微生物检测技术

乳品中微生物检测技术和发展方向

摘要：乳品微生物检测技术对乳制品的质量安全、营养健康及疾病预防具有重要作用，其方法已由培养水平向分子水平迈进。本文系统地介绍了几种乳品微生物检测的技术及方法，并展望了其检测技术的发展方向。

关键词：乳品微生物检测发展

Dairy products of microorganism inspection technology and the development

direction

Abstract: Detection technology and methods in milk microorganism is important for security，nutritional health and disease prevention. It has developed from culture level to molecule level. Several detection technology and methods are introduced，the prospect of detection technology is looked forward.

Keywords: dairy microbial；detection；development

1引言

乳品行业是关系到人类健康的敏感行业，乳品在人类的膳食结构中占有十分重要的地位。除了营养知识和营养意识等因素外，乳品质量安全是人们关注的焦点。而频频爆发的乳品安全事件已经把乳品质量安全提到了一个空前的高度，在众多乳制品质量安全的相关检测项目中，微生物含量检测也备受关注。因此建立和完善乳品微生物检测技术和检测体系迫在眉睫。本文对目前具有良好发展空间的乳品微生物检测技术进行了综述，旨在为我国乳品微生物的快速鉴定及检测提供一些参考。

2 国内外乳品微生物检测项目

根据自身发展及安全需求，国内外对乳品中的微生物检测项目进行了规定。作为世界最大的乳品生产国之一的新西兰，乳品微生物的检测项目主要有：30℃需氧微生物、霉菌和酵母菌、大肠菌群、大肠埃希氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、沙门氏菌、凝固酶阳性葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、弯曲杆菌、产气夹膜梭菌和乳酸菌。我国乳品微生物检测项目主要有：计算平皿细菌总数、乳制品要求检测菌落总数、大肠菌群、致病菌、酵母和霉菌[1]。

3微生物学检测方法

改进微生物培养法

改进微生物培养法就是对传统微生物检测方法的改进。绝大多数企业和质检部门常用的微生物学检测方法有：标准平板计数法（SPC）和显微镜直接观

察法（DMC），但这2 种方法对有些细菌无法做出正确鉴定。这种传统方法主要是通过提高操作效率和细胞计数进行改进，从而达到快速检测的目的[2]，如皿膜系统、疏水网格滤膜法、螺旋板系统等。其中疏水网膜法（HGMF）是对常规平皿画线法的改进，可用于酵母菌、霉菌的计数，沙门氏菌、大肠杆菌（大肠菌群）的检测，被广泛应用于生乳、巴氏杀菌乳的质量管理中。

此外，为了克服人工计数的缓慢与疲劳，许多学者发明了全自动菌落计数系统，如英国Bibby SC5菌落计数器，Spiral Biotech公司的CASBATM，Celsis 公司的Scan500及Synopitics公司的全自动菌落计数器，均可快速、准确地计数。4分子生物学方法

PCR 技术

利用PCR 技术可以快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，尤其是那些人工无法培养的细菌。吕艳等人[3]利用PCR 技术对牛奶中的金黄色葡萄球菌进行了检测，最低检出限度35 ng/L；马冬等人[4]利用PCR 技术对乳品中的大肠杆菌进行了检测。如果将PCR 技术与其他技术相结合，如氧化酶法的结合，可以更快速准确的检测出乳制品中的病原微生物；李晓红等人[5]用免疫磁珠和复合PCR 联用，可以从样品中直接浓缩获取单增李斯特氏菌。目前发展起来的多重PCR 检测技术可以几种微生物同时进行检测，此方法已被用于对大肠杆菌、沙门氏菌和致病性弧菌等的同步检测[6]。Franket 等人[7]首次将多重PCR 方法用于检测产毒素性大肠杆菌基因。另外，利用此方法已经对乳酸菌、双歧杆菌进行了检测。PCR 技术具有灵敏度高、特异性强、抗污染能力强等特点，但是容易受到乳品成分的干扰，从而使PCR 反应的顺利进行受到了抑制，并且仅限于对那些核酸序列已知的微生物进行鉴定，不能区分活细胞和死细胞，同时其定量能力较差。

