实验4 VB脚本病毒.

实验4 VB脚本病毒.
实验4 VB脚本病毒.

XI`AN TECHNOLOGICAL UNIVERSITY 实验报告

实验目的

1.了解VB脚本病毒的工作原理

2.了解VB脚本病毒常见的感染目标和感染方式

3.掌握编写VB脚本病毒专杀工具的一般方法

实验原理

一.脚本病毒概述

脚本程序的执行环境需要WSH(WINDOWS SCRIPT HOST,WINDOWS脚本宿主)环境,WSH为宿主脚本创建环境。即当脚本到达计算机时,WSH充当主机的部分,它使对象和服务可用于脚本,并提供一系列脚本执行指南。

脚本病毒的主要特点:

(1)由于脚本是直接解释执行,可以直接通过自我复制的方式感染其它同类文件,并且使异常处理变得非常容易。

(2)脚本病毒通过HTML文档、EMAIL附件或其它方式,可以在很短的时间内传遍世界各地,通常是使用在邮件附件中安置病毒本体的方法,然后利用人们的好奇心,通过邮件主题或邮件内容诱骗人们点击附件中的病毒体而被感染。

(3)新型的邮件病毒邮件正文即为病毒,用户接收到带毒邮件后,即使不将邮件打开,只要将鼠标指向邮件,通过预览功能病毒也会被自动激活。

(4)病毒源码容易被获取,变种多。

(5)欺骗性强。

二.爱虫病毒分析

1.病毒简介

“爱虫”(VBS.LOVELETTER)病毒从2000年5月4日开始在欧洲大陆迅速传播,并向全世界蔓延。其传播原理是通过MICROSOFT OUTLOOK将名为“LOVE-LETTER-FOR-YOU.TXT.VBS”的邮件发送给用户地址薄里所有的地址。

当病毒运行后会在系统中留下以下文件:

(1)\WINDOWS\WIN32DLL.VBS;

(2)\SYSTEM\MSKERNEL.VBS;

(3)\SYSTEM\LOVE-LETTER_FOR_YOU.TXT.VBS。

2.病毒的杀毒步骤

(1)在WINDOWS下查看进程列表中是否有WSCRIPT这个文件,如有此文件说明已经感染。将该文件“结束任务”。

(2)进入C:\WINDOWS\SYSTEM中,运行MSCONFIG.EXE选择“启动”模板,将所有的后缀为“*.VBS”的文件选择为禁用状态。

(3)在保证内存中无WSCRIPT这个文件后,重启计算机。

(4)查找一个叫WIN-BUGFIX.EXE的文件并删除它,如果安装了MIRC则删除SCRIPT.INI文件,删除含LOVE-LETTER-FOR-YOU.TXT附件的EMAIL。

(5)打开注册表编辑器并删除下列键值:

3.病毒各模块功能介绍

爱虫病毒的结构化做得很好,各个模块功能非常独立,彼此并不相互依赖,流程也非常清楚,下面对每个函数过程的功能作一简单介绍。

(1)MAIN

爱虫病毒的主模块,它集成调用其它各个模块。

(2)REGRUNS

该模块主要用来修改注册表RUN下面的启动项指向病毒文件、修改下载目录,并负责随机从给定的4个网址中下载WIN-BUGFIX.EXE文件,并使启动项指向该文件。

(3)HTML

该模块主要用来生成LOVE-LETTER-FOR-YOU.HTM文件,该HTM文件执行后会执行里面的病毒代码,并在系统目录生成一个病毒副本MSKERNEL32.VBS文件。

(4)SPREADTOEMAIL

该模块主要用于将病毒文件作为附件发送给OUTLOOK地址薄中的所有用户,也是破坏性最大的一个模块。

(5)LISTADRIV

该模块主要用于搜索本地磁盘,并对磁盘文件进行感染。它调用了FOLDERLIST()函数,该函数主要用来遍历整个磁盘,对目标文件进行感染。

4.脚本病毒的预防和清除

脚本病毒的运行和传播有如下特点:

