临床免疫学和免疫检验第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术讲义

第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术

第一节免疫细胞的分离

一、外周血单个核细胞的分离

外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间，因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。

分离介质是分离各类细胞的关键，对分离介质的基本要求是：①对细胞无毒；②基本等渗；③不溶于血浆及分离物质；④有特定的比重。

Ficoll分离液为常规的淋巴细胞分离液，其比重为1.077±0.002，主要用于分离外周血中单个核细胞。

其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。

二、淋巴细胞的分离

纯淋巴细胞群的采集是利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要的方法有：

1.黏附贴壁法；

2.吸附柱过滤法；

3.磁铁吸引法；

4.Percoll分离液法。

三、T、B细胞和T细胞亚群的分离

（一）磁性微球分离法

（二）荧光激活细胞分离仪分离法

四、分离细胞的保存及活力测定

1.短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃保存。

2.长期保存技术：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。

活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。这是一种阴离子型染料，不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。

第二节淋巴细胞表面标志及亚群分类

常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志的是簇分化抗原（CD）。CD抗原的鉴定和检测依赖于其相应的单克隆抗体。

一、T细胞表面标志及其亚群

T细胞是参与机体细胞免疫反应并起主导调节作用的一组免疫细胞。所有的T细胞均有共同的标志性抗原，一般认为是CD3分子，不同功能的T细胞亚群又有各自的标志性抗原。根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分子表达至少可以将T细胞分为：CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell Th）、CD3+CD4－CD8+细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell ,Tc或CTL）和CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell ,Tr或Treg）等几组亚群。

（一）T细胞表面主要的CD抗原

1.CD2：表达于全部人T细胞和NK细胞表面，因其能与绵羊红细胞（SRBC）结合，又称为绵羊红细胞受体。

2.CD3：表达于全部T细胞表面，是T细胞的表面标志，是TCR-CD3复合物的重要组成部分。

3.CD4/CD8：CD4和CD8分子分别表达于外周血不同的T细胞亚群表面，是区分T细胞亚群的重要标志。表达CD4的主要是辅助性T细胞，表达CD8的主要是细胞毒性T细胞。

4.致有丝分裂受体、病毒受体。

（二）T细胞亚群

1.辅助性T细胞：表面标志是CD3+CD4+CD8-。主要有两种辅助性T细胞（Th1，Th2），其产生的细胞因子不同。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等细胞因子辅助细胞免疫或参与迟发型超敏反应，本身具有明显的细胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等细胞因子辅助体液免疫，参与速发型超敏反应，但本身不具有明显的细胞毒作用。

2.细胞毒性T细胞：表面标志是CD3+CD4－CD8+。分泌细胞因子的特征与Th1和Th2十分相似，遂细分为Tc1与Tc2，Tc1与Tc2都有典型的细胞毒性效应。

3.调节性T细胞：主要包括两个亚群，一种是CD4+CD25+调节性T细胞；另一种为CD8+调节性T细胞，其主要包括CD8+CD28－调节性T细胞和CD8+CD28-限制性的调节性T细胞。

二、B细胞表面标志

B细胞活化后转化为浆细胞，分泌抗体，执行体液免疫功能。B细胞表面的膜免疫球蛋白（SmIg）、Fc 受体、补体受体、EB病毒受体和小鼠红细胞受体是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。B细胞表面较特异的CD分子有CD19、CD20、CD21、CD22和CD23等，其中有些属全体B细胞共有的标志，而有些仅是活化B细胞特有，据此可用单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化法或流式细胞技术对其进行检测。

膜免疫球蛋白（mIg）又称为BCR，表达于所有成熟的B细胞表面，是B细胞最具特性的表面标志。mIg 的主要作用是结合特异性抗原，故又称为抗原受体。成熟B细胞的mIg主要为mIgM和mIgD。

B细胞及其亚群的检测是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫调节紊乱的重要指标。

三、NK细胞表面标志

NK细胞的表面标志：人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定。目前NK标志以CD3-、CD16+、CD56+为公认。CD16分子又称为低亲和性IgG Fc受体，当IgG类抗体与靶细胞表面相应抗原表位特异性结合后，可通过其Fc段与NK细胞表面FcR Ⅲ结合，行使针对靶细胞的定向非特异性杀伤作用，也即NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。

第三节抗原提呈细胞（APC）

指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类免疫细胞。抗原提呈细胞可分为两类：①“专职”抗原提呈细胞，包括巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，它们均可表达MHC-Ⅱ类分子；

②“非专职”抗原提呈细胞，包括内皮细胞、上皮细胞和激活T细胞等，它们在某些因素刺激下可表达MHC-Ⅱ类分子，并具有抗原提呈功能。

另外，所有表达MHC-Ⅰ类分子并具有提呈内源性抗原能力的细胞，广义上也属于抗原提呈细胞。

一、单核-吞噬细胞系统

单核-吞噬细胞系统（MPS）包括骨髓内的前单核细胞、外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞。单核-吞噬细胞的典型的表面标志是CD14。

