常见分子生物学实验
溶液稀释与配比
C1V1=C2V2：万能稀释公式，一般母液和终浓度比不为X:1用这个公式计算。X/1：当母液与终浓度比为X：1时用这个快速方法，此时方法为把母液分为1，剩下的用总比例减掉，如：X2（1:1），X6（1:5），X10（1:9）。
百分数和mol数转以1%盐浓度进行转换
换设是100克的此溶液，则有99克的水和1克的盐（NaCl），盐的物质的量为1/58.5=0.017mol，水体积为99mL=0.099L，所以物质的量浓度为
0.017/0.099=0.17mol/L，即摩尔浓度为0.17mol/L
1%=1g/100g (1/58.5)/0.099
CTAB法提取DNA
1.各成分作用
CTAB：溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
Tris-HCl (pH8.0)：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA：螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
NaCl：提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，在于液相中；
β-巯基乙醇：抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)：酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
2.操作步骤
打样
新鲜叶片，转速220r/min，1min，打样时管身全部冻着，而且放在打样机的时候保证盒子里面得有液氮，这样样品才能充分打碎，写字的朝向一致，以便认字
提取
1)称取0.1g(约3-4片)新鲜叶片，液氮中研磨成粉末，加入800ulCTAB缓冲
液轻轻摇匀，65°C水浴（烘箱）保温30min左右；
备注
用2ml管提取时，加完CTAB在本子上记录好每个样品的名字，防止后面
漏管和裂管时查找被抹掉的号，这样可以防止在侧壁写管的麻烦；
在等待的过程时，即可拿出1.5ml离心管加入异戊醇做好准备；写字的朝
向一致，以便认字
2)冷却（放冰箱）至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）盖上瓶盖，
温和摇动，使成乳状液。
备注
一定要冷却，不然的话，热涨后盖子盖不紧，
此处必须摇匀，不然会因为分层不明显，表面容易起一层油状层；
3)（按照管盖的的朝向，在加完异戊醇的管上写上对应样品名字，字迹要大，
以防相同的数字出现如81/18，以及即使掉了一些也还有一部分可以识别）
4)8000rpm 10min ,离心管中出现三层，小心吸取含有DNA的上清液
（400-500ul）到新的1.5ml离心管中。根据需要，上清液可用氯仿/异戊
醇重复抽提1-2次；
备注
吸上清液时，按照前面写好的顺序，打开盖，同时打开异丙醇的盖，可以检查哪些漏掉，一旦发现漏掉的，立马盖上盖子，吸完别的后平躺着吸这管吸上清时，枪头不要挨着最深处的上清液，挨着上面那个片层处吸，能吸多少吸多少
5)在上清液中，加入0.7倍/等体积的异丙醇（400-500ul），颠倒混匀，放
-20入冰箱不少于20min；
备注：倒废液时，用空板一排一排倒
6)8000rpm 离心10min，弃上清；加600ul的70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几
分钟，8000rpm 离心5min，除去乙醇，即为DNA粗制品；
备注：倒扣在卫生纸上，可以干得更快，40min左右即可拿出，迅速加
水溶解，37摇床,67r，1h
3.注意事项
1)吸取上清液时一定要小心，必要时减掉枪头顶端；
2)在倒废液时，找一个管架，盖子打开后朝里侧将其尽量合拢，管口朝外，
扣住管架后，一起倒掉废液，这样可以避免液体毁掉管上的字；
3)在盖盖时，拇指按住盖，找准方向按下去；
碱煮法提DNA
试剂
0.1moL/L NaOH：4gNaOH，定容至1L
1×TE（10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0）组分
1 M Tris-HCl （pH 8.0）1 ml
0.5 M EDTA （pH 8.0）0.2 ml
超纯水至100 ml
1)1 M Tris-HCl (pH 8.0) 50 ml的配制：称取Tris碱6.06 g，加超纯水40 ml溶
解，滴加浓HCl约2 ml调pH至8.0，定容至50 ml。
2)0.5 M EDTA（pH 8.0）50 ml的配制：称取EDTA-Na2·2H2O,9.306 g，加超
纯水35 ml，剧烈搅拌，用约1.2g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50 ml。（EDTA 二钠盐需加入NaOH将pH调至接近8.0时，才会溶解。）
步骤
1.向装有样品的96孔PCR板中，每孔加100μＬ的0.1moL/L NaOH，盖紧配套