(1)VBS代码是通过WINDOWS SCRIPT HOST来解释执行的。

(2)VBS病毒的运行需要其关联程序WSCRIPT.EXE的支持。

(3)大部分VBS病毒运行的时候需要用到一个对象:FILESYSTEMOBJECT。

(4)通过网页传播的脚本病毒需要ACTIVEX的支持。

(5)通过EMAIL传播的病毒需要OE的自动发送邮件功能支持。

防范脚本病毒措施有:

(1)卸载WINDOWS SCRIPTING HOST

打开“控制面板”|“添加/删除程序”|“WINDOWS安装程序”|“附件”|取消“WINDOWS SCRIPTING HOST”一项。

(2)禁用文件系统对象FILESYSTEMOBJECT

用REGSVR32 SCRRUN.DLL /U这条命令就可以禁止文件系统对象。其中REGSVR32是WINDOWS\SYSTEM下的可执行文件。或者直接查找SCRRUN.DLL文件删除或者改名。

(3)在WINDOWS目录中,找到WSCRIPT.EXE,更改名称或者删除。

(4)设置浏览器。首先打开浏览器,单击菜单栏里“INTERNET选项”安全选项卡里的“自定义级别”按钮。把“ACTIVEX控件及插件”的一切设为禁用。

(5)禁止OE的自动收发邮件功能。

三.SVIR病毒专杀设计分析

1.SVIR.VBS脚本病毒特征

SVIR.VBS病毒具备爱虫病毒的部分功能,是以爱虫病毒为基础,减弱其破坏性,并将感染范围控制到一定的范围内的模拟病毒。使用记事本打开文件C:\EXPNIS\ANTIVIR-LAB\VIRUS\SCRIPTVIR\SVIR.VBS根据爱虫病毒原理和源代码中的相关注释了解它的工作原理和感染现象。

实验步骤

一.svir.vbs病毒专杀工具设计

1.观察svir.vbs病毒感染现象

(1)查看病毒要感染和修改的目标项。

进入实验平台,点击工具栏中的“实验目录”按钮,进入脚本病毒实验目录,

使用UltraEdit或记事本打开svir.vbs病毒文件查看其源码。

由病毒源码可知,病毒首先要复制自己的副本到指定目录,然后在注册表中添加启动项,再感染指定目录下的文件,最后显示发作信息。因此我们要查看这些相关项在病毒发作前的状态。根据病毒源码,查看如下项:

●系统目录下的病毒副本

在“C:\WINDOWS”目录及其子文件夹中搜索是否有文件“MSKernel32.vbs”。

●注册表中的开机启动项

注册表键HKEY_LOCAL_MACHINE\Software\Microsoft\Windows\CurrentVersion\Run 下是否有MSKernel32项。

●指定感染目录下的文件

查看目录C:\ExpNIS\AntiVir-Lab\Virus\ScriptVir\VBA\中的子目录及不同类型的文件是否都变成以“.vbs”结尾的脚本文件。

(2)双击“svir.vbs”运行病毒文件。

(3)重复查看病毒要感染和修改的目标项是否有被病毒感染的现象。

(4)重启计算机观察是否有病毒发作现象。

重起虚拟机仍有病毒发作现象

2.手工查杀病毒

(1)结束病毒进程。

(2)删除系统目录中的病毒副本。

在C:\WINDOWS目录及其子文件夹中搜索文件MSKernel32.vbs,并删除。

(3)修改注册表。

打开“注册表编辑器”找到注册表项HKEY_LOCAL_MACHINE\Software\Microsoft\

Windows\CurrentVersion\Run\MSKernel32,将其删除。

(4)恢复被感染的文件。

在病毒发作后,指定感染目录下病毒要感染项都生成以原文件名命名,以“vbs”为扩展名的病毒副本,原来的文件被修改了文件属性,成为了隐藏文件。

删除病毒文件

在病毒指定感染目录及其子目录中,删除所有被病毒感染后生成的以“.vbs”为扩展名的文件。

恢复文件属性

打开“资源管理器”,单击“工具”| “文件夹选项”| “查看”,选中“显示所有文件和文件夹”,单击“确定”后显示被隐藏起来的文件。

右键单击隐藏文件选择“属性”,在“常规”选项卡中取消对“隐藏”的选择,单击“确定”恢复文件属性。

3.设计脚本病毒专杀工具查杀病毒

(1)根据实验原理介绍的相关知识编程实现针对“SVIR.VBS”的专杀工具。要求专杀工具能够实现如下功能:

