第四章 酶分子修饰

第四章酶分子改造

教学目的：使学生了解酶分子改造的意义和酶分子改造的常用方法。

教学重点、难点：酶分子改造的常用方法，酶蛋白侧链基团修饰和氨基酸置换修饰。

教学方法：讲授

教学手段：多媒体

第一节酶分子修饰概述

一、概述

酶的广泛应用

应用大规模应用酶和酶工艺的尚不够多

酶自身缺点是最根本的原因

不稳定，不适合大量生产需要

工业应用中，常偏离酶最适pH

临床上，外源蛋白质，具有抗原性

改变酶特性的两种主要方法

化学修饰

基因工程技术（蛋白质工程）

二、概念

指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的过程

创造出天然酶不具备的某些优良性状

提高酶活力

增加酶稳定性

消除或降低酶的抗原性，扩大应用范围，提高经济效益

三、酶分子修饰常用方法

部分水解酶蛋白的非活性主链

利用小分于或大分子物质对活性部位或活性部位以外的侧链基团进行共价修饰

酶辅因子的置换等

基因工程、蛋白质工程（氨基酸置换）

第二节金属离子置换修饰

一、概念

通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法，简称离子置换法二、原理

金属离子往往是组成酶活性中心的部分，对酶的催化功能起重要作用

金属离子的除去、加入与金属离子的置换

活力改变、稳定性等改变

只适用于本来就含有金属离子的酶？

三、常用金属离子

Ca 2+、Mg 2+、Zn 2+、Mn 2+、Co 2+、Cu 2+、Fe 2+

四、操作

酶纯化

EDTA鳌合

透析、超滤、分子筛除鳌合物

加入不同金属离子确定实验结果

五、例

锌型蛋白→钙型蛋白，活力提高20%-30%

杂离子型a-淀粉酶→钙离子型，活力提高并增加稳定性，结晶型活力比一般杂离子型结晶高3倍以上

Fe-SOD→Mn-SOD，对H2O2稳定性增强，对NaN3敏感性显著降低

Zn-酰基化氨基酸水解酶→Co型，最适pH从8.5降低到7.0，Km增大

第三节大分子结合修饰

一、概念

利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用最广泛的方法。

二、方法

1、修饰剂选择

根据酶分子结构和修饰剂特性选择

右旋糖酐、PEG、肝素、葡聚糖、环糊精、CMC、蔗糖聚合物（Ficoll）、聚氨基酸等

2、修饰剂活化

大分子修饰剂使用前一般要活化，才能与酶分子中相应基团共价结合

考虑酶和大分子修饰剂的空间位阻效应

不同的酶结合的修饰剂种类和数量不同，造成酶功能的改变也不一样，需试验确定最佳的修饰剂的种类和浓度，并注意操作条件

例

PEG：甲基化屏蔽一个羟基得到单甲氧基聚乙二醇（MPEG）

不同类型的PEG衍生物：

聚乙二醇均三嗪衍生物

聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物

聚乙二醇胺类衍生物

聚乙二醇马来酸酐衍生物

右旋糖苷-（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷

3、修饰

活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH 值等条件下反应，使两者以共价键结合

4、分离

通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶

三、大分子修饰作用

提高酶活力（空间构象改变，利于底物结合）

1分子核糖核酸酶+ 6.5分子右旋糖苷—酶活提高2.25倍

1分子胰凝乳蛋白酶+ 11分子右旋糖苷—酶活提高原来的5.1倍

1分子胰凝乳蛋白酶+ 11分子右旋糖苷—酶活提高5.1倍

增加酶的稳定性

降低或消除酶蛋白抗原性

精氨酸酶（抗癌）经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低或消除

L-天门冬酰胺酶（治疗白血病）经PEG或右旋糖酐结合修饰其抗原性完全消除

第四节肽链的有限水解修饰

一、概念

利用在限定肽链上的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法。

二、原理

利用高度专一性的酶蛋白水解特定肽链，除去一部分肽段或若干个氨基酸残基，使其空间构想发生改变，利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，从而显示出酶的活性或提高酶活力