的硅胶盖，放入PCR仪中，99.9℃加热10min（此步也可在沸水中水浴）。2.冷却到室温后，快速离心，然后每孔加入100μＬ的1XTE（PH=2.0），盖紧
硅胶盖充分混匀并快速离心，上清液即可直接用做ＰＣＲ反应的模板。
RNA提取
1磨样
（1）编号（冻前写）
如果是在离心管上编号，最好在冷冻前写好，否则离心管冷冻后材料会受影响不说，也很难写上。
（2）磨样（冻钵，持低温，快，细）
一定要使材料处于低温状态。研磨前先将液氮倒入研钵，研钵彻底冷却后，再放入材料，研磨过程中，一定不要让液氮挥发净使材料回温！否则会RNA降解得很厉害。研得细和研得很细，提出的RNA量可以相差几倍！所以，在液氮
保护的很好的情况下多研磨几次，要比在后面的过程中离心以增加产量要划得来！
（3）装管（冻管，液装，晚盖）
材料一定要有液氮的保护才行。可以这样做：1、将几个离心管放入一个容器，向容器中加液氮，将其冷冻一下，使之处于低温状态，2、将液氮还未挥发干净的材料放入管内，不要急着盖盖子，因为液氮不挥发干净就盖上会再次弹开。将离心管放入盛有液氮的容器，等管内的液氮挥发干净盖上盖子即可。
PCR扩增
1.序列分析
1、首先将模板序列在NCBI上做BLAST分析，避开序列的保守位点。如下图
2、如果序列的片段过长，则分段设计引物进行扩增。因为片段过长会导致中间某些地方扩增不出来，从而导致整个序列扩增不出来。
3、二级结构的分析，有的材料扩不出来需要考虑是否存在2级结构，反向重复，高GC，Poly结构。这时需要分段设计引物进行扩增与测序。
2.PCR引物设计原则
引物设计位置（扩出来）
如果是做反向遗传学的话，引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同
一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。在做基因组扩增的时候，保证引物特异性的前提下，引物设计的位置最好是在外显子上，因为参考基因组所给的序列只是一个参考，
在CDS区域上物种与物种，物种内的都具有较高的保守性，在启动子区域不同的材料之间存在较多的多态性位点。为了保证引物的有效性，最好是在外显子上设计引物。
引物特异性（扩单一）
当引物与所扩片段的其他序列进行错误匹配时，可以导致杂带和目的条带扩增不出来。另外引物与基因组其他序列进行匹配上也可以导致此问题，这就需要引物设计完成以后，对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。因此在进行引物设计前一定要注意序列的分析。
引物GC含量
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应，GC含量在50%左右比较合适，而对于测序引物和杂交探针来说GC含量至少应为50%，另外上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature，寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度），相差不能太大，一般在3℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm 值，则有效引物的Tm范围为56-63℃（其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳？）。Tm过高：引物结合不上去，扩不带，太低引物特异性不好。
引物3′端
引物3′端不能选择A，最好选择T。引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率
介于A、T之间，所以3′端最好选择T。一条理想的引物应该有一个稳定性较强的5′末端和相对稳定性较弱的3′，末端如果引物3′稳定性强有可能在即使5′末端不配对的情况下造成错配形成非特异性扩增条带secondary bands 而3′末
端稳定性低的引物较好的原因是在引物发生错配时由于3 末端不太稳定引物结
合不稳定而难以延伸要避开密码子的第3位，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
引物的5′端
引物与目的位点的有效结合需要有稳定的5′末端，这一段有较强稳定性的
5′末端称为GC钳，它保证引物与模板的稳定结合。另外5′末端可以修饰，而3′端不可修饰。引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）引物互补性
Hairpin
单个引物因为有回文结构会形成十字形结构
Dimer
单个引物，引物之间可形成局部互补双链
5’-ATTTCTTACTGGAG-3’
3’-GAGGTCATTCTTTA-5’
False priming
引物与该条序列上其他位置（或者基因组其他位置）进行错配结合，可以通过序列分析之后进行规避
Cross Dimer
两条引物之间互配，形成局部双链