删除病毒在系统目录中创建的副本。

删除病毒在注册表中创建的开机启动项。

删除病毒在指定目录中感染的文件,并恢复被隐藏的原文件的属性。结束病毒发作时弹出的消息框进程。

(2)运行病毒文件“SVIR.VBS”。

(3)运行专杀工具对病毒“SVIR.VBS”进行查杀。

病毒学检验

《病毒学检验》课程教学大纲 一、课程基本信息 课程名称:病毒学检验(Experimental Virology) 课程编码: 课程类别: 必修课(专业课) 适用专业: 卫生检验学本科 开课学期: 第七学期 课程学时: 63学时(理论学时27,实验学时36) 课程学分:3.5 先修课程:医学寄生虫学及检验、细菌学检验、临床医学概要等 课程简介:病毒学检验是卫生检验重要的专业课程之一,是卫生检验课程体系的重要组成部分,也是卫生检验专业学生必修的考试课程。本课程通过课堂讲授、实验实习、网络自学等方式进行教学。注重培养学生综合性思维能力,重视学生自主学习、自觉学习,分析和解决实际问题能力,以及创新思维和能力的培养。 选用教材:李洪源、王志玉主编:《病毒学检验》,人民卫生出版社,第一版,2006年7月。 参考书: 1. 张朝武主编:《现代卫生检验》,第一版,人民卫生出版社,2005。 2. 李影林主编:《中华医学检验全书》,人民卫生出版社,1996。 3. 王秀茹主编:《预防医学微生物学及检验技术》,人民卫生出版社,2002。 4. 贾文祥主编:《医学微生物学》,四川大学出版社,2005年1月。 5. 李凡、刘星晶主编:《医学微生物学》,人民卫生出版社,第七版,2008年1月。 二、课程教育目标 通过学习,使学生知悉病毒学检验的基本技术和分子生物学技术,知悉 常见重要致病病毒。要求学生掌握病毒的分离培养方法、血清学实验及分子 生物学技术在病毒学检验中的应用;掌握常见重要致病病毒的生物学性状、 检验方法和预防医学意义。为学生能独立开展各种病毒学检验打下良好基 础。

三、理论教学内容与基本要求 绪论 (一)学时:0.5 (二)要求 【掌握】病毒的特性;病毒学检验的内容及其应用范围;病毒学检验的一般原则。 【熟悉】病毒学检验的质量控制;病毒学实验室的生物安全管理。 【了解】病毒学和病毒学检验的发展史。 第一篇病毒学检验技术 第一章细胞培养技术 (一)学时:1.5 (二)要求 【掌握】体外培养细胞的生物学特性;体外细胞培养的条件;组织培养的种类;细胞系和细胞株的概念;细胞培养方法;细胞培养中平衡盐、消化液和血清的作用;细胞检查方法;细胞的冻存。 【熟悉】用于病毒培养的细胞选择、细胞培养操作过程和细胞培养污染与监测。 【了解】细胞培养技术在病毒学研究中的发展;细胞系的鉴定。 第二章鸡胚接种技术 (一)学时:1.5 (二)要求 【掌握】鸡胚的结构;鸡胚的孵育与检查;接种途径与方法及其用途;病毒的检测;鸡胚接种技术的应用。 【熟悉】实验材料、器械与准备。 【了解】鸡胚的解剖与生理。 第三章动物实验技术 (一)学时:1.5 (二)要求 【掌握】实验动物的分类;普通动物、清洁动物、无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物;近交系动物、封闭群动物、突变系动物、杂交群动物及其特点;常用实验动物种类及其品系;

