体积的无水乙醇或0.6倍体积的异丙醇。（加入V10体积的3M醋酸氨可以辅助沉淀）。）

（3）从植物组织小制备DNA

组织粉碎（用液氮冷冻后研磨成细粉末。）一＞细胞裂解（用2%CTAB/2-ME （十六烷基三甲基漠化鞍Q藐基乙醇）或1% SDS和蛋白酶K。65 °C温育。）一〉沉淀DNA （用0.6倍体积的异丙醇（-20°C）o （可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀））

2. DNA的定量和纯度测定方法

（1）紫外光谱法：DNA在260nm波长处有特异的紫外吸收峰，蛋白质在280nm波长处有特异的紫外吸收峰，对于纯DNA： OD260/OD280=1.8,若低于1.8说明有蛋白质杂质

（2）琼脂糖凝胶电泳估计

澳化乙锭（EB）能插入DNA分子中。与己知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。

3?琼脂糖凝胶电泳基本原理及应用

原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。在生理条件下, 核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）o将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极一正极移动。相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开放开环状最慢。

琼脂糖凝胶电泳的应用：用于対DNA分子量的估计，DNA片段的分离和回收。

4?聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N】，N1- methylene bisacrylamide）?催化剂的作用下聚合而成。引发剂：过硫酸鞍，加速剂：TEMEDo 电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。凝胶浓度越大，空隙越小。电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片。5?核酸杂交原理、类型及应用

原理：核酸分子杂交技术是依据核酸分子碱基互补、变性和复性原理，用标记的己知序列的单链核酸片段（DNA或RNA）作为探针，与未知的核酸片段进行杂交，形成异源性杂交分子，然后通过标记信号的检测，鉴定样本中是否存在与探针互补的靶序列DNAo包括：DNA-DNA 杂交、DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。

特点：特异性高；灵敏度高；定位准确

应用：基因克隆的筛选；酶切图谱制作；基因组中特定基因序列的定量和定性检测；基因表达的分析；基因突变分析；疾病的诊断、微生物病原体检测。

变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的盘键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。

A260值达到最人值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm）,此时50%的

DNA分子发生了变性。Tm与核酸的G、C含量有关。

Tm= （G+C） % X 0.41+69.3

Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。

复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30°C时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。

预杂交：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂前的这些处理过程称为预杂交

类型：根据核酸的来源、种类和形式分为Southern blot, Northern blot,菌落原位杂交，斑点杂交，组织原位杂交

Southern blot：DNA分子一〉限制性酶切为限制片段一〉琼脂糖凝胶电泳一＞NaOH变性一＞转膜固定一＞杂交一〉显影

Northern blot：提取T＞ Cell总RNA一＞提纯分离mRNA—＞琼脂糖凝胶电泳分离RNA—＞转移至硝酸纤维素膜一＞杂交检测

斑点杂交：其原理与步骤与Southern印迹杂交相似，所不同的是不进行核酸的酶解和电泳分离，直接将变性的DNA或RNA加到固相载体上。

菌落/噬菌斑原位杂交：直接将菌落（噬菌斑）原位转移到固相载体上，不必进行核酸的分离纯化、酶解和电泳分离。溶菌（噬菌斑）变性后直接进行特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术，结果直接找出相应的阳性重组子菌落（噬菌斑）。

组织/细胞原位杂交：用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞、组织、染色体或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA 杂交。

基因芯片：基因芯片是指将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。

6. PCR概念、PCR技术的基本原理及特点、引物设计要求及常见问题

PCR概念：应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。

PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核葫酸引物。PCR由变性??退火??延伸三个基本反应步骤构成。变性：升高温度使模板DNA 变性、双链分开。退火：再降低温度使引物与模板DNA配对互补结合。延伸：然后升温到聚合酶反应适宜的温度，此时在聚合酶催化下，从引物3,轻基端开始，与模板DNA±的碱基配对逐个加上核昔酸，合成新的DNA链。循环：其后再按高温变性、低温退火、适温合成三步反复循环，新合成的DNA在下一循环屮又作为模板使用，每循环一次，合成的目的序列扩增一倍。经过多次循环使DNA 含量显著提高。

特点：灵敏度高、特异性强、快速检测、定量准确、重复性好

特异性强PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

引物设计要求：

?引物长度（length） : 20?30bp

?G+C含量以40-60%为宜

?两引物间不能有互补序列，尤其是才端

?引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性

?引物的3,末端碱基一定要与模板DNA配对

?可以在5,末端加上限制性内切酶位点或起始密码

?解链温度（Tm）：两引物间相差不大于5°C

?引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在

?ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘿吟或喀喘核背酸的成串排列

常见问题：

（1）假阴性

原因：模板质量不好；酶失活；引物特异性差或质量问题；Mg2+浓度过高

对策：重新進备模板；更换酶并避免反复冻融；重新设计引物并分装；降低Mg2+浓度

（2）假阳性

原因：引物设计不合适；靶序列或扩增产物的交叉污染

对策：重新设计引物；改进操作，避免污染

（3）出现非特异性扩增带

原因：是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体；是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关；酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增

