抗生素微生物检定标准操作规程

山西振东制药

目的：建立抗生素微生物检定标准操作规程

范围：抗生素类药

依据：《中国药品检验标准操作规程》2010年版

责任：化验员严格按操作规程操作

班组长对检验人员的操作进行监督和指导

中心化验室主任对检验人员进行培训考核，并对检验人员操作进行监督和指导内容：

1 术语或定义

本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性（效价）的方法。

抗生素微生物检定包括两种方法，即管碟法和浊度法。

2 程序

2.1 操作前准备

2.1.1 抗生素管碟测定法

2.1.1.1 仪器与用具

操作室光线明亮，操作室应分为两部分，彼此分开，其中一部分为一般操作室，一部分为半无菌操作室。半无菌操作室应设有紫外线灭菌灯，并附设空气净化（空气净化级别为100～10000级）及空调设备，控制室温度在20~25℃之间，达到无菌或半无菌状态。操作台

应稳固，台面用玻璃板，并用水平仪调节至水平。注意操作，避免室内抗生素污染。

双碟内径约90mm高16～17mm硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均匀，水平透明，无色斑气泡。碟底平度检查，可将双碟放在水平台上，下垫一张白纸碟内加水2～3ml，再滴加蓝墨水，观察蓝色深浅是否一致。

陶瓦盖内径约203mm，外径108mm，平坦，吸水性强，应定期清洗、干燥或干热灭菌。钢管内径（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm，外径（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套钢管重量差异不超过±0.05g，内外壁及两端平坦，管壁厚薄一致。每次使用后应置1:1000新洁尔灭溶液内，浸泡2h以上，灭菌后再洗涤，先用水洗涤，超声波超声30min 后用沾有去污粉的纱布条串擦内外壁，水冲洗，沥干，再用蒸馏水冲洗3次后，置带盖的容器内，在150～160℃干热灭菌2h，备用。

钢管放置器有6孔和4孔两种。放置于无菌或半无菌的操作平台上，钢管下落时应垂直平稳、位置正确。双碟升降平稳。应保持清洁，防止抗生素污染。可定期用75%乙醇棉擦拭落管筒及储管杯。置钢管的玻璃管应定期干烤灭菌。

恒温培养箱以隔水式为宜，温度平稳，波动小。除另有规定外，依各品种项下要求设定温度，温度波动范围为35～37℃或24～26℃，箱内网状隔板上放置带孔的玻璃板并调节至水平。

灭菌刻度吸管用于吸取菌液及培养基。用后应立即置5%石炭酸或1:1000新洁尔灭溶液中消毒后，再按玻璃容器的常规洗涤法洗涤。洗涤沥干后在吸口处塞入脱脂棉（松动、透气），置适宜容器中，在120℃以上干热灭菌2h或121℃蒸气灭菌30min，烘干备用。

玻璃容器包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均应符合“常用玻璃量器国家计量检定规程”的规定。每次使用前用清洁液浸泡，水冲洗，并用蒸馏水或去离子水冲洗3次，沥干。

称量瓶重量在10g以下。用毕先用水冲洗，沥干，置清洁液浸泡2h以上，然后分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置洁净平皿中，在120℃干热灭菌3h，待冷置60～70℃时，取出置于干燥器中备用。

滴管用玻璃管拉制，管口平滑。使用前在清洁液浸泡，分别用水、蒸馏水或去离子水冲洗3次，置适宜容器中，在120℃干热灭菌3h后，备用。

天平分析天平，精密度0.1mg，经计量检定。

抑菌圈直径（面积）测量仪应符合“抑菌圈测量仪检定规程”的规定。

游标卡尺精度0.02mm，长度150mm。

超净工作台有效工作面局部洁净度100级。用于试验菌的接种传代或菌悬液制备。超净工作台须置洁净工作室或半无菌室内。

2.1.1.2 试液

灭菌缓冲液制备缓冲液的试剂应为分析纯，制备后的缓冲液应澄明，分装于玻璃容器内，经121℃蒸汽灭菌30min备用。

磷酸盐缓冲液（pH5.6）取磷酸二氢钾9.07g，加水使成1000ml，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.6，滤过，在115℃灭菌30分钟。