病毒学检验

病毒的特点是:1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构,其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸(RNA或DNA)4、因缺乏完整的酶系统和能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力,并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中,并能诱发潜伏感染 细胞培养技术:是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法,即模拟体内的生理环境条件,提供细胞适宜的营养条件和温度,在无菌操作的基础上,使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术 二、单层细胞培养: 用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞(二倍体细胞株和传代细胞系) 三、鸡胚的接种途径:1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种 四、 间接计数在病毒检验过程中较为常用,是判定病毒感染性的定量方法,常用的有:空斑形成单位法,50%终点法,血凝试验和干扰测定 空斑形成单位(PFUs)试验:是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合,当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时,会造成细胞被溶解而形成空斑,每个空斑系由一个病毒颗粒所造成,计算空斑数目再乘以稀释倍数,即可得知原来的病毒感染单位的浓度 凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。 50%终点法:是将病毒悬浮液经一系列稀释后,接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞,将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线,找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。 LD50:为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量 ID50:即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量 CCID50:造成50%细胞培养产生病变效应的剂量 五、病毒纯化的一般原则:1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩 六、病毒的保存:1、用低温(-60~25℃)、超低温(-70以下)冰箱或液氮罐(-196~150)保存 2、冷冻干燥保存 七、血清学实验的方法很多,最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 中和试验:是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物,使病毒与抗体相互反应,再将混合物接种到敏感的宿主体内,然后测定残存的病毒感染力的一种方法。 中和抗体:凡是能与病毒结合,并使其失去感染力的抗体称为中和抗体 中和试验必须在敏感的动物体内(包括鸡胚)和细胞培养中进行

常规病毒学实验技术

常规病毒学实验技术 (一)病毒的培养 实验动物:家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于: ①分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒,制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系,(用实验动物作中和试验和交叉保护实验) ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意:选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系,以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 (一)条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃,湿度40-70%,通风。新鲜受精卵:产下后不超过10天并保存10℃左右。 (二)优点 组织分化程度低,可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。 (三)接种途径 1.绒毛尿囊膜接种(10-12日龄鸡胚) 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1)方法一(造人工气室) ①在胚胎附近近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵壳,造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜,切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处,用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气,造成气室内负压, 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室,此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗中,周围涂上熔化的石蜡密封,气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中,不许翻动,保持卵窗向上。 2)方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2.尿囊腔接种(10-11日龄) 用于正粘病毒和副粘病毒(NDV)

第十四章 病毒学实验技术

第三篇病毒学实验技术 实验学时计划:实验一实验须知6小时;实验二细胞培养用水的制备及检验15小时;实验三组织培养技术20小时;实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时;实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1.凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2.实验室内,特别是组织培养操作室,须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后,均应用紫外线照射灭菌,必要时可用3~5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3.进入操作室,须先洗净双手并用消毒药水严格消毒;更换拖鞋,戴口罩和帽子,穿消毒的实验服。 4.病毒实验操作完毕后,将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物,出操作室前须更换;两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5.一个接种操作室,严禁同时进行两株病毒株的传种;吸取病毒材料时,勿于悬空吹出或打出。 6.凡沾病毒材料的吸管、试管等器具,须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内,浸泡过夜,或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7.凡带有感染性的鸡胚或动物尸体,须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒,或盛入容器内进行高压消毒后,方能携出室外进行处理。 8.工作人员要随时注意安全操作,以免发生事故;如发生意外,应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 (一)材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行,前者与各种传染的发病机理有关,后者常规在疾病早期,因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性,欲作病毒分离的材料,都应尽快的冷藏。-30℃保存的病毒材料(除少数例外),至少可以活存几个月以上;而-70℃保存的病毒,甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存,有的则需干燥环境(如Orf virus)。