对策：重新设计引物，降低引物暈；适当提高退火温度，减少循环次数:减低酶量或调换另一来源的酶

（4）出现偏状拖带或涂抹带

原因：酶量过多或酶的质量差；dNTP浓度过高；Mg2+浓度过高；退火温度过低；循环次数过多引起

对策：减少酶量，或换另一种酶；减少dNTP的浓度；适当降低Mg2+浓度；提高退火温度; 减少循环次数。

7. RT-PCR、DD-PCR、PCR-SSCP、实时荧光定量PCR原理及应用

RT-PCR：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。DD-PCR：利用T12MN（M为A、G、C, N为A、T、G、C）为锚定引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA,通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。用于基因表达，基因的鉴定物克隆，分离差异表达基因。

PCR-SSCP：单链PCR构象的多态性，单链DNA片段呈复杂的空间折壳构象，这种立体结构主要由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因为，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以非常敏锐的将构象有差异的分子分离开。用于进行D7A多态性的分析，是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变、短序列的缺失和插入的方法。

实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。用于DNA或R\A的绝对定量分析，基因表达差异分析，基因分型等。

8. RACE原理及应用

RACE： rapid amplification of cDNA ends

以mRNA为模板，反转录合成cDNA的第一条链,然后用PCR技术扩增出从某个特定位点到3,

或5'端之间的未知核昔酸序列，因此分为3' —RACE和5' —RACE （特定位点是指cDNA 内位

点，3'或5'端是针对mRNA而言）。3' -RACE：扩增特定位点到相应mRNA3,端的序列，可利用mRNA的polyA尾和GSP进行PCR. 5' —RACE:扩增特定位点到相应于mRNA5,端的序列，通过对cDNA第一条链同聚物加尾，再利用与同聚物配对的引物和GSP进行PCR. 应用：获得完整

的cDNA的3,或5,端序列。

9. Sanger双脱氧链终止法、Maxam-G订bert化学修饰法的原理

Sanger双脱氧链终止法原理：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DM互补链。该酶能够用2 3' -双脱氧核苜三磷酸（ddNTP）作底物并将其聚合到新生寡核苜酸链

的3末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA,引物（特异性引物, 如T7, T3, M13 等），DNA 聚合酶，dATP, dTTP, dGTP, dCTP 和一种ddNTP。常用KI enow 大片段，无5'-3'外切酶活性。

Maxam-Gilbert化学修饰法的原理：用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列n二1）,经过PAGE和放射白显影后，可以直接读出DNA的顺序。

10. 杂交测序的原理与过程

原理：SHB将寡核昔酸探针固定到芯片上，待测样品中的标记DNA靶标与之配对，当配对的DNA有少至1个碱基的差异时，其Tm值的改变影响到杂交时的荧光信号值，从而可以判断待测样品与芯片上哪个片段结合，便可知待测的D7A序列上特定位点的碱基特征。

11. 酵母双杂交系统原理、应用

原理：转录激活因子结构域功能独立性。真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。酵母的转录激活因子GAL4的N端l-147aa是DNA结合域（BD）, 其C端768-881aa是转录激活域（AD）oBD "J以和上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）结合，而AD则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的BD不能激活基因转录, 单独的AD 也不能激活UAS的下游基因，它们Z间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别克隆到不同的载体上, 导入同一细胞株屮表达。

应用：1）己知蛋白之间相互作用的检测：

2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检

测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸；

3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵〃表达质粒, 将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成〃猎物〃基因库，共转化酵母细胞，

可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列。

第三章基因工程的酶学基础

1.常用工具酶种类

工具酶：用于D7A和R7A分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酚系统。

2.

I型限制性内切酶

识別位点序列：未甲基化修饰的特异序列。

切割位点：在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随即切开一条单链。在基因工程操作中的用途不大。

II型限制性内切酶

识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列），与DNA来源

无关。

切割位点：就是识别位点处。切开双链DNA,形成粘性末端（sticky end）或平（齐）末端（blunt end）o粘性末端分为5'端凸出（如EcoRl切点）和3'端凸岀（如Pstl切点）。

在基因工程操作过程中作用广泛。、

特殊性质的II型限制酶：同裂酶，同尾酶，可变酶（识别顺序中的一个或几个碱基是可变的, 并且识别顺序往往超过6个碱基对。）

m型限制性内切酶

在完全肯定的位点切割DNA,距识别序列下游24-26bp处，但反应需要ATP、和SA\1（S- 腺苻蛋氨酸）。

在基因工程操作中用途不大。（EcoPl, EcoP15）

3?限制与修饰

Luria和Human发现细菌能将外来的DNA片段在某些专一位点上切断，从而保证其不被外来噬菌体所感染，而其自身的DNA由于被一种特殊的酶所修饰（甲基化）而得以保护，这种寄主

控制的现象叫做限制一修饰（简称R/M体系）。

4. 同裂酶、同尾酶

同裂酶（isoschizomer）又称异源同序酶或异源同工酶。是从不同的原核生物中分离出來的不同的酶，能识别相同序列，在切割DNA时，其切割位点可以是相同的，也可以是不同的。包括同识同切（女D Ahalll&Dral）同识异切（如Kpnl&Asp718l）o

同尾酶：指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端（如Mbol&BamH l&Bgl ll）o