引物自身不能有连续4个或者分布有较多的互补碱基，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。一般有两种△G：一个是指3'端△G，绝对值不能超过9。一个指发卡结构和二聚体△G：绝对值不能超过4.5。引物5端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对
较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高，容易在错配位点。若错配的地方自由能较大，则在冰上操作可以减少引物自身结合。
碱基分布
要随机，引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
引物长度
适宜引物长度为18-24个碱基，等于或少于15碱基的短引物有时用于简单的基因作图或特殊的文库构建library protocol；28到35碱基的长引物对于从一系列高度相关的分子中扩增序列和特殊样本的克隆能起到重要作用，长PCR引物能给扩增带来更好的特异性长引物也允许您通过降低退火温度来能提高反应的灵敏度，不过长引物通常更易于形成包括发卡结构、二聚体自身互补等二级结构。理论上在合适的融链温度范围内最短的引物能在特异性和高效性间获得较好的平衡。
扩增产物的单链
不能形成二级结构，某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.特殊序列的扩增
1.扩增有无问题
模板高GC含量
所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性;
反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
模板poly结构
产物高级结构
引物/引物之间二聚体
1、重新设计引物
2、PCR仪上95度变性5min也同样达到目的，而且成功试过通过延长
退火时间也可以消除引物二聚体。
引物发夹结构
3、重新设计引物
扩增困困难问题
1、参考的基因组与目标材料基因组差异大（插入缺失、Mu插入）
2、该模板片段本身有高级结构（高GC）
2.扩增杂带问题
模板不纯
引物不特异
模板不特异
如果说非得在某些区域设计引物，但是又无法避免潜在其他序列的扩增。那么可以根据其他产物的大小，严格控制延伸时间。引物退火温度来尽量避免杂带的扩增。
4.引物的稀释和使用
1. Oligo DNA是以OD260单位来计算的，这是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260的Oligo溶液定义为1 OD260单位，根据此定义，1 OD260单位相当于33μg的Oligo DNA,您可以根据此数据和您的Oligo DNA分子量，计算得到摩尔数以计算不同摩尔浓度的溶液。
2. 引物序列的分子量计算公式如下：MW=（A碱基数×312）+（C碱基数×288）+（G碱基数×328）+（T碱基数×303）-61例如：引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6MW=（1×312）+（3×328）+（6×303）-61=6541
3. Oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算：Oligo DNA
中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。例：您得到一管标为5 OD260的20 mer Oligo DNA分子量=20×324.5=6490质量数=5×33=165μg摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol若加灭菌双蒸水400μl溶解，则浓度为25nmol/400μl=62.5μM4. 装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃，临用前稀释。
3. 由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。
4. 在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水，盖上管盖，充分上下振荡5-10分钟，再次离心10,000rpm,1min.
7. 计算原引物管primer的浓度（必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确）。
8. 计算并将应用primer稀释为10pmol/μl。
9. 标明原引物管、应用引物管、稀释方法，置-20℃保存。
5.体系配制
典型体系：10X buffer（含Mg2+），5ul；2.5mM dNTP，2ul；10uM primer1, 1ul；10uM primer2, 1ul；模板，2ul；Taq，0.5ul；ddH2O，38.5ul
6.扩增参数（温度、时间和循环次数）
典型程序：94℃,5min; (94℃，30s；55℃，30s；72℃，1min) x30；72℃，5min。