病毒学实验

实验一病毒对细胞的感染 目的:病毒对细胞的感染具有高度的特异性,通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作,并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。 材料:杆状病毒Sf9细胞 器材:25或50mL细胞培养瓶,28℃恒温培养箱,培养基,无菌移液管,电动移液器 步骤: 1、感染前12h传代接种Sf9细胞,28℃培养至汇聚度约70%; 2、弃细胞培养液,并以1×PBS洗涤2-3次,吸干残夜; 3、加入适量病毒悬液,并补充适量无血清培养基,28℃孵育2h,更换适量新鲜培养基;同时设立空白对照; 4、28℃培养24-48h,对照观察细胞病变。 实验二病毒的扩增与收集 目的:病毒属于严格细胞内寄生生物,故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。材料:杆状病毒Sf9细胞 器材:25或50mL细胞培养瓶,28℃恒温培养箱,培养基,无菌移液管,电动移液器、低温高速离心机、离心管,滤器 步骤:

1、感染前12h传代接种Sf9细胞,28℃培养至汇聚度约70%; 2、弃细胞培养液,并以1×PBS洗涤2-3次,吸干残夜; 3、加入适量病毒悬液,并补充适量无血清培养基,28℃孵育2h,更换适量新鲜培养基; 4、28℃培养24-36h,观察细胞裂解情况; 5、吹吸细胞,并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管; 6、4℃,12000rpm,10min,取上清; 7、滤器过滤上清,取滤液,分装于无菌冻存管,避光保存于4℃或-20℃或-80℃. 实验三病毒的敏感性测定 目的:不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性,以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。 材料:杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿 器材:25或50mL细胞培养瓶,28℃恒温培养箱,培养基,无菌移液管,电动移液器,水浴锅 步骤: 1、氯仿预处理:于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿,混匀,4℃静置1h,2000rpm,10min,取上清备用;同样,取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用(空白对照); 2、乙醚预处理:于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚,

病毒学检验实验课教学大纲

实验项目一减毒活病毒鸡胚培养法及病毒滴度和抗体效价测定 【目的要求】 1.掌握病毒鸡胚培养的原理及技术。 2.掌握病毒滴度的测定方法及结果判定。 3.掌握抗体效价测定技术 【实验性质】综合性实验 【实验条件】 1.基本仪器设备:孵化器、恒温培养箱、低速离心机、超净工作台等 2.基本试剂药品:鸡胚、减毒活病毒液等 3.特殊环境要求: 【教学方法】以学生的实际操作为主、讲授为辅。 【教学内容】 1.教师讲授(示教): 2.5学时 (1)病毒鸡胚接种方法 (2)血凝试验。 (3)血凝抑制试验。 2.学生操作:7.5学时 (1)鸡胚接种 (2)血凝试验对尿囊液病毒滴度测定 (3)血凝抑制试验对免疫血清效价测定 3.实验报告:学生根据结果按要求填写实验报告。 (1)病毒鸡胚接种 (2)血凝试验及血凝抑制试验的原理及结果判定 实验项目二细胞培养法对病毒疫苗TCID 测定 50 【目的要求】 1.掌握细胞培养基本技术要领。 2.掌握病毒细胞接种技术 3.熟悉观察细胞病变判定病毒感染力TCID50 【实验性质】验证性实验 【实验条件】 1.基本仪器设备:CO2培养箱,倒置显微镜,高速离心机,低温冰箱等 2.基本试剂药品:待检病毒,细胞株等 3.特殊环境要求: 【教学方法】以学生的实际操作为主、讲授为辅。 【教学内容】 1.教师讲授(示教):3学时