5. 双酶切策略

?选用都合适的Buffer

?对盐浓度要求不同的酶，使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解

?低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切

?一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切

注意事项

а.取少量酶（方法or稀释）b.最后加酶、尽快操作c.减少反应体积

d.反应时间的延长

e.分装（对于多个反应）

反应温度

大多数为37°C；一部分为50-65°C 少数25-30°C；高温作用酶于37°C时活性多数10-50% 反应时间

lhr or more许多酶延长其反应时间可减少酶的用量

反应终止

EDTA 终10mM；加热（37°C 酶65°C 20min, otherwise 80°C 20min）б.星活性、引起星活性的因素

星活性（star activity）：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星活性。（非特异性切割）

引起星活性的因素

①高浓度甘油（＞5%）

②酶过量（＞100U/|ig）

③低离子强度（＜25mM）

④高pH （＞pH8.0）

⑤有机溶剂

PMSO（二甲基亚飒）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide）＞ sulphalane

⑥用其它二价阳离子代替Mg2+

Mn2+, Cu2+, Co2+, Zn2+

7. 连接酶的使用时的注意事项；

DNA连接酶：能够将DNA链上彼此相邻的3' -0H和5, -P,在NAD+或ATP供能的作用下, 形成磷酸二酯键。只能连接缺口（nick）,不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DM分子的一部分。

两种DMA连接酶

①大肠杆菌连接酶：粘性末端，平末端（效率低）

②T4噬菌体的连接酶：粘性末端，平末端

连接条件

①必须是两条双链DNAo

②DNA3'端有游离的-0H, 5'端有一个磷酸基团

（P）o

③需要能量：动物或噬菌体中是ATP,大肠杆菌中是NAD+。

连接反应的温度：

连接缺口的温度：37°C连接粘性末端的最佳温度：4?15T实用温度：一般采用14-16°C 影响连接反应的因素：

1. 插入片段与载体的浓度比例

3~10倍，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。

2. 末端种类

3. 反应体系

平末端DNA分子的连接反应屮，最适1?2个单位。

粘性末端DNA片断Z间的连接，酶浓度0. 1个单位。

ATP 的用量10 umorimmol/L 之间

8. 粘性末端DNA片段的连接、平末端DNA片段的连接方法；

粘性末端DNA片段的连接：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性核酸内切酶切

割的，连接后仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。如果是用两种同尾酶切割的，虽然产生相同的互补粘性末端，可以后效的进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性内切酶的识别序列。

连接过程为：在灭菌的Eppendorf管中依次加入7山ddH2O ,2山T4 DNA连接酶反应缓冲液或

E.coli DNA连接酶反应缓冲液,10pl两种待连接的DNA片段,最后加入1山T4 DNA连接酶或E.coli DNA连接酶，总体积为20心充分混匀后12° C放置过夜，然后检测。

平末端DNA片段的连接：待连接的两个DNA片段的末端如果是用同一种限制性核酸内切酶切割的，连接后仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，有时还出现另一种新的限制性内核酸内切酶识别序列。如果用两种不同的限制性核酸内切酶切割后产生的平末端DNA片段之间进行连接，连接后的DNA分子失去了那两种酶是识别序列。

具平末端的DNA片段Z间连接反应的操作过程基本上同具粘性末端DNA片段Z间连接的操作过程，但是一般只用T4 DNA连接酶，且需要加大酶用量。

?加大连接酶用量(10倍大于粘性末端的连接)

?加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

?加入10%PEG8000,促进大分子Z间的有效作用

?加入单价阳离子(NaCI),最终浓度150-200 mM

9.大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow fragments T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、修饰过的T7 DNA 聚合酶、逆转录酶、Taq DNA聚合酶主要应用

以上七种都属于DNA聚合酶：把脱氧核糖核昔酸连续加到双链DNA分子引物链的3，?OH末端，催化核昔酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离。

大肠杆菌DNA聚合酶I :

性质①一条单链多肽(109kDa)

②5J3,外切酶活性位于N端。

③DNA聚合酶活性

④3，T5,核酸外切酶活性

用途

方法：主要用来制备带放射性标记的DNA探针。切口平移法标记DNA (nick translation )

Klenow fragment：

性质：?DNA聚合酶I的酶解片段

②具有5J3, DNA聚合酶活性和3J5,核酸外切酶活性(弱)，失去了5J3,外切酶活性。用途：3,端补平；DNA3,末端标记；cDNA第二条链的合成。

T4 DNA聚合酶

性质

①来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞114RD

②酶活性：有聚合酶活性和3，T5,外切酶活性

(降解单链更快)

用途

①补平M隐蔽末端

②DNA3,末端标记

T7 DNA聚合酶

来源T7噬菌体感染的大肠杆菌细胞，rh两个亚基组成：

①大亚基：有5J3,聚合酶和3J5,外切酶活性；

②小亚基：硫氧还蛋白，可增加大亚基对模板的亲

和性。

用途

①长模板的引物延伸

②进行末端标记：取代合成法标记3,末端。

与T4 DNA聚合酶相同。

③补平隐蔽末端：合成补平3,隐蔽末端；

水解修平3,突出末端。

修饰过的T7 DNA聚合酶

? T7DNA聚合酶的化学修饰

去除3，T宁外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提

高了3倍。

?修饰后的T7 DNA聚合酶的用途

①DNA测序：双脱氧法。

②标记DNA3,隐蔽末端

③更有效地补平末端

逆转录酶

依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。

来源：RNA肿瘤病毒，普遍使用的是鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV）

用途：合成cDNA:以oligodT为引物（与mRNA的polyA尾互补结合）

Taq DNA聚合酶：

是从Thermss aquaticas菌提収的热稳定性酶，分子量大约为94KDa,这种酶的天然形式可在74° C 复制DNA,在95°C的半衰期为40分钟。Taq DNA聚合酶在镁离子存在的条件下可催化核昔酸沿宁3方向发生聚合反应，形成双链DNA,同时还有5-3外切酶活性。可用于PCR反应，和较高温度条件下的引物延伸反应。