二、树突状细胞（DC）

树突状细胞（DC）是一大类专职抗原提呈细胞，其主要有两种来源，即髓系和淋巴系。

DC是形态、表型和功能高度异质的细胞。根据刺激T细胞增殖能力的不同，它们被分为成熟和不成熟的DC；根据诱导T细胞分化为不同效应T细胞的功能，将它们分为诱导分化Th1的DC（DC1）和诱导分化Th2的DC（DC2）；根据明显的谱系和细胞表型的不同，分为骨髓DC和淋巴DC。

人成熟DC的主要特征表面标志为CD1a、CD11c和CD83，但不表达其他淋巴细胞的表面标志。

第四节免疫细胞表面标志的检测及应用

一、免疫细胞表面标志的检测方法

通常采用相应的标记单克隆抗体为探针，通过标志物对阳性细胞作出指示，对有关细胞进行计数，根据标志物的不同形成了不同的检测方法，有代表性的几种方法为：

（一）抗体致敏细胞花环法

（二）免疫细胞化学法

（三）免疫荧光法：将分离得到的外周血单个核细胞与相应的以荧光素标记的CD单克隆抗体作用（直接法），或与抗相应CD单克隆抗体作用后，洗去游离的抗体，再加入荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清（间接法），制片后用荧光显微镜观察结果，计算阳性细胞占总计数细胞的百分率。

（四）流式细胞分析法：目前免疫细胞的检测主要采用流式细胞术，结果客观准确，重复性好。

二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义

淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。由于淋巴细胞，特别是T淋巴细胞在执行免疫功能方面发挥多种作用，故有必要对各类淋巴细胞（淋巴细胞亚群）进行分析。这中间主要是通过表面标志识别进行计数。

在评价免疫功能时经常采用CD4/CD8比值。如CD4是HIV受体，HIV感染时CD4/CD8比值明显降低。但CD4阳性细胞包括了很多功能性细胞，如T H、T r等，CD8阳性细胞也是如此，所以单用CD4/CD8比值反映免疫功能显然不够准确。除AIDS患者外，实际观察CD4/CD8比值与患者的免疫功能及临床症状的关系及意义有限。

对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。CD4/CD8升高常见于自身免疫性疾病；而CD4/CD8降低常见于病毒感染、恶性肿瘤和再生障碍性贫血等。

外周血中单个核细胞包括

A.有核红细胞

B.淋巴细胞

C.单核细胞

D.淋巴细胞和单核细胞

E.粒细胞

『正确答案』D

『答案解析』外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

外周血单个核细胞的比重介于

A.1.001～1.075

B.1.012～1.030

C.1.030～1.035

D.1.075～1.090

E.1.092～1.098

『正确答案』D

『答案解析』外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不

同，介于1.075～1.090之间。

Ficoll密度梯度分层液主要用于分离外周血中的

A.粒细胞

B.单个核细胞

C.红细胞

D.巨噬细胞

E.血小板

『正确答案』B

『答案解析』Ficoll分离液为常规的淋巴细胞分离液，其比重为1.077±0.002，主要用于分离外周血中单个核细胞。

采用Ficoll密度梯度分离液处理血液后，分离结果从上至下依次为

A.稀释的血浆、粒细胞、单个核细胞、红细胞

B.稀释的血浆、红细胞、单个核细胞、粒细胞

C.单个核细胞、稀释的血浆、粒细胞、红细胞

D.稀释的血浆、单个核细胞、粒细胞、红细胞

E.稀释的血浆、单个核细胞、红细胞

『正确答案』D

『答案解析』Ficoll分离液为常规的淋巴细胞分离液，其比重为1.077±0.002，主要用于分离外周血中单个核细胞。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层、单个核细胞层、粒细胞层和红细胞层。

玫瑰花环形成细胞指的是

A.B淋巴细胞

B.T淋巴细胞

C.红细胞

D.粒细胞

E.单核细胞

『正确答案』B

『答案解析』玫瑰花环形成细胞指的是T淋巴细胞。

可通过ADCC介导细胞毒作用的细胞是

A.浆细胞

B.CTL

C.B细胞

D.NK细胞

E.肥大细胞

『正确答案』D

『答案解析』CD16分子又称为低亲和性IgG Fc受体，当IgG类抗体与靶细胞表面相应抗原表位特异性结合后，可通过其Fc段与NK细胞表面FcR Ⅲ结合，行使针对靶细胞的定向非特异性杀伤作用，也即NK细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）。

淋巴细胞活力检测最常用的方法是

A.细胞培养

B.伊红染色

C.台盼蓝染色

D.瑞氏染色

E.细胞计数

『正确答案』C

『答案解析』活力测定最简便常用的为台盼蓝染色法。这是一种阴离子型染料，不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。

淋巴细胞冷冻保存时最常用的保护剂是

A.二甲亚砜

B.小牛血清

C.Hanks液

D.RPMI1640

E.台盼蓝

『正确答案』A

『答案解析』分离细胞的长期保存技术：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。