(1)细胞培养技术。 (2)病毒细胞接种技术。 (3)病毒感染细胞病变。 2.学生操作:9学时 (1)原代细胞制备或传代细胞单层培养 (2)接种病毒疫苗 (3)观察细胞病变判定TCID50 3.实验报告:学生根据结果按要求填写实验报告。 (1)细胞培养病毒接种技术 (2)细胞病变 实验项目三临床标本中流感病毒的诊断 【目的要求】 1.熟练掌握鸡胚培养技术。 2.熟练掌握细胞培养技术 3. 熟悉RT-PCR、ELISA等常用实验室检测技术 【实验性质】综合性实验 【实验条件】 1.基本仪器设备:生物安全柜、孵化器、恒温培养箱、PCR仪等 2.基本试剂药品:细胞株、检测试剂盒等 3.特殊环境要求:生物安全柜 【教学方法】以学生的实际操作为主、讲授为辅。 【教学内容】 1.教师讲授(示教):4学时 (1)病毒常用培养技术。 (2)常用实验室检测技术(RT-PCR、ELISA等)。 (3)临床标本中流感病毒检测流程。 2.学生操作:10学时 检测待测标本流感病毒 3.实验报告:学生根据检测结果按要求填写实验报告。

病毒学检验实验指导

病毒学实验考试备考指导 编者:程家国(大理大学)指导教师:吴利先 鸡胚接种 原理 鸡胚为活的动物机体,组织分化程度低,病毒易于增殖,可选择不同的日龄和接种途径,感染病毒的组织和液体中含大量病毒。 鸡胚的结构与功能: 鸡胚由三个胚层发育而来,即外胚层,中胚层、内胚层,它们构成了胚胎的组织与器官 卵壳:上有细孔,进行气体交换 壳膜:使气体分子和液体分子在内外两方面进行交换。 气室:呼吸和调节压力 绒毛尿囊膜:起胚胎呼吸器官的功能,氧气的交换是在膜的血管内通过卵壳孔而进行的。 尿囊腔:胚胎的排泄器官,内含有尿囊液,初为透明液体,是单纯生理盐溶液,以后尿囊液中尿酸盐迅速增加,胚胎发育到第12-13天后,尿囊液开始变得混浊。 羊膜与羊膜腔:其中盛有羊水,胎体浸泡于其中 卵黄:在胚胎发育早期供给鸡胚营养 卵白:在胚胎发育晚期供给鸡胚营养 受精卵的选择:最好是来自SPF鸡群,以降低母源抗体的影响 受精卵的壳最好是白色的 受精卵必须新鲜,保存在5-20℃不要超过10天,保存一个月的受精卵,孵化率将近于零。 孵育:孵卵箱内的温度应保持在37.5-38.5℃ 相对湿度:50%-60% 必须保证有充分的新鲜空气流通,特别是在孵化5-6天以后 从孵育后第3天开始,每天翻卵一次。 检卵:自孵育后的第4天开始检卵,每天一次。 孵育4-5日于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。 未受精卵:只见模糊的卵黄阴影,不见血管和鸡胚痕迹 活胚:具有清晰的血管和鸡胚暗影,较大鸡胚还可见到胚动,但孵育14、15天以后胚动不明显,甚至无胚动。 死胚:血管昏暗模糊,没有胚动。 接种前处理:用检卵灯再次检查鸡胚活力,用铅笔画出气室和胚胎的位置,并在将要接种的部位做好记号。 对鸡胚进行消毒。

病毒学实验技术

病毒学实验技术 实验一鸡胚接种 器材:鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种(NDV、EDS—76、IBV→效价测定(HA、HI) 一.精卵的选择、孵育和检卵 1.受精卵的选择 1)最好来自SPF鸡群,以降低母源抗体的影响 2)最好是白克蛋 3)受精卵必须新鲜,保存在5—20℃不要超过10天,保存一个月的受精卵,孵化率将近于零。 2.孵育 1)孵箱温度保持37.5—38.5℃ 2)相对湿度:50-60% 3)保证新鲜空气流通,尤孵化5-6天后 4)孵育后第三天开始,每天翻卵一次 3.检卵 孵育后第4天开始,每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊,无胎动。 二.鸡胚的结构 1.卵壳上有细孔,以行气体交换 2.壳膜行气体和液体分子交换,故须一定湿度和气流 3.气室呼吸和调节压力 —卵壳孔交换 4.绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官,膜血管—O 2 5.尿囊腔胚胎排泄器官,尿囊液初为通明,12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。 6.羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水 7.卵黄早期养分 8.卵白晚期养分 三.接种前处理 1.做接种记号 2.消毒 四.接种途径 卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体 1.卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖 方法一:1)6-8日龄胚,画出气室和胚位,大头朝下 2)碘及酒精消毒气室端 3)钢锥在气室中央锥一小孔 4)注射器吸取病毒液,沿小孔垂直刺入3cm,0.1-0.3ml/胚 5)熔蜡封孔,续孵,弃24H内死胚 方法二:1)2)同一 3)卵横放,胚朝下,卵长1/2处消毒 4)钢锥锥一小孔,注射器吸取病毒液,沿小孔垂直刺入1.5CM,0.1-0.5ml/胚 5)封孔,续孵,弃24h内死胚 2.绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖 方法一:1)10-12日龄胚,画气室,消毒