10.末端脱氧核昔酰转移酶、T4磷酸激酶、碱性磷酸酶、DNA及RNA的修饰酶主要应用。末端脱氧核昔酰转移酶（TdT）

?来源：小牛胸腺。

?功能：在二价阳离子存在下，5，T3，DNA聚合酶活性。

T C T首选Co2+ A, GT首选Mg2+

?特点：

①需要3，-0H

②不需要模板

③底物可以是单链DNA、3-0H突出的双链DNA、

平末端在Co"代替M产下也可以

④随机添加dNTPs,如果只有一种dNTP,就添加

上同聚物

用于：在3,末端添加同聚物，形成粘性末端，用于DNA连接

T4磷酸激酶

来源：T4感染大肠杆菌细胞，多种哺乳动物细胞屮也发现

这种酶。

功能:

?Y磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5—0H端，不

论5-0H端突出与否。

?如果ATP的丫磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5,端。

*：高浓度ATP发挥最佳活性，NH4+强烈抑制剂

用途；

DNA 5-0H端磷酸化、标记DNA的5端。

宁凸出单链效率高

碱性磷酸酶

?种类

(1) 细菌性碱性磷酸酶Bacterial alkaline phosphatase,

BAP 从大肠杆菌屮分离出来，具有抗热性。

(2) 小牛肠碱性磷酸酶Calf intestinal alkaline

phosphatase, CIP

从小牛肠屮纯化出来，SDS屮加热68°C可完全失活或

通过酚抽提而并行失活。

CIP比BAP更常用，活性比BAP高10-20倍

?功能

催化脱掉DNA (或RNA) 5,端的磷酸根

防止单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接的现象。

核酸外切酶

包括单链DNA外切酶，双链核酸外切酶

双链核酸外切酶

(1)核酸外切酶山：在DNA双链的末端产生出单链区域

(2)入核酸外切酶：使DNA双链变成单链(短)。

单链DNA内切酶

A. S1核酸酶

(1)定位RNA。(2)用mRNA测定基因屮的外显子序列

(3)降解限制酶切形成的单链突出端(4)切掉双链核酸中的单链区

B. Bal 31核酸酶

降解双链DNA或其上的单链缺口、未配对的单链区域。

C. 绿豆核酸酶

与Sin uclease相似，但比SI更温和，在大切口上才切割，可使DNA突出端变成平端

D. 核糖核酸酶AfRNase A)

除去DNA样品屮的RNA；除去DNA:RNA屮未杂交的RNA区

确定杂交体DNA的RNA中单突变的位置

E. 核糖核酸酶H(RNase H)

在cDNA克隆，合成第二键之前去除RNA；用脱氧核甘酸指导在特异位点切割RNA

分析体外多聚腺卩票吟反应的产物，在与0lig(T) or ploy (dT)杂交后，去掉poly(A)尾

F. DNase I

切口平移标记，在dsDNA ±随机产生切口；在闭坏DNA上引入单切口以使分子截短(在亚硫酸氧盐介导的诱变前)；建立随机克隆，以便安插在M13 phage上测序分析；蛋白:DNA 复合物(DNA酶足迹法)；除去RNA样品中的DNA (RNase-free)

RNA 聚合酶(RNA polymerase)

①体外：

?将这些RNA聚合酶特异性的启动子安装在载体，如PGEM-3Z载体（2.74kb,pl3）屮，用于体外转录（合成）与外源DNA同源的RNA,

?从而用作杂交探针，体外翻译系统中的mRNA,体外剪接反应的底物

②体内：用于表达外源基因

第四章基因克隆的载体

1 ?载体的概念

在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体

2. 理想载体至少必备的条件

①能在宿主细胞中自主复制②容易进入宿主细胞③容易插入外來核酸片段

④容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作⑤具有合适的筛选标记

⑥具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）

3. 目前的主要载体种类

质粒（Plasmid）、单链DNA噬菌体九噬菌体的衍生物、柯斯质粒（Cosmid）

动物病毒（virus）、细菌人工染色体（BAC）、酵母人工染色体（YAC）

4. 质粒

Plasmid独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。

5. 质粒的生物学基本特性

（1）自主复制性：携带有自己的复制起始区（ori）它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制。

（2）生物不相容性（Incompatibility ）：有时不同的质粒可同时共存在于一个细菌内，但同群质粒（不同的，但亲缘性高）不能共存于同一细胞，这种现象称为质粒的不相容性。

（3）可转移性部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一细胞转移至另一细胞中。

（4）稳定性质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。

（5）寄生性质粒只能在宿主的细胞内复制

（6）表现型不同的质粒有不同的表型，如对抗生素的抗性等

（7）可扩增性

（8）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA±往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状