基因探针技术

基因探针微生物检测技术是在southern Blotting等生物技术基础上结合了PCR技术发展起来的。目前利用较多的是抗生物素蛋白系统标记的非放射性核酸探针，该探针已在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒检测中得到了广泛应用。[8]基因探针技术虽已被广泛应用，但是灵敏度不够高，一种探针只能检测一种菌，而且达到一定的检测量还要对样品进行一定时间的培养，使基因探针技术的应用受到一些限制。

基因芯片技术

基因芯片可以在几小时内对乳品中的微生物实行高通量和并行检测。操作

简便快速、特异性强、敏感性高。Ammor 等人[9]设计了包含7 大类抗生素抗性基因的300 个寡居核苷酸探针的基因芯片，对乳酸菌和双歧杆菌固有的和获得性的抗生素抗性进行了鉴定；然而基因芯片检测技术特异性有待提高，样品制备过程应进一步简化，而且仪器和耗材昂贵，且操作过程对工作人员要求较高[10]。相信随着社会的发展，此技术会为大众所接受。

5其他方法

免疫学检测方法

免疫检测的基本原理是抗原抗体反应。不同的微生物有其特异的抗原，并能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测微生物的特异抗原，也可利用微生物抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。运用于乳中致病菌的免疫学方法主要有免疫磁性分离技术、酶联免疫吸附技术（ELISA）、酶联荧光免疫吸附技术（VIDAS）等。各种免疫学方法的基本过程是相同的，先要进行病原菌的富集培养，再对富集物进行免疫检测和分析。前者需18～24h，甚更长时间，而免疫检测过程则仅需几小时，甚至几分钟。因此可以采用免疫磁珠分离方法或免疫膜富集技术等减少样品的富集时间。当然，免疫学方法也有许多需要改进的方面，主要包括交叉反应、假阳性多、灵敏度偏低。在英国，免疫磁性分离技术主要应用于牛奶中大肠杆菌O157:H7【11】的监测。而Tsai等[12]用ELISA对奶酪和酸牛奶中的杂色曲霉、多主枝孢、白地霉、卷枝毛霉和产黄青霉进行了检测。

ATP生物荧光技术

ATP生物荧光技术的原理[13]是ATP分子能量通过荧光酶复合物的作用转变为光，荧光强度与ATP浓度在一定范围内呈线性相关，而ATP在生物活细胞内的含量大致恒定，以此可推测被检样品中微生物数量。ATP生物荧光技术检测乳制品中的细菌总数及特异性病原菌具有简便、快速、灵敏等特点，在原料奶的验收、乳制品货架期预测及抗生素、细菌、噬菌体残留的检出等方面应用前景广阔。Samkutty等利用线性回归方程和ATP值预测了原料乳中的菌落总数[14]。在卫生监测中，ATP生物荧光技术5 min即可检出结果，其数据与平板计数法的结果相关性大于80%。

液相芯片技术

液相芯片技术（MASA）是一种全新微量分析技术。其原理是将流式细胞术与荧光标记检测相结合，把针对不同目标分子的探针与不同荧光值的微球共价偶联，然后使其与目标分子在悬液中特异性结合，通过荧光信号特异性检测到

目标分子。其特点是高灵敏性、高准确度、重现性好、高通量多指标同步分析，对单孔内多达100种不同的反应同时进行检测。其缺点是检测成本昂贵，达不到低成本检测的目的。陈昱[15]等人运用建立的液相芯片检测体系对牛奶中志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌0157进行了检测。液相芯片技术检测致病细菌，综合了PCR和核酸杂交的优点，无需培养直接分析，在微生物定性检测以及基因分型等方面独具优势。

6 乳品中微生物检测的发展方向

综上所述，乳中微生物的检测方法多种多样，各有优缺点，可以采用多种方法联合使用的策略来提高检测灵敏度和检测效率。但是，乳品从源头到消费者饮用经历原料验收、运输、生产、包装、销售等环节，任何环节都存在污染的风险，确保全程实时检测是乳品微生物检测接下来的发展方向。