常规病毒学实验技术

常规病毒学实验技术 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】

常规病毒学实验技术 (一)病毒的培养 实验动物:家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于: ①分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒,制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系,(用实验动物作中和试验和交叉保护实验) ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意:选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系,以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 (一)条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃,湿度40-70%,通风。新鲜受精卵:产下后不超过10天并保存10℃左右。 (二)优点 组织分化程度低,可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。 (三)接种途径 1.绒毛尿囊膜接种(10-12日龄鸡胚) 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1)方法一(造人工气室) ①在胚胎附近近气室处,选择血管较少的部位,用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm 的烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后,小心用刀尖撬起卵壳,造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜,切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处,用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气,造成气室内负 压,使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室,此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗,或用玻璃纸盖于卵窗中,周围涂上熔化的石蜡密封,气室中 央的小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中,不许翻动,保持卵窗向上。 2)方法二 ①在气室端的卵壳上开约×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。

病毒学实验(抗原抗体检测)细菌学实验的详细实验步揍

各实验具体步骤: 病毒学实验 1.抗体检测: 有血凝素(HA)的病毒能凝集人或动物红细胞,称为血凝现象,血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验,原理是相应抗体与病毒结合后,阻止病毒表面HA与红细胞结合,常用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等的辅助诊断、流行病调查,也可用于鉴定病毒型与亚型。疫血凝(HA)及血凝抑制(H1)试验 目的意义: 1.掌握血凝试验(HA)与血凝抑制试验(HAI)的基本方法; 2.了解HA与HI在新城疫病毒及其它病毒诊断和鉴定中的应用。 基本原理: 许多病毒表面具血凝素,具有凝集某些动物或人红细胞的特性,称为血凝现象,可用于鉴定病毒。 血凝现象可以被特异性抗体所抑制,称为血凝抑制现象,利用这种特性可进行血清学试验,称为血凝抑制试验。 器材及试剂: 待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液;待检血清:抗鸡新城疫病病毒阳性血清;生理盐水、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。 实验步骤:

(一)血凝试验(HA)取96孔板,按以下步骤操作: 1、第一排1-12孔各加生理盐水25ul,第二排1-12孔加生理盐水25ul为红细胞对照; 2、吸25ul病毒液于第一排第1孔,混匀后取25ul至第2孔,依次稀释至第12孔,弃去25ul, 3第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞25ul。 4、室温静置10-30分,观察结果 5、结果判定:红细胞对照组红细胞完全沉降,以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数,作为病毒的血凝价,即HI效价 (二)血凝抑制试验(HI)取一96孔板,按以下步骤操作: 1、4个单位抗原的制备:按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释 度。(根据学农实验配置4单位抗原,以完全血凝的病毒最高稀释倍数除以4即为含4单位抗原的稀释倍数。 2、待检血清的稀释:第一、二、三排1-12孔各加生理盐水25ul,于第一排第1孔中加入25ul待检血清,反复吹吸3-5次混匀后,取25ul至第2孔混匀,吸取25ul至第3孔,依次稀释至第12孔,弃去25ul,经倍比稀释 3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素25ul,微量震荡器震荡2min混匀; 4、室温静置20min;

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