同时，分子量的降低，可减弱或消除酶的抗原性

第四节肽链的有限水解修饰

三、例

胃蛋白酶原的激活（N端失去44 aa）

天门冬氨酸酶用胰蛋白酶从末端水解切除10个AA残基，酶活可提高4-5倍以上

枯草杆菌中性蛋白酶，先用EDTA处理。再用稀盐酸缓冲液透析，使酶部分水解，得到仍有酶活性的小分子肽段，做消炎剂使用时，不产生抗原性

第五节酶蛋白侧链基团修饰

一、概念

利用各种物质与组成蛋白质的AA残基上的功能团（侧链基团）进行化学反应，引起侧链基团组成的这些副键发生改变，从而使酶空间结构发生某些改变，使酶的特性和功能发生改变的方法。

二、几种重要的修饰反应

1、酰化及其相关反应

2、烷基化反应

3、氧化和还原反应

4、芳香环取代反应

三、特定氨基酸修饰

1、羧基修饰

2、氨基修饰

卤代乙酸、芳基卤、芳香族磺酸：氨基烷基化

氰酸盐：氨基甲氨酰化

二硝基氟苯（DNFB）：引入二硝基苯

丹磺酰氯（DNS）:引入丹磺酰基团

氨基的某些修饰，还可用作蛋白质序列分析及含量测定

3、精氨酸胍基的修饰

具有两个邻位羰基的化合物（丁二酮、1，2-环己二酮、苯乙二醛在中性或弱碱性条件下可与精氨酸胍基反应。

4、巯基的修饰

巯基具有很强的亲核性，在含有半胱氨酸的酶分子中是最容易反应的侧链基团。

常用的修饰剂

烷基化试剂

马来酰亚胺

马来酸酐

5，5’-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）（产物有吸光度，可用于测定）

5、组氨酸咪唑基的修饰

组氨酸残基位于许多酶的活性中心

常用的修饰剂有

焦炭酸二乙酯（DPC）

碘代乙酸等

可修饰咪唑环上的两个氮原子

6、色氨酸吲哚基的修饰

色氨酸残基一般位于酶分子内部，且反应性差，所以一般不与常用的试剂反应

2-羟基-5-硝基苄溴

4-(对硝基苯偶氮)-3-氯苯胺偶氮增感染料

4-硝基苯硫氯

可较专一的修饰吲哚基，但还容易与巯基作用，修饰时注意对巯基的保护

7、甲硫氨酸甲硫基的修饰

甲硫氨酸残基极性较弱，在温和条件下，很难选择性修饰

由于硫醚的硫原子具有亲核性，所以可用过氧化氢等先氧化成甲硫氨酸亚砜，再用碘乙酰胺等卤化烷基酰胺使甲硫氨酸烷基化

四、酶的分子内交联修饰

1、概念

指利用具有两个反应活性部位的双功能基团试剂在酶分子之间或酶与其他分子之间发生交联反应，从而使酶分子构象更加稳定而增加酶催化稳定性的方法

2 、交联剂的分类

同型双功能试剂

交联剂两端具有相同的活性反应基团，如双亚胺酸酯、N-羟琥珀酰亚胺酯、二硝基氟苯对氨基有专一性反应；戊二醛除与氨基反应外还能与羟基反应

四、酶的分子内交联修饰

2 、交联剂的分类

异型双功能试剂

交联剂两端具有不同的活性反应基团，交联剂一端与氨基作用，另一端一般与巯基作用（碳二亚胺与羧基）。如4-叠氮基苯甲酰甲醛、4-（硝氨基乙基）-3-硝基苯基叠氮等试剂

可被光活化试剂

一端与酶反应后，经光照，另一端产生一个活性反应基团，它们具有高反应性，没有专一性。如碳烯或氮烯

酶侧链基团的修饰在酶的基础研究和酶工程中是不同的。酶工程要求酶修饰后酶活力应保持或损失不多，同时应具新的特性和功能。化学修饰剂要求要无毒、廉价、易得

酶经侧链修饰后在酶活性，稳定性或抗原性都有显著影响。

例1：用O-甲基异脲修饰溶菌酶Lys的-NH2与之结合，修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且易析出

例2：葡萄糖异构酶经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶的稳定性

第六节氨基酸置换修饰

一、概念

将酶分子肽链上的特定氨基酸进行置换后，引起酶蛋白空间构想发生改变，从而改变酶

的特性和功能的修饰方法

如将酪氨酰-tRNA合成酶的第51位的Thr置换为Pro后，对ATP亲和性提高近100倍，酶活力可提高25倍

T4-溶菌酶：Ile3被Cys置换后，Cys-3可与Cys-97形成二硫键，置换后的T4-溶菌酶，其活力保持不变，但该酶的稳定性却大大提高

二、氨基酸置换方法

1、化学方法：准确性差，难度大

Bender, Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性的Ser变成Cys，修饰后酶对pr.和肽的水解能力消失，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性

2、定点突变技术（Site directed mutagenesis)

指在DNA序列中某一个特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。

是蛋白质工程和酶分子组成单位置换修饰中的常用技术

第六节氨基酸置换修饰

定点突变

主要步骤

第七节酶分子物理修饰

通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法

物理方法：高温、高压、高盐、低温、真空、失重、极端pH值、有毒环境等极端条件

意义

太空探索、深海、其它极端环境生物生存可能性及潜力

获得通常条件下无法得到的产物

提高酶的催化能力、增强稳定性及动力学改变等

物理修饰的特点:

不改变酶的组分和基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理方法的作用下，副键发生某些变化和重排

如：用高压方法处理纤维素酶以后，该酶的最适温度有所降低；在室温下，高压修饰酶比天然酶的活力提高了10%

变性剂改变空间构象

在某些变性剂的作用下，先使酶原有空间构象破坏，然后在不同的条件下，使酶分子重新构建新的构象

如：先用盐酸胍等变性剂使胰蛋白酶的原有构象破坏，通过透析除去变性剂后，在不同温度下，使酶重新折叠形成新的构象。

重新构建构象的胰蛋白酶的稳定性不同

50 ℃条件下重新构建的新构象与20℃重建构象的酶的稳定性提高5倍

第八节酶分子修饰的应用

一、在酶学研究方面的应用

1、酶的活性中心研究

2、酶的空间结构研究

荧光标记确定各基团空间分布，化学修饰定量研究特定氨基酸数目及分布等

3、酶的作用机制研究

酶的底物类似物作为亲和标记试剂研究酶的活性中心

差别标记法检测活性中心的结合基团

氨基酸置换法研究酶分子中特定氨基酸的作用等

差别标记法

二、在医药方面的应用

1、降低或消除酶的抗原性

抗癌作用的精氨酸酶及对白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶的聚乙二醇修饰等

2、增强医用酶的稳定性

溶菌酶第三位的异亮氨酸置换为半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸形成二硫键增强稳定性、SOD与PEG的结合修饰稳定性增强等

三、在工业方面的应用

提高工业用酶的活力、增强工业用酶的稳定性、改变酶的动力学特性、改变温度和pH，利于工业生产

四、在抗体酶研究开发方面的应用

作为酶抗原诱导生产抗体酶，其它修饰技术使抗体具有酶活性等

五、在核酸类酶人工改造方面的应用

原理同酶分子修饰

六、在有机介质酶催化反应中的应用

酶侧链基团修饰后增强疏水性而增加其溶于有机介质的能力

第九节酶分子定向进化

一、简介

1、理论来源

基因工程兴起

电子科学发展及计算机广泛运用

实验室模拟自然进化思想

构建新的非天然酶或改造酶分子

2、基本原理

序列的合理化设计方案（认识与改造）

生物化学、晶体学、光谱学等获得分子特征、空间结构、结构与功能关系、氨基酸残基功能等

酶分子改造

2、基本原理

酶分子的非合理化设计

定向进化、杂合设计

实用性强，可通过随机产生的突变，改进酶的特性

易错PCR、DNA shuffling，高突变菌株技术应用和目的基因表型高效检测系统应用

第九节酶分子定向进化

概念

属于蛋白质非合理设计，不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（筛选）出所需要的突变酶

第九节酶分子定向进化

定向进化基本先决条件（巨大进化潜力）

实际存在环境与实际应用环境不同

生物生存需求的满足，失去进化的筛选压力，为提高酶活力和稳定性的体外定向进化留下空间

待进化的性质不是其在生物体内所涉及的

定向进化=随机突变+正向重组+选择（筛选）

二、定向进化策略

1、Error PCR 为代表的无性进化

提高Mg2+浓度，加入Mn2+，改变体系四种dNTP浓度或加入dITP等，改变Tag酶突变频率，错配率最高达每5个碱基对1个突变，构建突变库

关键

突变频率控制，理想的突变频率为每个基因1.5~5个点突变

0.8%-1.0%

连续易错PCR

有用突变基因做模板继续随机诱变

遗传变化发生在单一分子内部，所以称为无性进化

2、DNA shuffling 为代表的有性进化

连续正向突变概率小

不同基因的正突变结合形成新突变库

Sexual PCR

体外随机重组法（random-priming in vitro recombination，RPR）

以单链DNA为模板，配合一套随机引物dp(N)6

产生大量互补与模板不同位点的短DNA片段，由碱基的错配和错误引发，短DNA片段出现少量点突变

PCR中，互为引物，伴随组合，再组装

可反复进行

与DNA shuffling相比，RPR具有以下优点：

用单链DNA为模板．对模板量要求少，大大降低了亲本组分，便利筛选

克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底去除DNase I的缺点

片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组装前无需纯化操作

随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了小肽的改造

交错延伸法(staggered extension process, StEP）

一组相关亲本（2个以上）DNA 作模板

退火和延伸合并为一步（80-100 extension cycles，5-15s）大大缩短反应时间，只能合成非常短的新生链

每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组

重复进行直到获得全长基因，重组程度可通过调整时间和温度来控制。此法省去DNA酶切成片段这一步，因而简化了DNA重排方法

3、以过渡模板随机嵌合生长技术（random chimeragenesis on transient templates , RACHITT)为代表的基因家族之间的同源重组

与DNA shuffling概念上明显不同的，改进的基因家族重组技术。它不包括热循环、链转移或交错延伸反应

随机切割的DNA 片段杂交到另一个同家族DNA 临时模板上, DNA 片段经过在模板上重新排序、修剪、缺口连接等形成全长DNA 新链, 消化掉临时模板, 获得高度重组的基因文库Coco等报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重

组水平比DNA shuffling类方法(1～4个交叉)高出几倍；并且可在短至5 bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所难以达到的

作为比较，对四个基因进行家族基因重排来构造头孢菌素酶基因的重组文库。同样选出50000个克隆子移入含羟羧氧酰胺头孢菌素的平板，从中筛选出的最好的克隆子，与抗性较强的亲本相比，其抗性增加了270倍（从0.38μg/ml到200μg/ml）；与抗性较弱的亲本相比，其抗性增加了540倍（从0.75μg/ml到200μg/ml）。由此可以看出，家族基因重排的效果要比单基因重排好得多

对家族基因重排中得到的最好克隆子进行进一步研究表明它含有来源于4个不同亲本中3个亲本的8个片段，7个交叉的地方都发生在序列同源的区域，并且这个最好的克隆子含有高达33个的点突变

4、外显子改组（exon shuffling）

类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物

自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一

5、计算机辅助设计

充分利用酶分子相关结构数据

减小盲目随机突变造成的库容过大

指导定向进化

例：酶分子结构出发，计算氨基酸残基替换容忍性，有目的选择突变区域，增加筛选含正向突变的几率

6、突变库的构建及应用

7、基于非同源基因重组

渐进式切割产生杂合酶( incremental truncation for the creation of hybrid enzymes , ITCHY)

利用外切核酸酶Ⅲ对两个同源性较低或无同源性的基因分别进行切割,获得依次相差一个碱基的DNA 片段库

随后将一个基因的5’端随机片段与另一个基因的3’端随机片段连接,建立突变体文库

突破了DNA 洗牌技术的高同源性限制,可在非同源序列同一区内产生活性融合子

利用其文库为亲本基因再进行DNA 洗牌,还可以在不同基因间创造多个交叉,大大提高文库的丰度

不依赖序列同源性的蛋白质重组( sequence homology independent protein recombination , SHIPREC)

两个功能上相关的基因片段通过一段DNA 短序列连接成一基因二聚体(进行连接的DNA

短序列含多个限制性酶酶切位点)

对基因二聚体进行随机切割,片段经过琼脂糖凝胶电泳回收,在连接酶作用下形成环状分子,随后利用限制性内切酶消化环状DNA 分子,获得嵌合基因产物

杂合基因转入宿主菌,表达成突变的蛋白质文库

第四章习题

1酶分子修饰、酶蛋白侧链集团修饰、蛋白质工程

2 酶分子修饰的意义是什么？