药理实验设计

急性毒性试验

急性毒性试验是临床前新药安全性评价的第一步，与其它毒性试验相比具有简单、经济、易行等特点。因此新药研究开发时往往通过该项试验，尽可能多的了解一些新药的毒理学特点，为早期判断侯选新药是否具有研究开发价值提供毒性强度资料。急性毒性试验(单次给药毒性试验)主要观察对实验动物一次给药后所产生的毒性症状及其程度，出现和消失的时间，死亡的发生率并计算出其最大给药量，最小致死量、半数致死量(LD50)等。急性毒性试验方法的有关问题如下：

一、动物

(一)动物种——动物种(或系)的差异是动物急性毒性差异的主要原因，药酶则是毒性种差的重要原因之一。为推测新药对人的急性毒性，某些发达国家动物急性毒性试验要求包含非啮齿类动物(除家兔外)在内的两种动物，我国对此未作出明确规定。由于中药已在临床长期使用，一般认为，如尤特殊情况，使用一种动物已基本上达到急性毒性试验的目的。目前虽常用的实验动物是小鼠或大鼠。但在某些特殊情况下，例如受试物中已知含有强烈胃肠刺激物，就还应再采用非啮齿类大动物进行实验，否则，即使毒性较大(如巴豆)也并不能引起大、小鼠呕吐反应。

(二)动物的年龄、性别、体重——急性毒性受动物的健康状态、年龄、性别、遗传因素、体重、药物的吸收、分布、代谢、排泄和内分泌激素等的影响。未成年的动物药酶活性一般较低，对于经代谢后减毒的药物表现毒性较强。而且，年幼动物药物代谢功能和敏感度较易发生变化，性别间的特性也尚未确立，因此，口服毒性通常使用年轻的性成熟的动物，—般小鼠6—8周龄，两种性别，体重18-22g(同次试验体重相差不超过2g)，大鼠6—8周龄，两种性别，体重120～150g(同次试验体重相差不超过10g)。

(三)动物数量——视不同试验而异。最小致死量或半数致死量，小动物(大鼠、小鼠)试验组在三组以上，每组—般至少10只动物(雌雄各半)。一些国家对动物数和组数不作规定，因此，有只用3只一组经多组试验测得近似致死量或LD50者。大动物(犬、猴)并不—定要求得到LD50，可用少量动物采用剂量递增的方法观察中毒症状，求近似致死量即可。最大给约量试验—般要求用小鼠或大鼠20只即可。

二、给药方法

(一)动物禁食——动物购入后应在实验室观察1星期，口服给药前，为减少吸收差异和大容量给药造成胃急性扩张，小鼠和大鼠至少应停食4 -6h，要求一夜停食(不停水)，投药后再停食3-4h。

(二)给药途径——中药新药除临床给药途径外，—、二类新药还希望其他给药途径，水溶性药物应同时采用静脉给药途径，其他如油剂，混悬剂之类可采用皮下给药途径。腹腔汁射在人体极少用，中药粗制剂成分复杂，动物毒性试验中也尽可能少用，以避免腹腔刺激性的干扰。

各给药途径的容量一般为小鼠0．4—0．5ml／20g(体重)，大鼠lml／l00g(体重)。小鼠口服最大容量不超过0．8ml／20g(体重)，其他途径不超过0．5ml／20g(体重)。大鼠口服最大容量不超过2ml／l00g(体重)，其他途径不超过lml／l00g(体重)。

三、急毒试验观察指标和致死量的计算

(一)观察指标——不能把求得致死剂量看作是急性毒性实验的唯一要求。发现毒性症状及毒性反应的靶器官同样是急毒实验非常重要的目的。死后及时解削进行肉眼观察和病理组织学观察。

(二}致死剂量计算——可用Bliss点斜法、简化机率法、改进寇氏序贯法等计算最小致死量或半数致死量。Bliss法严谨精确，缺点是计算非常繁复。但近代有计算机软件，汁算方法可推荐Bliss法。各种方法原则基本相同，如：①剂量对数值应为等差，即剂量应按等比级数排列；②各组动物数应相等；③死亡率应在50％上下基本对称分布等。如受试物毒性低，测不出LD50，可求得最大给药量。

急性毒性试验方法

一、LD50的测定

最小致死量是使动物刚好致死的药物剂量，但由于药物的性质，给药方法和个体差异，每只动物的最小致死量确很大的差异，实验和统训学原理表明一群动物最小致死量的平均值相当于半数致死量。半数致死量测定方法很多，但实验没计大同小异，所不同者为算方法的不同，其试验方法如下：

预试验——目的是找出0％及100％估计致死量。更确田地说是找到—个0死亡的最大剂量和100％死亡的最小剂量的估值以决定实验中采用的最大剂量(Dm)和最小剂量(Dn)，，这在测定中非常重要，是实验成败的关键。可用雌或雄性动物，设四组以上，每组3-4只，先用1；10的剂量比给药(如5mg／kg、50mg／kg、500mg／kg、5000mg／kg固定剂量)。记录死亡动物数。然后在死亡数4／4和0／4两组之间按1；2(如50mg/kg、100mg/kg、200mg ／kg、400mg／kg)以下的剂量比进行重复试验，以此测得近似的0和100％死亡率。

正式试验——在预试验Dn和Dm剂量范围内按等比设三个以上剂量组，其组间剂量的比值，一般在1；0．6至1：0．9范围内。动物随机分组，每组10只或10只以上，雌雄各半，分别编号，给药前应禁食(不禁水)过夜。各给药组和溶剂对照组按体重给药后，详细记录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间。LD50和最小致死量及其可信限的汁算可采用Bliss法，改进寇氏法、点斜法、简化概率单位法或其他的计算方法。汁算结

果对比表明，不同的汁算方法，结果间一般无明显差异，而不同实验室对同一样品试验结果却常见有显著差异。冈此，采用较简单的计算方法完全可以满足LD50计算的准确性。

初步毒性分析——

二、最大给药量试验

如同受试药物的浓度或体积限制，无法测出半数致死量(LD50)时，作最大给药量试验。试验选用拟推荐临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度(溶液仍有较好的流动性)，最大体积的给药量1次或1日内2～3次给予动物。以小鼠口服为例：动物数不得少于20只，雌雄各半，容量—次不超过0．4ml/10g(体重)，多次给药间隔时间不低于4h，观察7日，汜录毒性反应和体重变化。如仍未见毒性反应或体重正常增加，则可认为该药物小鼠最大给药量未见毒性反应，或LD50大于最大给药量。

三、近似致死量试验