磷酸盐缓冲液（pH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过。磷酸盐缓冲液（pH7.0）取磷酸氢二钾9.39g与磷酸二氢钾3.5g，加水使成1000ml，滤过。

磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过。

磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过。

2.1.1.3 培养基配制培养基的各成分原料质量对抑菌圈边缘清晰度及试验结果影响较大，因此应对原材料进行预试验，挑选适当的品牌使用。

制成的培养基不应有沉淀，如产生沉淀，可在配制培养基后，于115℃加热20min融化，趁热用纸浆减压或适宜方法过滤，调节pH，分装灭菌备用。

《中国药典》2010年版二部附录的抗生素微生物检定法中收载了13种不同处方的培养基及制备方法。目前，已有市售干燥培养基，使用方便。临用时，按照使用说明进行配制，但应注意核对培养基的pH，必要时需调节pH，使其符合规定。另外，市售干燥培养基的质量也存在差异注意选择合适的产品。

2.1.1.4 菌种的复苏检定用标准菌种为冷冻干燥品，由中国药品生物制品检定所提供。

取冻干菌管、灭菌1ml毛细滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面，移入接种室操作台或超净工作台、

将冻干菌种管外壁用碘酒（碘伏）擦拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌毛细管吸取营养肉汤培养基，滴在上述灼热的菌种管封口端，使其骤冷炸裂。

取灭菌镊子，在酒精灯火焰上方，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取一支灭菌毛细滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加置菌种管底部，将冻干菌块搅动使其溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将毛细滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35～37℃培养22～24h。

取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，涂片并进行格兰染色镜检，如呈典型菌落，则转种3代即可使用。菌落不典型时，可进行平板分离单菌落。

2.1.1.5 菌种的接种与保存

准备需用的培养基培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。在标签上注明菌名及接种日期。从冷藏箱中取出菌种斜面后，应在室温放置约30min，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。

点燃酒精灯或煤气灯等，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却在移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接

种棒，并将菌种管口移至火焰上方。塞上管塞，左手见菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面底部，由底向上，接种环轻帖斜面的表面曲折蛇形移动，使细菌接种在斜面的表面上。

取出接种环，在火焰上方将培养基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。

将已接种的细菌管置35～37℃培养22～24h，霉菌管一般置24～25℃培养24～25h霉菌培养箱内培养7天。培养后放入4℃冷藏箱内保存，一般1～3个月转种一次。

2.1.1.6 菌悬液的制备

枯草芽孢杆菌［Bacillus subtilis CMCC(B)63 501］悬液取枯草芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，加灭菌水1～2ml将菌苔洗下，制成悬液，用吸管将此悬浮液接种至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶内，均匀分布，在35～37℃培养7日。取菌苔少许涂片，革兰染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。用灭菌水10ml将芽孢洗下，制成芽孢悬液，合并至灭菌大试管内，在65℃水浴中加热30分钟将菌体杀死，待冷却后置4℃冷藏箱储藏。此菌液为浓菌液。

日常试验用菌液取上述浓菌液，用灭菌水1：3稀释至灭菌试管中，冷藏箱保存备用。短小芽孢杆菌［Paullus pumilus CMCC(B)63 202］悬液取短小芽孢杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备芽孢悬液。

金黄色葡萄球菌［Staphylocouuc aureus CMCC(B)26 003］悬液取金黄色葡萄球菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种至营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，制成悬液。置4℃冷藏箱保存，可使用3天。藤黄微球菌［ Micrococcus luteus CMCC(B)28 001］悬液取藤黄微球菌工作用菌营养琼脂斜面培养物，用1ml培养基Ⅲ将菌苔洗下，用吸管移至盛有营养琼脂培养基的扁培养瓶中，均匀摊布，将培养瓶倒置于培养箱中26～27℃培养24小时取出，用吸管吸取培养基Ⅲ或9%的灭菌氯化钠溶液5ml至培养瓶中，将菌苔洗下，合并菌液至灭菌大试管中备用。置4℃冰箱保存，可使用1～2个月。

大肠杆菌［Eschehchia coli CMCC(B)44 103］悬液取大肠杆菌工作用菌种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。