6. 质粒类型

（1）按转移性分

革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：

接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col> R质粒等

非接合型质粒非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用。

（2）按复制机理分：严紧控制型质粒，松弛控制型质粒。

严紧型复制质粒（stringent plasmid）

严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，复制随细菌染色体的复制同步进行。松弛型复制质粒（relaxed plasmid）

松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制，独立于细菌细胞而自主复制。

一般作为载体的质粒应该是松弛型的

（3）按功能分：

F质粒、R质粒、Col （colicin）质粒（可产生大肠杆菌素）、Ent质粒（可产生肠毒素）。

7. 质粒载体中pBR322、pUClfi/19等常见的载体的构建及特点

（1）加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因。

（2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

（3）缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量。

（4）改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数。

（5）加装特殊的基因元件。

PBR322特点：4.3kb ；松弛型

内含一个（Ori）、一个抗氨节青霉素（Ampr）和一个抗四坏素（Tetr）标记基因，在Ampr 中有两个内切酶位点（Pstl、Pvul）,在Tetr中有三个内切酶位点（EcoRV、BamHK Sall）。拷贝数50-100/cell；用于基因克隆

PUC1&19 特点：

①复制起点：PBR322的ori

②Ampr基因：pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。

③lacZ'基因:大肠杆菌lacZ的％肽链序列，是LacZ的氨基端片断。在lacZ基因中有一段人工合成的含多种内切酶的单一切点，在此位点上插入外源DNA都能灭活下游lacZ基因。用于基因克隆和测序

蓝白斑筛选的原理：受体菌lacZ突变：缺失a肽。载体lacZ啲a互补：质粒载体上的lacZ，编码a肽，与这个缺失突变的A半乳糖背酶“互补”，使它能形成4聚体，又能分解Xgal, 产生蓝色物质。IPTG诱导结果：MCS无插入时，互补，蓝菌斑；MCS有插入时，不互补，白菌斑。挑选有外缘DNA插入的质粒转化的受体菌。

8. 单链DNA噬菌体的特点

?+DNA （ssDNA）o

?复制型（RF）是双链环状DNA。

?RF DNA和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑。

?包装容量较大。

?可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。

9. M13系列载体的优点

（1）有MCS,便于克隆不同的酶切片段

（2） M13重组分子筛选简便一一被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易

于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。

（3） Xgal显色反应，可供直接选择

（4）克隆能力大

（5）可以克隆双链DNA分子中的每一条链。子代M13噬菌体中包含的是单连+DNA。

10. T载体特点

（1）MCS的中部已经被切开，各有一个3,端突出的T。

（2）PCR产物往往在3,端突出一个A,所以能与这个载体直接连接。

（3）克隆的PCR产物能被两侧的EcoRI切下來冋收。

（4）含有G418抗性，可在真核生物中表达。

（5）T载体的克隆过程简便。

□?入噬菌体的生物学性质，插入型载体和置换型载体，入噬菌体的体外包装。

入噬菌体的生物学性质：生物结构

（1）X噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体

（2）入噬菌体由外壳包装蛋白和X-DNA组成

（3）X-DNA为线状双链DNA分子，全长48502个核昔酸，两端各有一个12核昔酸的互补单链，称为cos区。

（4）X-DNA上至少有61个基因，左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞、DNA 自主复制以及调控基因，屮间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因。

人工构建的入噬菌体载体有两种类型：

（1）插入型载体：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cl基因）内。插入型载体长度36.4kb,插入片段长度0-14.5kbo

选择标记：插入导致载体不能合成阻遏物，入载体DNA不能进入溶原期，受体菌全部裂解, 形成清晰的噬菌斑，没有外缘DNA插入的入载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。

B-半乳糖昔酶失活型载体：在入基因组中引入了LacZ，序列，釆用蓝白斑筛选。

（2）替换型载体：两个多克隆位点区以方向重复形式分别位于入DNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下來，与用同样酶切成的外缘DNA片段置换。载体长度

26kb,插入片段长度10.4-24.9kb.

A噬菌体的体外包装

?X-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞?用于体外包装的蛋白质可直接从感染了入噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：

? 一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组X-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组X-DNA 污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。

12. 粘粒即cos质粒的生物学性质

①具有入噬菌体的特性

在寄主细胞内形成环化DNA 不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌

克隆后可以体外包装成噬菌体颗粒。

②具有质粒载体的特性

能象质粒一样复制。

③方便的选择

有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。

④高容量的克隆能力

45kb （最少不能低于30kb）o

51kb-5kb=45kb

13. BAC、YAC主要元件

YAC载体应含有下列元件：

酵母染色体的端粒序列（TEL）；酵母染色体的复制子（ARS）；酵母染色体的中心粒序列（CEN）；酵母系统的选择标记；大肠杆菌的复制子；大肠杆菌的选择标记；YAC载体的装载量为350-400kb BAC主要元件：