在线检测

目前，在线检测成为乳品中致病菌检测的发展趋势。在国外，超声波技术、生物传感器【16】和高效毛细管电泳分析技术已被应用于乳品检测及在线检测，这些方法具有测量快速、操作简单和信号可控性等实时检测特点。【17】黄曲霉毒素的去毒及在线检测技术是一项牛奶加工的关键技术，具有巨大的市场潜力和重大的社会效益，特别是牛奶中AFT的去除技术是国际上牛奶加工尚未完全攻克的技术。该技术产品具有国际竞争力。采用先进的生物工程技术利用生物酶研制AFT反应器、生物传感器和“自生”式免疫亲和柱等系列产品，用于AFT的去毒和分析检测。“自生”式免疫亲和柱是国际上牛奶加工需要的关键技术。中国乳品致病菌的在线检测技术与设备仍处在初级阶段，多数企业还在采用传统的检测方法。在线新技术的研发和应用将是我国乳品中致病菌检测方法的未来发展趋势。随着科学技术和各个学科的交叉发展，在线检测最终将彻底改变乳中致病菌检测的现状和传统的观念，实现高效、优质、廉价的统一。

现场检测

随着社会的发展和人们生活水平的提高，食品检测现场化、家庭化的呼声越来越高。相应地，对食品检测仪器的小型化、智能化、集成化、便携式的要求也越来越迫切。这些仪器的研制和生产，是今后乳品中微生物检测技术的另一发展趋势。当前，学者们提出的构建生物芯片及缩微芯片理念，将进一步面向现场和速测方面。

缩微芯片实验是在一个芯片上包含了分析所具备的一切重要部分：样品处理、反应试剂、检测器等。一些所谓芯片实验室的技术已经市场化，如基因芯片。芯片技术将越来越多地进入乳品类食品病原菌检测技术领域，实现检测系

统的集成化、一体化。我国国家生物芯片中心等单位已开发并生产食源性致病菌检测、食源性病毒检测和兽药残留检测的生物芯片技术平台（仪器和试剂盒），未来的检测仪器与计算机紧密结合，自动采集数据、处理数据，更科学、更准确地提供结果，实现采样、进样、结果一条龙，形成检测的自动化系统。

将纳米技术与生物传感器技术相结合，检测乳品中致病菌的方法在国外已有相关报道，而我国还未涉及。纳米结构通常是指尺寸在100 nm以下的微小结构。像一个单一细胞膜一样的纳米传感器将具有其他传感器无法比拟的灵敏度和快速的响应时间。生物传感器的纳米化，可使人们在市场上直接检测食品成为可能。[18]近年来发展迅速的电子鼻和电子舌等仿生技术和传感器技术[19、20]，能够快速反应出被测样品的整体特征信息，在乳制品品质及货架期监控等方面的应用研究异常活跃。目前，电子鼻在微生物方面的检测针对不同的腐败菌种类及其生长规律进行研究。针对高危险致病性微生物的检测还有待于研究。

低成本检测

现代检测技术存在共性的问题：检测成本高。昂贵的检测仪器及试剂并不符合我国检测行业的标准，也不符合我国国情，尤其是对基层食品检测工作。我国农村人口高达9亿，农村市场是乳品消费的一大主力。所以，农村市场的乳品检测监测势在必行。而昂贵的检测成本对于基层食品检测负担太大，阻碍检测工作的进行。而且，检测技术的不断进步，必然要求不断降低产品成本，提高灵敏度、稳定性和延长寿命。这些特性的改善也会加速检测仪器现场化、商品化的进程。

7 结论与展望

乳品微生物检测技术对乳制品的质量安全、营养健康及疾病预防具有重要作用。上述乳品微生物检测方法多种多样，方法各有优缺点，可以采用多种方法联合使用，从而提高检测的效率和灵敏度。目前，超声波技术、生物传感器和高效毛细管电泳分析技术已被应用于乳品检测及在线检测，在线检测具有测量快速、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。因此，实行全程实时监控是未来微生物检测的发展方向，在线技术的研发和应用是我国未来乳品微生物检测技术的发展方向[21]。

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