预变性：（95℃，5min；一般3-5min）
在标准反应中，将模板DNA加热至90～95℃，使双链DNA变性，再快速冷却至40～60℃使引物退火并结合到互补靶序列上，然后升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。每一步的时间从反应达到要求的温度后计算。
变性：（95℃，30s）
双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA；变性温度根据GC 含量，变性时间根据片段长度，变性温度过高或变性时间过长都会导致DNA聚合酶活性的下降，从而影响PCR的产量。但若变性温度过低会导致DNA模板变性不完全，则引物无法与模板结合，亦会导致PCR反应的失败。对于富含G、C
的模板应适当提高变性温度。
复性/退火：（55℃，1min）
系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；引物与模板的退火温度由引物的长度及GC含量决定，Tm值：Tm=4（G+C）+2(A+T)，两条引物的Tm值最好相同，相差不要超过3℃，Tm值比退火温度高5-15℃，一般用引物Tm 值低5℃左右，如果引物过长，Tm值过高时，选用较高的退火温度（如55℃，60℃等）即可，提高退火温度可减少引物与模板之间的费特异性结合，提高PCR 反应的特异性；降低退火温度则可提高扩增产量。退火时间一般为20～40秒。退火温度过低导致非特异型条带出来，退火温度过高引物结合效率降低或者结合不到模板上去，导致扩增不出条带。
延伸：（72℃，45s）
延伸时间由酶活性与扩增片段的长度决定，扩增小于500bp的DNA片段的延伸时间为20s，扩增500～1200bp的DNA片段的延伸时间为40s，扩增片段大于1kb，则需增加延伸时间（Taq聚合酶的聚合速率约为1000～2000bp/min）。当扩展片段小于150bp时，则可省略延伸步骤，因为退火温度下，TaqDNA聚合酶的或许已足以完成短序列的合成。
最后延伸：（72℃，维持5-15min）
保存：4℃
循环数：一般25-35 cycle
Q-PCR
产物长度要在300以内
还保证要目的基因跟内参的长度退火温度等比较一致
琼脂糖凝胶电泳
原理：DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。
1)TAE缓冲液的配制
50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。高温高压灭菌，室温保存。
1×TAE缓冲液的配制：称量20 ml的50×TAE缓冲液，再加入980 ml的去离子水。
2)Loading buffer（上样缓冲液）
分子生物学中6X ，10X是指的是现在的母液浓度，所有溶液使用的时候，浓度都是1X。所以，6X代表要稀释6倍才能使用；10X代表要稀释10倍才能使用……。所谓的稀释就是，样品/loading buffer的体积比为5/1（2:10）。举个例子，取样品10ul，加2ul的loading buffer混匀后就可以点样了。需要注意的是，由于点样孔容量有限，所以如果你样品浓度过高可以用低倍数，样品浓度低就用高倍数，以便load 更多的样品！
6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。
loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。
6X和10X的loading buffer的主要区别：6Xloading buffer是用来上样的；
10Xloading buffer是stop buffer，是停止酶促反应的，如果一定要用10Xloading buffer的上样当然也可以，唯一要注意的是：10Xloading buffer中多了一样SDS，它会使酶类如taq酶变性，以PCR产物为例，在电泳泳道上会产生一片弥散，如果电泳跑的距离短，和多出来一条带没有什么区别（大概1000bp左右,图一）。
图一图二
在目的条带的后方有一排隐约的条带，这就是10Xloading buffer所造成的(图
二)
3)6×上样缓冲液
0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml
溴酚蓝25 mg
二甲苯青FF 25 mg
甘油 3 ml
用6×TAE缓冲液定溶至10 ml，分装成1 ml/管。-20℃保存。
4)操作步骤
1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用100ml,小胶用50ml):称取1 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入100ml(50ml)1×TAE,微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化,摇匀,即成
1.0%琼脂糖凝胶液.