肺炎克雷伯菌［Klebosiella Pneumoniae CMCC(B)46 117］悬液取肺炎克雷伯菌工作用

菌

种营养琼脂斜面培养物，照金黄色葡萄球菌菌悬液项下的方法制备菌悬液，供当日使用。啤酒酵母菌[Saccharomyces cerevisiaeATCC 9763]悬液取啤酒酵母菌的V号培养基琼脂斜面培养物，用接种环取菌苔少许接种于Ⅳ培养基斜面上，在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下，放置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，以当日使用为宜。

试验菌的菌龄对抑菌圈边缘清晰度有一定影响，应保持菌种新鲜。对易变异的菌株如藤黄微球菌等，宜在制备菌悬液前进行单菌落的分离，选择典型菌落以保持菌悬液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈边缘清晰、整齐。

2.1.2 抗生素微生物比浊法

2.1.2.1 环境、仪器与用具

操作室要求同管碟法

仪器可采用自动浊度法测定仪或分光光度计。

自动浊度测定仪主要由光源、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。

环境条件防止强光照射，仪器应平稳放置在工作台上，便于操作，周围无强烈的机械运动和电磁干扰。

仪器使用前，应预先稳定2~3h后，再进行测量。

吸收池应使用容量在15ml左右的石英吸收池。当吸收池中装入蒸馏水，在530nm、580nm、650nm 波长处测定各吸收池的吸光度，差异应不大于0.005。

温度准确度实测温度与设定温度差异应在±0.1℃内。实测温度与设定温度30min内漂

移偏差应在±0.1℃内。测定样品室4个不同位置处的温度，差异应在±0.1℃内。

波长准确度的允差范围在530nm、580nm、650nm波长处，允许误差在±2.0nm。

搅拌控制各吸收池应配有转子搅拌装置，搅拌部分应正常运转，搅拌速度均匀。

浊度测定仪根据其结构和测量方式，其光源分为单通道光源和多通道光源两类。对于多通道光源，在530nm、580nm、650nm波长处测定国家计量认可的滤光片的吸光度，不同通道光源间的差异应不大于0.003。

重复性在530nm、580nm、650nm波长处测定的滤光片的吸光度，连续测定5次，差异应不大于0.005。

在530nm、580nm、650nm波长处测定滤光片的吸光度，4 h内吸光度的差异应不大于0.003。吸收池应采用随机区组或其它统计学方法排列放置，以消除支间测定差异的影响。

样品测定时，应放置1个阴性管和一个阳性管。测定仪的吸光度测定带有自动扣除阴性空白的功能。实验报告除出具标准品和供试品的吸光度和统计计算结果外，还应提供阳性菌的生长曲线，各管的培养终止时间应处于实验菌的对数生长期内。根据阳性菌的生长曲线，如阳性菌生长不佳，则实验不成立，应重新实验。

分光光度计应有数字显示功能和自动记录装置，数显精度应在小数点后三位。其各项指标应符合紫外–可见分光光度计的检定规程。

玻璃大试管20.5mm×2.5mm或适宜的试管，应大小一致，厚薄均匀，玻璃质地相同，使用同一品牌和批号。使用过的试管经灭菌后，将培养基倾出，用水清洗，沥干，再用硫酸一重铬酸钾洗液浸泡，清水冲洗干净后，晾干，在160℃干烤2～3 h灭菌，保持洁净，备用。注意避免污染毛点、纤维等，以免干扰测定结果。

移液管 10ml或20ml刻度容量，管口需磨粗（大），以便快速分装培养基。

恒温水浴箱工作体积600 mm×300mm×150mm（长×宽×高），电热恒温水浴。

电动搅拌器将二台电动搅拌器的浆叶置于恒温水浴的大试管随机区组培养方列的两侧，于水中搅动，以使水温均匀。本身带搅拌或循环水系统的恒温水浴箱，可不再配备电动搅拌器。

分光光度计用吸收池方形玻璃吸收池或石英吸收池，用硝酸一硫酸混合液（取浓硫酸95ml，加浓硝酸3～5 ml，混匀）浸泡1～48h（浸泡时间视是否能去除附着污物而定），先后用水、去离子水（蒸馏水）冲洗干净，晾干，备用。如仍不能除去附着污物，可用1%～

2%硝酸钠的浓硫酸溶液浸泡后，再经水洗涤。