细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，包插大肠杆菌的复制子, 大肠杆菌的选择标记

14. 动物病毒载体（反转录病毒、腺病毒）特点

反转录病毒：

（1）属于正链RNA病毒，显著的特点是具有2倍体基因组。

（2）病毒RNA经反转录产生双链DNA分子，可整合到染色体DNA ±成为原病毒，随染色体DNA 进行复制、转录和翻译。

优点：

（1）可将DNA插入宿主基因组的随机位点上。

（2）侵染范围广、感染率高，几乎大100%o

（3）整合的原病毒在宿主基因中比较稳定，拷贝数目较低，一般只有一个拷贝。

（4）包装的外源DNA可达lOKbo

（5）反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性。一般只感染处于分裂状态的细胞。腺病毒：

?线状双链DNA病毒，基因组中有14个基因。

?共同特点是都带有倒置的末端重复序列（ITR）,在病毒的复制过程中起非常重要的作用。优点：

（1）比较安全，无致病、致癌、致畸作用。

（2）宿主范围广，不仅能感染有分裂能力的细胞，也能感染不能分裂的细胞（如神经细胞）。（3）可以在呼吸道和肠道中繁殖，可以通过口服或喷雾的方式感染。

（4）载体中的插入片断可达7.5kb （有包装容量限制）。

（5）腺病毒容易制备、纯化。

（6）基因组结构和功能了解得清楚。

15. 打靶载体筛选原理

基因打靶载体中含有抗G418的基因，胸腺激酶基因（tkl&tk2）, TK能把9■鸟瞟吟转化成有毒的化合物，从而杀死宿主细胞。在载体整合过程中，非特异整合时，两个tk基因至少有一个可能整合到基因组里，细胞被tk基因杀死。当特异位点整合时，只有目的基因和抗G418 基因整合进去，tk基因不会整合，细胞在G418中存活。

正选择（positive selection）,用G418进行选择。没有整合进门eor基因的细胞都被杀死。负选择（negative selection）,用9?鸟卩剽令（ganciclovir, GCV）。表达胸昔激酶（Tk）的细胞都被杀死

第五章目的基因的克隆与基因文库的构建

1?目的基因：欲分离、改造、扩增或表达的基因。

2. 化学法合成目的基因

a. 小片段粘接法

?根据目的基因全序列，将目的基因分成若干12-15碱基长的小片断，两条互补链分别设计成交错覆盖的两套小片断。

容易在退火时发生错配

b. 补钉延长法

将目的基因的一条链分成若干40-50碱基的片断，另一条设计成与之交错互补的

c. 大片段酶促法

根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱慕长的单链DNA片段，拼接模块数大幅度减少, 适合较大的基因合成。

3. PCR技术在基因克隆方面的应用：

（1）目的基因的直接克隆

适合扩增原核生物基因。真核生物基因组含有内含子

（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆

适合扩增真核生物基因（原核生物不易得到mRNA,也不含有polyA尾）。

（3）制备DNA探针，进行分子检测等。

4. RT-PCR

mRNA差异显示PCR：

（1）3,端的锚定引物:Oligo （dT）引物的3,端加两个核昔酸（NM,N:A/G/T/C,M:A/G/C）,扩增第一链。

（2）宁端的随即引物：10个核昔酸，扩增第二链。

（3）随机引物与锚定引物成对扩增

引物组合：12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。

实验结果：在测序胶上，每组扩出50-100条长度为100-500bp的带。240组则能分出20000 多条带！

如果每条带相当于一种mRNA, 20000 mRNA基本上反映了一种特定细胞中全部的mRNA。

（4）随机-锚定引物PCR的产物电泳比较

不同组织的240组引物组合PCR产物在测序胶中电泳，选择有差异的带，进一步PCR作探针。

5 .基因文库构建的基本程序

基因文库：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。

程序：

（1）染色体DNA大片段的制备

断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。

①物理切割法：超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。

②酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。

（2）载体与基因组DNA大片段的连接

直接连接、人工接头或同聚物加尾。

①粘性末端直接连接：载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如: Sau3A与BamHI的輛切末端。

②人工接头法（adapter）：人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向

公司定做或购买。

③同聚物加尾

（3）将重组子导入到相应的宿主细胞保存和扩增。

6. CDNA文库构建的基本程序，基因文库的类别

cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞屮进行保存和扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织的cDNA 文库。程序：

（2）总RNA （total RNA）提取

提取总RNA有商业化的试剂盒(kit)

(2)mRNA的分离纯化

原理:利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA (rRNA、tRNA等)中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%?2%。mRNA的分离纯化:分离mRNA用商业化的Oligo dT 纤维柱。

(3)cDNA 合成

A. cDNA第一链合成：用Oligo dT作引物，逆转录酶合成cDNA的第一链。

B. 降解mRNA模板：用碱处理或用RNaseH降解Mrna?DNA杂交分子中的mRNA。

C. cDNA第二链合成：剩下的cDNA单链的3,末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构，可称

为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。

D. 去掉发卡结构：用核酸酶S1可以切掉发卡结构。

(4)cDNA与载体连接：

A. 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。

B. 借助末端转移酶给载体和双链CDNA3,端分别加上几个C或G,成为粘性末端。

(5)导入细菌细胞中进行保存和扩增。

7?应用差别杂交或扣除杂交法构建cDNA文库。

差别杂交原理：需要拥有两个不同的细胞群体，在一个细胞群体屮目的基因能正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下，分别制备两种不同细胞群体mRNA提取物，其屮一个群体含有一定比例的目的基因mRAN,另一个群体不含有目的基因mRNA。以这两种总mRNA为探针，分别对由表达冃的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选。当以目的基因表达的mRNA群体为探针时，所有包含重组体的菌落都成阳性反应，在X底片上呈现黑色斑点；而以目的基因不表达的mRNA群体为探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在x线底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。

