3.霉菌、放线菌的形态观察-4学时

实验三霉菌、放线菌的形态观察

一、实验目的

1. 学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法。

2. 初步了解放线菌和四类常见霉菌的基本形态特征。

二、实验原理

1. 霉菌（真核微生物）：

霉菌是一类可产生菌丝体的真核微生物的统称。霉菌的菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，菌落与培养基间连接紧密，不易挑取，菌落正反面，边缘与中心的颜色、构造通常不一致，有霉味。霉菌的菌丝体分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及包子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

菌丝的孢子较大，在低倍镜下即可清晰观察到有隔或无隔菌丝和孢子及巨大的孢子囊。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比放线菌粗的多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片特点是：（a）细胞不变形；(b)具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。霉菌的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态常作为分类的重要依据。

曲霉形态特征：表面灰绿色，菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔；气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。

根霉形态特征：匍匐菌丝弧形，无色，向四周蔓延。

放线菌形态特征：呈菌丝状生长，以孢子繁殖。显微镜下呈紫红色。

青霉形态特征：菌丝初期白色，颜色逐渐由白转变为绿或蓝，菌丝有隔膜。

气生菌丝特化成子实体，子实体类型为分生孢子头。

霉菌的培养和观察方法：

（1）载玻片培养观察法：无菌操作将培养基薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间有限的空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察，这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。

（2）玻璃纸培养观察法：与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似，这种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，也可获得良好的效果。

（3）直接制片观察法：用解剖针挑取少量培养物置于预先滴加乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片镜检。

2. 放线菌（原核微生物）

放线菌是由不同长短、纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝，简称基丝）和生长在培养基以上的气生菌丝（简称气丝）。有些气生菌丝分化成孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等，孢子常呈圆形、椭圆形或杆状。能否产生气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为放线菌分类鉴定的重要依据。

放线菌的菌落形态特征为：形成干燥、不透明、表面呈致密丝绒状，上有一层彩色“干粉”的菌落。菌落与培养基连接紧密，难以挑取，菌落正反面颜色不一致，在菌落边缘的琼脂平板上有变形的现象，有泥腥味。

放线菌在显微镜下一般气丝在上，基丝在下，气丝色暗，基丝较透明。有的放线菌只产生基丝而无气丝。放线菌的培养和观察方法：

（1）扦片法：在放线菌平板上扦上盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上。观察时用镊子拔出盖玻片，擦

去背面培养物，将有菌的一面朝上置于载玻片上，直接镜检。

宜用略暗光线观察，低倍镜—高倍镜；染色后观察效果更好。

（2）玻璃纸法：玻璃纸是一种透明的半透膜，将灭菌的玻璃纸覆盖在平板表面，接种放线菌，经培养，放线菌在玻璃纸上形成菌苔。观察时先在载玻片上滴一小滴水，取下玻璃纸，使菌面朝上，使玻璃纸平贴于载玻片上。

优点：可观察到放线菌自然生长状态下的特征和不同生长期的形态。

注意：整过程勿触动菌面培养物。

（3）印片法：将要观察的放线菌的菌落或菌苔直接印在载玻片上，经染色后观察。该方法主要用于观察孢子丝的形态，孢子的排列及其形状等，但形态特征可能有所改变。

用接种铲或解剖刀将平板上的菌苔连同培养基一起切下，菌面朝上。另取一载玻片，微热后，轻轻按压菌苔，固定，染色后镜检。

三、实验器材

1. 菌种放线菌划线平板28℃，3~5天后培养物；曲霉（Aspergillus sp.）、根霉(Rhizopus sp.)和青霉(Penicillium sp.)划线平板28℃，2~3天后培养物。

2. 仪器显微镜、培养皿、载玻片、牙签、擦镜纸、吸水纸、染色缸等。

3. 试剂乳酸石炭酸棉蓝染色液，石炭酸复红染液，生理盐水。

四、实验步骤

(一) 霉菌观察：

1. 霉菌自然生长状态下的观察：将培养3—4天的霉菌培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察菌丝，分生孢子梗和分生孢子。

2. 直接制片染色观察：于洁净载玻片上，加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用牙签从霉菌菌落的边缘外（培养基平面下方一点儿）取少量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。

注：挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察。

可先将挑取的菌丝置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，然后置于染液中。

(二) 放线菌观察：

1. 放线菌自然生长状态下的观察

将培养3—4天的放线菌培养皿打开，放在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察菌丝，孢子丝和孢子。

2. 印片法染色观察

（1）用接种铲或解剖刀（或牙签）将平板上的菌苔连同培养基切下一小块，菌面朝上放在载玻片中央。

（2）用另一洁净载玻片置火焰上微热后，盖在菌苔上，轻轻垂直按压，将其压碎，使培养物（气丝、孢丝或孢子）粘附在后一块载玻片中央，弃去培养基，制成涂片，将有印迹的一面朝上，通过火焰2～3次固定。

注：不能压碎培养基，也不能将孢子或菌丝压入培养基。

（3）用石炭酸复红染液或吕氏碱性美蓝染液覆盖印迹，染色0.5~1分钟后水洗。

（4）干燥后，用油镜观察营养菌丝,孢子丝及孢子的形态。

五、实验结果

绘图说明所观察到的青霉和放线菌主要形态特征。

六思考题

1. 镜检时，如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？

2. 显微镜下，细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主要区别是什么？

补充材料：

1. 霉菌对人类生活和生产能产生哪些积极作用和消极作用？

答：霉菌分布极其广泛，只要存在有机物就有它们的踪迹。它们在自然界扮演者最重要的有机物分解者的角色，从而把其他生物难分解利用的数量巨大的复杂有机物如纤维素和木质素彻底分解转化，称为绿色植物可以重新利用的养料，促进了整个地球上生物圈的繁荣发展。

积极作用：（1）工业上的柠檬酸、葡萄糖酸、淀粉酶、蛋白酶等酶制剂，青霉素、头孢霉素等抗生素，核黄素等维生素，麦角碱等生物碱，真菌多糖、赤霉素等产物的发酵生产；利用Absidia(犁头霉)等对兹体化合物的生物转化以生产兹体激素类药物；以及利用霉菌在生物防治、污水处理和生物测定等方面的应用；

（2）在食品制造方面，如酱油的酿造和干酪的制造等（3）在基础理论研究方面，霉菌是良好的实验材料

消极作用：（1）大量真菌可引起工农业产品霉变（2）是植物最主要的病原菌，引起各种植物的传染性病害，如马铃薯晚疫病，稻瘟病和小麦锈病等（3）引起动物和人体传染病，如皮肤廯病症等；另有少部分霉菌可产生毒性很强的真菌毒素，如黄曲霉毒素。

2. 在自然界和实际应用中放线菌有什么作用？

答：实际应用：

（1）产生抗生素；

（2）近年来筛选到的许多新的生化药物多数是放线菌的次生代谢产物，包括抗癌剂、酶抑制剂、抗寄生虫剂和农药杀虫剂等；

（3）放线菌还是许多酶、维生素的产生菌；

自然界：放线菌在兹体转化、石油脱蜡和污水处理中也有重要作用。由于很多放线菌有极强的分解纤维素、石蜡、角蛋白、琼脂和橡胶等的能力，故它们在环境保护、提高土壤活力和自然界物质循环中起着重大作用。