2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子，将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE 电泳缓冲液至没过胶板为止。
3. 点样：进行点样时，样品板往上倾斜，前部朝脸部分，以便查看样品的点样情况，食指指住点样的孔，点完后再进行换孔，以防止点错样。当样品注入
进去时，枪头不要注入到底，留一些样以防推出孔中的样，拿出枪头到洗样处，将枪头打到底以便洗样。
DNA电泳
1)指示剂
核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青。溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，它
在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA 大致相似。
指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用有：
①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内。
②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置。
③使样品呈色，使加样操作更方便。
2)染色剂
核酸电泳后，需经染色后才能显现出带型，最常用的是溴化乙锭染色法，SYBR Green，其次是银染色。
1 溴化乙锭染色：溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min。琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，
其DNA量一般>5ng，当溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，
可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。
2 银染：银染液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收。
3 SYBR Green（sybr gold、gene finder等）：发光强度非常好，灵敏度也很高。
SYBR Green I
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
SYBR Green I 适合于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳，和毛细管电泳等。
SYBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。另外，SYBR Green I 与EB相比，诱变能力大大降低。为获得最佳的结果，凝胶最好在跑胶后再进行染色。SYBR GreenI 核酸凝胶染液用于低含量的PCR 产物，凋亡研究及异源双链分析中少量DNA的检测较为理想。可应用于：DNA 和RNA的检测；SSCP及异源双链分析。
电泳用SYBR Green I 使用方法
1. 该方法适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳
2. 工作液的配制：用电泳缓冲液将10000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一个月以上。
3. 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。
4. 样品染色：向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和载样缓冲液，室温放置10分钟，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。
5. DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5分钟，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。
6. 上样、电泳：按常规操作。
SYBR Green I使用注意事项
1. 在"SYBR GreenⅠ预染色方法"中，电泳时间不要超过2小时，否则SYBR GreenⅠ会从DNA上分离出来，会产生弥散状条带。
2. 在常规用酒精沉淀核酸的过程中，SYBR Green I 可以全部从双链核酸上去掉。
3. 如果想对用SYBR Green I 染过的胶进行Southern blots，建议在预杂化和杂化溶液中加入0.1%- 0.3% 的SDS。
4. 在紫外照射透视下，与双链DNA 接合的SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链DNA 则颜色为橘黄而不是绿色。
5. SYBR Green对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲合力。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器。
3)琼脂糖凝胶电泳体系
1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。
4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
4)琼脂糖加样时候注意事项
1、用移液抢加样品时，样品不易过多，多少看孔的大小。
2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。
3、向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去
琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5%1,000～30,000
0.7% 800～12,000
1.0% 500～10,000
1.2% 400～7,000
1.5% 200～3,000
2.0% 50～2,000
5)琼脂糖凝胶电泳常见问题
6)电泳出现拖尾现象（smear，就是弥散）。
拖尾都是在电泳条带的前面
1 样品降解或是破碎
2 存在RNA
拖尾都是在电泳条带的后面
1样品浓度过高。这种情况稀释一下就行了。提质粒的时候常出现这种情况。
2蛋白杂质阻碍DNA的泳动。提基因组DNA时常出现这种情况。
PCR产物电泳拖尾，主要从以下两个方面考虑：
1、PCR产物自身原因：
往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多（这个一般是多条带）。
对策：
①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。
②减少dNTP的浓度。
③适当降低Mg2+浓度。
④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
2、电泳体系的问题：
（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。
（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。
（3）电压太高。
（4）适当把你的胶的浓度加大。（根据你的片断大小而定）
（5）观察你的marker是否也存在拖尾现象，作为对照。
RNA电泳检查
RNA电泳基本情况
总RNA中80％－85％是核糖体RNA（rRNA），真核生物中有5.8S、18S、28S 和5S四种rRNA，前三种rRNA为主体rRNA；原核生物有5S、16S、23S三种rRNA，剩余的15％－20％的为不同的相对低分子质量的RNA组成（如tRNA和小核RNA），mRNA占总RNA的1％－5％。
提的总RNA一般只能看见rRNA，真核生物中就是说能看到的几条带了，和mRNA的情况无关。植物的RNA有三条带，第一条为5S，第二条为18S，第三条为28S,一般情况下第一条5S很弱，几乎看不见，第二和第三条比较明显，理论
上没有降解的情况下28s应为18S的两倍亮度，而且没有弥散（因为28S、18S
和5S是由一个转录本剪接的，在细胞内分子数相等。分子的nt数之比等于电泳时亮度之比。28S≈3500nt，18S=1869nt，5S≈120nt 。28S:18S≈2:1 18S:5S≈15:1）。mRNA由于丰度和大小不一等关系，电泳时看不到带的。但是可以根据rRNA的
完整性判断所提RNA的质量。如果rRNA都有降解，mRNA的质量也就不行。
5sRNA:120bp；18 sRNA:1900bp；28sRNA: 4800bp。
在实际电泳中，往往由于上样量过大，导致18S区域亮度增强，甚至数倍于28S，这是因为样品过多，局部核酸染料不足以饱和整个RNA分子，所以28S亮度下降；而18S区域由于和16S等分子位置接近而显得亮度特别的大。这种情况
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现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验复习题附答案(最新整理)
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
现代分子生物学课后答案(朱玉贤_第三版)上
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
现代分子生物学总结题库
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部