第六章基因的重组与转移

1.DNA片段的体外连接方法

(1) 粘性末端的连接：用T4或大肠杆菌连接酶，包括两段DNA的连接、DNA片段与载体的连接。

(2) 齐平末端的连接

①同聚加尾法形成"粘性末端“

②衔接物(linker)连接：在平末端DNA两段加衔接物，再用相应的酶酶切，得到粘性末端

③DNA接头(adapter)连接法：用T4连接酶间接DNA接头，使DNA具有粘性末端。

(3) PCR产物的连接

①在引物的宁端设计酶切位点：得到两端带有酶切位点的PCR产物，然后用相应的酶酶切, 两头各有一个粘性末端。

②与T载体直接连接：用Taq DNA聚合酶

2 ?感受态

Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液品结构，后者经热脉冲发牛收缩作用，使细胞膜出现空

隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态

3?重组DNA转入大肠杆菌的方法

(1)转化(transformation)：以质粒为载体，将携带外源基因的载体DNA导入大肠杆菌的过程。

(2)转染(transfection):以噬菌体为载体，用DNA连接酶使噬菌体DNA环化，再通过质粒转化方式导入大肠杆菌的过程。

（3）转导（transduction）:以噬菌体作为媒介讲一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受体）的过程。

4?重组DNA导入植物细胞的方法

①叶盘法（leaf disk）：由根癌农杆菌介导（agrobacterium tumefaciens ）（Horsch 等,1985）：根癌农杆菌屮存在Ti质粒，将外源基因插入Ti质粒后构建的重组Ti质粒转化土壤农杆菌，后者是植物的易感菌，与叶盘共培养后可进入植物。

②电击法（electroporation）：短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差使细胞穿孔，使DNA扩散进细胞。

③基因枪法（gene gun）又称高速微型子弹射击法（High-velocity microprojectiles）

5?重组DNA导入哺乳动物细胞的方法

①磷酸钙沉淀法

原理:磷酸盐缓冲液与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成极微小的磷酸钙-DNA复合物沉淀，后者吸附到细胞膜表面，被内吞。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。

特点:不需要载体。

②脂质体（lipofectin）载体法

脂类包埋DNA,通过细胞膜进入细胞。

脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）

③显微注射法（microinjection）

直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。

④DEAE-葡聚糖传染法：二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。

第七章重组子的筛选和鉴定

1?重组子的筛选和鉴定

重组子的筛选和鉴定是方法：

（1）抗药性标记插入失火选择法、B -半乳糖昔酶显色反应选择法以及根据插入序列的表型特征选择重组分子的直接选择法等遗传检测法。

（2）凝胶电泳检测法和R-环检测法等物理检测法

（3）Southern印记杂交、northern杂交、原位杂交等核酸杂交法

（4）放射性抗体测定法、免疫沉淀测定法等免疫化学法

（5）DNA-蛋白质筛选法

2?抗药性标记插入失火选择法、B -半乳糖昔酶显色反应选择法以及根据插入序列的表型特征选择重组分子的直接选择法等遗传检测法。

抗药性标记插入失火选择法：

（1）四环素抗性插入失活

如果在沧上「上插入外源DNA,导致四环素抗性基因失活，可用四环素+环丝氨酸平板培养基选择重组克隆一一

失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；

Tet「不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。

（环丝氨酸杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌）

（2）氨节青霉素抗性插入失活

如果Amp r±插入外源DNA,导致氨节青霉素抗性基因失活，可用碘■青霉素指示液选择。（挑选蓝色克隆）

B -半乳糖昔酶显色反应选择法：

B-半乳糖昔酶使Xgal分解成蓝色产物。插入外源基因失活，不能分解，挑选白色克隆。根据插

入序列的表型特征选择：利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。原理：（1）弥补缺陷（2）增加新性状

3.凝胶电泳检测法和R-环检测法等物理检测法

凝胶电泳检测法：

（1）直接电泳检测法：从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳，比较其分子量。

（2）酶切电泳筛选法：将外源DNA酶切下，进行电泳，有插入的载体和对照载体比较。（3）PCR扩增检测法

R-环检测法：DNA-RNA杂交，电镜下课间一种R-环形结构

4. Southern印记杂交、northern杂交、原位杂交等核酸杂交法

Southern印记杂交：用DNA （或RNA）探针检测DNA样品。

northern 杂交:

? 用DNA （或RNA）探针检测RNA样品。

?从宿主细胞中提取RNA,再用探针杂交。

?主要检测插入片断是否被转录

原位杂交：直接将菌落（噬菌斑）原位转移到固相载体上，不必进行核酸的分离纯化、酶解和电泳分离。溶菌（噬菌斑）变性后直接进行特异核酸（DNA或RNA）分子的杂交技术，结果直接找出相应的阳性重组子菌落（噬菌斑）

