PCR 技术综述

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PCR技术综述

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。能通过体外（试管内）扩增将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。目前，这项已广泛应用于分子生物学的各个领域，在医学检验中也显示广阔的应用前景。PCR技术的展简史

1953年沃森（Watson）与克里克（Crick）提出的DNA结构模型。

1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制。

1971年Korana最早提出核酸体外扩增的设想：经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。

1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow片段。但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。

1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶等特点。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA Polymerase。此酶的发现使PCR得以广泛应用。

20世纪90年代中期，随着多种自动化PCR扩增仪的问世，PCR 技术迅速普及，其应用范围也越来越广泛。近年来，PCR技术从原来的定性检测迅速发展到实时定量检测，它克服了传统PCR的许多不足，在分子诊断及其他相关领域发挥着重要作用。

PCR技术的基本原理

PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法,反应原理与细胞内的DNA 半保留复制相似,但PCR的反应体系要简单的多,主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3 ’末端互补的合成引物、四种dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。基本过程是以待扩增的DNA片段为模板,首先高温变性,将混合物加热到94℃维持15到30秒,使模板DNA双链解旋成两条单链；然后逐渐降温退火,温度降到55℃,使引物与模板DNA单链碱基互补配对结合；最后在引物、四种dNTP、DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。理论上每次循环结束后靶DNA扩增一倍，即靶DNA数目以

2n几何数放大。如此循环数小时就能将原始DNA扩增至数十万乃至百万倍。

PCR反应体系

PCR反应体系主要包含五种成分：模板、引物、DNA聚合酶、dNTP及PCR缓冲液（含Mg2+）。

模板：就是需要扩增序列的核苷酸,来源很广,几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。

引物：是与靶DNA的3 ’端和5 ’端特异性结合的核苷酸片段, 是决定PCR特异性的关键。

DNA聚合酶：耐热DNA聚合酶的发现,实现了PCR的自动化,能经受95℃以上的高温而不失活。

dNTP：四种三磷酸脱氧核苷酸(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)是PCR反应的原料。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率密切相关。一般商品

化供应的dNTP溶液pH为7.0,各dNTP的浓度2.5mmol/L,一般使用浓度控制在50～200umol/L。四种各dNTP分子浓度必须相等,以减少错配。

PCR缓冲液（含Mg2+）：最常用的缓冲液是10～50mmol/L的Tris-HCl（pH8.3）。Tris-HCl主要用于调节pH使反应体系偏碱以发挥Taq DNA聚合酶活性。Mg2+离子能活化DNA聚合酶，不同的PCR 需要不同的Mg2+浓度，有些PCR缓冲液中不含Mg2+，需在反应体系中另加适量的Mg2+，并调节Mg2+浓度。

一般的PCR反应体系和反应条件：

反应体系：（50ul）反应条件

10*Buffer 2 ul 940C 5min

Mg2+ 1.5 ul 940C 5min

dNTP 2 ul 940C 45s

cDNA 10 ul 560C 30s

Taq 0.2 ul 720C 30s

primer 2 ul 720C 5min

ddH2O 至50 ul 40C 保存

PCR扩增产物的检测

PCR反应进行完了之后,必须对其产物进行检测才能判定此反应产物是否为特异性扩增,结果是否准确可靠。目前发展了很多PCR产物检测方法,常用的方法有:1·凝胶电泳分析法：将产物进行电泳,常用溴乙锭染色, 根据在紫外光下发出的荧光确定片段在凝胶中的位置, 并以此来判断扩增片段的大小。2·Southern印迹杂交法：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链（内部寡核苷酸）标记后做探针,与PCR 产物杂交。3·斑点杂交法：待测的DNA变性后点加在硝酸纤维素膜或尼龙膜上观察有无着色斑点，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。4·核酸序列分析法, 对PCR产物直接进行测序,是PCR产物分析最

精确的方法,但也是最为繁琐的方法。

几种常用PCR衍生技术

巢式PCR（nested PCR）：由两轮PCR扩增和利用两对引物组成,其中第二对引物是在第一对引物的内部, 第一轮PCR的产物作为

第二轮PCR的模板,增强了产物的特异性。此反应大多应用在当模板DNA较少时,用一次PCR难以得到满意的结果而用巢式PCR能得到很好

的效果。

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：主要包括两个步骤,一个是反转录,另一个就是PCR,首先提取RNA并纯化,以其中的mRNA作为模板,

采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA第一链。然后以第一链cDNA为模板进行PCR扩增, 而获得目的基因或检测基因表达。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

此外还有多种PCR衍生技术,如多重PCR(multiplex PCR) 、重组PCR(recombinant PCR) 、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）等，可根据研究目的不同作相应的选择。

总结

总之，在过去三、四十年末，很少有像PCR这样影响深远的技术。在人类迈入二十一世纪中，PCR技术得到了不断地完善，并在此基础上派生出了许多新的用途，而一些相关领域着应用PCR技术得到长足的发展，即将出现若干的突破，生物医学便是其中重要的一项。在未来的生物医学领域中，它也必定继续扮演着举足轻重的角色。