5. 放射性抗体测定法、免疫沉淀测定法等免疫化学法

放射性抗体测定法：

将菌落或噬菌体转移到硝酸纤维索滤膜上，然后复制平板，经氯仿蒸汽溶菌、气溶胶溶噬菌斑后，将待检蛋白转移到已结合一抗的硝酸纤维素滤膜上，然后浸泡到二抗溶液中，结合二抗，清洗滤膜，放射自显影，曝光后与原始平板对比菌落或噬菌体。

免疫沉淀测定法：非放射性抗体检测分泌型产物。在含抗体的平板培养基，表达外源基因的菌落形成沉淀圈。对于不能分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。

6. DNA-蛋白质筛选法

专门设计检测能同DTA特异结合的蛋白质因子。将待检蛋白质与硝酸纤维素滤膜连接，然后与带有放射性标记的能与蛋白质结合的DNA序列相连接，然后检测。

7. 重组体筛选与鉴定的具体方法的过程及原理。

第八章外源基因表达系统

1?基因工程受体种类、各自优缺点

?限制性缺陷型避免修饰和降解

外切酶和内切酶活性缺陷（recB-/recC-/hsdRJ

?重组整合缺陷型避免重组整合

用于基因扩增或高效表达的受体细胞（比cA）

?感染寄生缺陷型防止感染

防止重组细菌扩散污染，生物武器除外

?具有较高的转化效率较高的可转化性

?具有与载体选择标记互补的表型利于筛选

2 ?原核生物基因表达的特点

?只有一种RNA聚合酶：识别原核细胞启动子，催化所有RNA合成。

?以操纵子为单位：数个相关结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。

?转录和翻译偶联、连续进行。

?不含内含子，缺乏转录后的加工系统。

?调控主要在转录水平上。

?mRNA的核糖体结合位点（rbs, SD）

Shine-Dalgarno （S-D） sequence：含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3'末端碱基互补的序列。

3?外源基因在原核细胞中表达必须满足的条件：启动子、S?D序列、终止子、衰减子等原核生物基因表达序列

启动子：DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

启动子序列:大肠杆菌的所有启动子屮都有两段一致顺序（consensus sequence）： -35 Box和

-10 Box

基因工程常用的原核启动子（最佳启动子必须具备的条件）：

?必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。

?应呈现低水平的基础转录，便于表达毒性蛋白等。

?应是可诱导型的，用温度或化学试剂诱导。

?P/ac、Pfrp、P/.、P recA

S?D序列：核糖体结合位点（RBS）, mRNA上与核糖体16sRNA结合是序列。影响外源基因在

大肠杆菌细胞中的高效表达。

终止子：终止外缘基因在强启动子的控制下表达。

衰减子：衰减发生处的一种内部终止子序列。衰减子是位于细菌操纵子上游的一段核昔酸序列。原核生物中通过翻译前导肽而实现控制DNA的转录的调控方式称衰减作用。

4?包涵体表达、分泌型表达、融合型表达等原核表达各自优缺点

外源基因在大肠杆菌中表达形式：

（1）包涵体型异源蛋白的表达

（2）分泌型异源蛋白的表达

（3）融合型异源蛋白的表达

（4）寡聚型异源蛋白的表达

（5）蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建

包涵体：在某些生反条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物人分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies,

IB）o

优点：

-能简化外源棊因表达产物的分离操作

包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。

■能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

重组异源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性主要取决于包涵体形成的速度。在形成包涵体之前，市于二硫键的随机形成以及肽链旁侧基团修饰的缺乏，异源蛋白的蛋白酶作用位点往往裸露在外，导致对酶解作用的敏感性。

缺点：

（1）以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的牛物活性，必须通过有效的变性复性操作, 才

能回收得到具有止确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋口，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。

（2）然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高吋，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。

分泌型表达：外源基因产物通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。优点：

目的蛋白稳定性高重组人胰粘素原若分泌到细胞周中，其稳稳定性大约是在细胞质中的

10倍。

目的蛋白易于分离

目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟责白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在人肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去。

缺点：

（1）相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。

（2）外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达, 但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。

融合型表达：除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这种朵合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。优缺点：

?目的蛋白稳定性高尤其对分子量较小的多肽效果更佳

?目的蛋白易于分离利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白

?目的蛋白表达率高与受体蛋白共用一套完善的表达元件

?目的蛋白溶解性好由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性

?目的蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段

5 ?提高克隆基因表达效率的途径

（1）优化表达载体的设讣：在构建表达载体时对决定转录起始的启动子序列和决定mRNA 翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加SD序列中与核糖体16SrRNA 互补配对的氨基序列等。

（2）提高稀有密码子tRAN的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用同义密码子的频率不同。

（3）提高外源基因mRNA的稳定性。尽可能减少核酸外切酶可能对mRNA的降解或改变外源基因mRNA的结构，使之不易被降解。

（4）提高外源基因表达产物的稳定性。降低水解酶对外源基因表达产物的降解。

（5）优化发酵过程。在工艺方面和生物学方面进行优化。

6.在酵母细胞中克隆基因常用的载体有Yip、YRp、Yep

含有如?S的YRp质粒的构建

为酵母菌中的自主复制序列，0. 8-1.5kb,染色体上每30-40kb就有一个加?S元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包插复制子、标记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒DNA。YRp：以